水稻胚中的特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻胚中的特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子特別適合驅(qū)動(dòng)外源基因在水稻胚中特異性表達(dá)，而在水稻的其它組織中不表達(dá)。所述啟動(dòng)子的表達(dá)特異性和專一性很高。本發(fā)明還提供了具有所述啟動(dòng)子的構(gòu)建物、表達(dá)盒和載體等。含本發(fā)明啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因水稻可以特異性地改善水稻的農(nóng)藝性狀，有效避免外源基因?qū)雽λ酒渌M織的影響，還能在胚中特異性表達(dá)外源基因，從而獲得各種相關(guān)產(chǎn)物。
【專利說明】水稻胚中的特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及一種水稻胚中的特異性啟動(dòng)子 及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有一半人口以大米為主食，我國稻 谷年消耗量和產(chǎn)量占世界總量的三分之一。我國是人口大國，提高糧食產(chǎn)量一直是重大的 社會(huì)問題。可耕地面積的減少和人口的增加，加劇了對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的要求，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì) 日益成為水稻研究的重點(diǎn)問題。水稻的基因組相對較小，是禾本科作物功能基因組研究的 模式植物。
[0003] 胚是被子植物有性生殖過程中形成的，在植物發(fā)育中具有重要生物學(xué)意義。胚的 發(fā)育始于合子，經(jīng)過原胚和胚的分化發(fā)育階段，最后達(dá)到成熟。融合形成的二倍體合子，既 保持了物種遺傳的相對穩(wěn)定性，又為后代中可能出現(xiàn)新的遺傳性狀、新變異提供了基礎(chǔ)，為 研究植物遺傳和育種學(xué)的提供重要理論依據(jù)。
[0004] 基因通過表達(dá)來體現(xiàn)其功能，維持生物體的有序生長發(fā)育和各項(xiàng)活動(dòng)?；虻谋?達(dá)調(diào)控一直是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和中心課題之一，分為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后水平 的調(diào)控（mRNA的加工、成熟等），翻譯水平的調(diào)控等不同層面。啟動(dòng)子是精確啟動(dòng)基因表達(dá) 的"開關(guān)"，在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控過程中扮演著重要的角色，是基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控過程中， 影響基因表達(dá)水平的最直接和最有力的順式調(diào)控原件。借助基因工程的方法，利用組織特 異性的啟動(dòng)子，對特定基因進(jìn)行的表達(dá)研究進(jìn)行調(diào)控，或者對作物進(jìn)行針對性的育種改造， 都具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。因此，研究組織特異性啟動(dòng)子的功能序列，對于基因的表達(dá)調(diào) 控機(jī)制的研究，具有重要意義。但是，有些基因，例如非結(jié)構(gòu)基因會(huì)發(fā)生基因的移轉(zhuǎn)，從而很 難找到在特定組織中特異性表達(dá)的相應(yīng)啟動(dòng)子，再例如，有一些miRNA在組織中特異性存 在，但與結(jié)構(gòu)基因相比，由于miRNA太短、匹配區(qū)域太多，真正據(jù)此找到的具備組織特異性 的miRNA啟動(dòng)子寥寥無幾。
[0005] 綜上所述，本領(lǐng)域急需對水稻中的組織特異性啟動(dòng)子進(jìn)行研究，以便闡明水稻的 形態(tài)發(fā)育、代謝以及抗病抗逆等途徑，進(jìn)而準(zhǔn)確有效地改變水稻的各種性狀，改良水稻的品 系，更好地調(diào)控其生長發(fā)育以及產(chǎn)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種水稻的胚特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0007] 在第一方面，本發(fā)明提供一種啟動(dòng)子元件，所述啟動(dòng)子元件選自下組：
[0008] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所不的多核苷酸；
[0009] (b)核苷酸序列與SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95%(較佳地彡98%)，且具有 水稻胚中特異啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子活性的多核苷酸；
[0010] (C)如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60個(gè)（較佳地1-30， 更佳地1-6個(gè)）核苷酸，且具有水稻胚中特異啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子活性的多核苷酸。
[0011] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的水稻胚中特異啟動(dòng)功能表示所述啟動(dòng)子在水稻的胚 以外的組織中不具有啟動(dòng)功能。
[0012] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子元件的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 在第二方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與外源基因 可操作連接的本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件。
[0014] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的外源基因在天然狀態(tài)下并不存在。
[0015] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述外源基因包括：抗性基因、篩選標(biāo)記基因、抗原蛋 白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制劑基因、或植物品質(zhì)相關(guān)基因。
[0016] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的抗性基因選自下組：抗除草劑基因、抗病毒基 因、耐寒基因、耐高溫基因、抗旱基因、抗?jié)郴?、或抗蟲基因。
[0017] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的篩選標(biāo)記基因選自下組：gus(i3-葡萄糖苷酸 酶）基因、hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (綠色熒光蛋白）基因。
[0018] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的抗原蛋白基因選自下組：細(xì)菌類抗原蛋白（如 霍亂毒素 B，破傷風(fēng)毒素等）、病毒類抗原蛋白（如犬細(xì)小病毒）、原生動(dòng)物類抗原蛋白（如 阿米巴病原LecA)、或自身抗原蛋白（如I型糖尿病的CTB - pins抗原蛋白）。
[0019] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的生物制劑基因選自下組：a 2b干擾素基因、或 胰島素樣生長因子基因。
[0020] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的植物品質(zhì)相關(guān)基因選自下組：氣基酸改良相關(guān) 基因、脂肪改良相關(guān)基因、淀粉改良相關(guān)基因、或雄性不育相關(guān)基因。
[0021] 在第三方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下述元件： 本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件、基因 ORF序列和終止子。
[0022] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的表達(dá)盒還包括選自下組的一種或多種元件：poly (A) 元件、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)元件、或基因靶向元件。
[0023] 在第四方面，本發(fā)明提供一種載體，所述載體含有本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子 元件、或本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0024] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體選自：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或植物細(xì)胞病 毒載體、穿梭載體。
[0025] 在第五方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第四方面所述 的載體、或其染色體上整合有外源的本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件、或其染色體整合 有本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0026] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞的染色體具有一個(gè)或多個(gè)（如1-50個(gè)，較佳 地2-6個(gè)）拷貝的本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件、或本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0027] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的宿主細(xì)胞選自下組：原核細(xì)胞（如大腸桿菌、鏈 霉菌屬、或農(nóng)桿菌）、低等真核細(xì)胞（如酵母細(xì)胞）、或高等真核細(xì)胞（如植物細(xì)胞）。
[0028] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞，更佳地為農(nóng)作物、蔬菜、 或花卉的植物細(xì)胞。
[0029] 在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件，本發(fā)明第二方面所 述的構(gòu)建物，本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒的用途，用于特異性調(diào)控外源基因在水稻胚中 的表達(dá)。
[0030] 在第六方面，本發(fā)明提供一種在水稻胚中特異性表達(dá)外源基因的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0031] (a)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作連接的本 發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件；
[0032] (b)將步驟（a)得到的構(gòu)建物導(dǎo)入水稻細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞；
[0033] (C)將步驟（b)中轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞再生成水稻植株，從而使所述外源基因在水稻 胚中特異性表達(dá)。
[0034] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述外源基因在水稻除胚以外的其它組織中不表達(dá)或基本 不表達(dá)。
[0035] 在第八方面，本發(fā)明提供一種制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法，所述方法包括以下步驟：
[0036] (a)提供下述水稻細(xì)胞，所述水稻細(xì)胞含有本發(fā)明第四方面所述的載體、或其染 色體整合有本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子、或其染色體整合有本發(fā)明第三方面所述的表達(dá) 盒；
[0037] (b)將（a)的水稻細(xì)胞再生為水稻植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
[0038] 在第九方面，本發(fā)明提供一種水稻愈傷組織或水稻體細(xì)胞胚胎，所述水稻愈傷組 織或水稻體細(xì)胞胚胎包下述水稻細(xì)胞或由下述水稻細(xì)胞構(gòu)成：所述水稻細(xì)胞含有本發(fā)明第 四方面所述的載體、或其染色體整合有本發(fā)明第一方面所述的啟動(dòng)子元件、或其染色體整 合有本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0039] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖 1 顯示 了⑶S 表達(dá)載體（pBIlOL 1-P1-GUS、pBIlOL I-P2-GUS 和 pBIlOl. 1-P3-GUS)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株的⑶S染色結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從大量的水稻基因中出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在水 稻胚中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，從而在植物基因工程中使外源目的基因能在特定組織中高效 表達(dá)，以便實(shí)現(xiàn)對外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)、定量三維精確調(diào)控，對水稻的分子生物學(xué)研 究也具有啟不意義。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0042] 發(fā)明人在水稻基因組中克隆了 3個(gè)啟動(dòng)子序列，將它們構(gòu)建到啟動(dòng)GUS基因的表 達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化野生型水稻中花11 (ZH11，參見CN101928726B或CN101880671B)。通過 ⑶S染色，成功獲得水稻中胚特異性啟動(dòng)子-Pl (SEQ ID NO: 1):
[0043] gcggctcttggcattcctccgacgtgggtggtggtgaagaagagcttggcgccgccgccgccgccgccg ccgtagaagccgtcattgtcgaggacgccgacgcctggaagctttcgcgtgggggaggacatggggccgagggctgg agaggagggcaacgtcgaaggagtcttcctcggcagtccgctcctcccacgcccgcgtcgaggaaggcggcgagccg cagcagagcggcgggcagccatgccgggattggtttttcttttcttttttttttctgtgcgacggtggattgacgag cagtctcgttcgtttttgtccctccgcagttgctcgtaaatgggctgaatgggccatccttgccacgctcgtgcgat gcagaacgaaagaagcagcagcgccgtgaaatgccaatcggacgatggatcgacgcccgacgtcctatgacgttagc tgcccaacgtcagacgatctgcttccctaggtttttagctagggaacttttttttttcatctgatatgctttaagaa ctttaaacaaaaatcaaactctaccgatgaaagcgaccgcaaagtgcgaaggaggaagaagggcaagaaggggagga acccaataaggtgcgatatcaccatctctgccatctatgaagagctcgaggagatagaggtacagagggtgaggtgg agaaagcaggacccactgaccactatttttatcttcttgtttgattgacatgcggggcccacatatttttttttata tttttagttttcaattttgatgcttttatatattttttttgggggattgtactgtcacgtaggcatcatgtcaatgc catgtgggacgaatacctagtcataaggagtcacgtagacgcccatgagataaaaccggagataatacttccgaggg accttgtttacactattttttaagctaggaagggttgtatcatcatgtttttggttcaaggattaaaatcagactag gtgacaaaggggacctaaagtgaacttactgcgtatatttttccccttcattgaatctgctacttttgggggcccat tgaccagcctggcatttcgctcacttgggtcgtgtgtttcttctctgccggacaacttggtcacaaacattcatcaa aatattgtggctattatatttctcctcttttgagatacaaccataaaaagaaactaaacaattaaaattatttatga ctatcattaaactatcataaaaagaactccgaaattaacttaaaataggtttcaaattttatttttttttcctacag ccgataaaccactaagcagacggtaaaaaaactagtacttctacttaaggagagaataataagtaggactaacaacc acaaactggtaaaccggtagctacttcagactctctgccttttttagcattttaagatcccatccagactgcatcga atttacaatattctcttaaaatagctcaaaattccgtagaaattcgtctcgatgagatgtacgacatgtcctgttgc tgccgtacgtactactagtactaatctaagcggctgagcagcgccggtcgaagaaggaagagtgtttcagetcggcg agcatttgctgctgggtgtgtgcagtacgcatgttggagagggagttgtactaccaaaccttgggacaggtcagcat cgtgtactccagctttgctctccccttgtactgatggatgggcaaattggcaggctatgagatgtggtactagctag tactactgtactagcagtggaatggttcaaggcaaagacattgcgttgcgtgtgtatatatacatctcccatgtttc ttgaatcttgacgatgatggcgttggcctaaccggatttgcagtgcatcaggtaagggaaaaaggatggttagatag agagaaggggagttctgtgattggagaggagaggagacagggatgaggcagagcatgggatggggcta〇
[0044] 本文所用的術(shù)語"本發(fā)明啟動(dòng)子"、"水稻胚中特異表達(dá)的啟動(dòng)子"、"啟動(dòng)子PI"或 "P1"可互換使用，均表示源于水稻的啟動(dòng)子元件，其序列如SEQ ID NO. :1所示。
[0045] 本發(fā)明的啟動(dòng)子能夠高效、專一地在水稻胚中特異性表達(dá)，而在其它組織中不表 達(dá)。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以用于特異性改善水稻的性狀，避免外源基因?qū)λ镜钠渌M 織產(chǎn)生影響。
[0046] 本文所用的術(shù)語"啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)子區(qū)（域）"是指一種準(zhǔn)確有效起始基因轉(zhuǎn)錄 功能的核酸序列，引導(dǎo)基因核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，其通常存在于目的基因編碼序列的上游 (5'端），一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)域提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子 的識別位點(diǎn)。
[0047] 在本文中，所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)（域）包括啟動(dòng)子的變體,啟動(dòng)子變體可以通過 插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。
[0048] 鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，盡管本發(fā)明的實(shí)施 例中提供的啟動(dòng)子Pl的序列如SEQ ID NO: 1所示，但本發(fā)明還應(yīng)包括與本發(fā)明的啟動(dòng)子序 列（SEQ ID NO: 1)具有50%或以上（優(yōu)選60%以上，70%以上，80%以上，更優(yōu)選90%以上， 更優(yōu)選95%以上，最優(yōu)選98%以上，如99%)同源性的核酸，只要所述核酸也具有在水稻胚中 特異性表達(dá)的功能。"同源性"是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水 平（即序列相似性或同一性）。
[0049] 本文所用的術(shù)語"特異性表達(dá)"是指目的基因在植物中特定的時(shí)間和/或特定的 組織的表達(dá)。具體地說，本文所述的"水稻胚中特異性的表達(dá)"是指在本發(fā)明的啟動(dòng)子調(diào)控 下，目的基因高度特異性和專一性地在水稻胚中表達(dá)。
[0050] 本文所用的"外源的"或"異源的"是指不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列 之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對于 該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細(xì)胞或生物體來說也是"外源的"。
[0051] 本文所用的"順式調(diào)控元件"是指對基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率起調(diào)節(jié)作用的保 守性堿基序列。
[0052] 本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地與外源基因連接，該外源基因相對于啟動(dòng)子可以是 外源（異源）的。本文所述的外源基因（或目的基因）沒有特別限制，可以是RNAi基因或 編碼具有特定功能蛋白的基因，例如某些在農(nóng)業(yè)或植物或水稻改良上有重要特性或功能的 蛋白。
[0053] 所述外源基因的代表性例子包括（但不限于）：抗性基因、篩選標(biāo)記基因、抗原蛋 白基因及生物制劑基因、或植物品質(zhì)相關(guān)基因。
[0054] 所述的抗性基因選自下組：抗除草劑基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高溫基因、抗 旱基因、抗?jié)郴颉⒒蚩瓜x基因。所述的篩選標(biāo)記基因選自下組：gus ( β -葡萄糖苷酸酶）基 因、hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (綠色熒光蛋白）基因。所述的抗原蛋 白基因及生物制劑基因選自下組：細(xì)菌類抗原蛋白（如霍亂毒素 B，破傷風(fēng)毒素等）、病毒類 抗原蛋白（如犬細(xì)小病毒）、原生動(dòng)物類抗原蛋白（阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白（如I 型糖尿病的CTB-pins)、或生物制劑（如a 2b干擾素，胰島素樣生長因子等）。所述的植 物品質(zhì)相關(guān)基因選自下組：氣基酸改良相關(guān)基因、脂肪改良相關(guān)基因、淀粉改良相關(guān)基因或 雄性不育相關(guān)基因。
[0055] 本發(fā)明還提供了一種基因表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5' -3'依次具有下列元件：本發(fā) 明的啟動(dòng)子、基因 ORF序列和終止子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO. :1所示或與 SEQ ID NO. :1所示序列的同源性彡95%，較佳地彡98%，更佳地彡99%。
[0056] 本發(fā)明還提供了一種重組載體，其包含本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或基因表達(dá)盒。在優(yōu) 選的實(shí)施方式中，所述重組載體的啟動(dòng)子下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。需要 表達(dá)目的基因時(shí)，將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)，從而可操作地連接目 的基因與啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組載體在5'到3'方向上包括：啟動(dòng) 子，目的基因和終止子。如果需要，所述重組載體還可以包括以下元件：3'多聚核苷酸化信 號；非翻譯核酸序列；轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列；抗性選擇標(biāo)記（二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、 潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白等）；增強(qiáng)子；或操作子。
[0057] 用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。表達(dá)載體可以是細(xì)菌 質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠 在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被米用的。
[0058] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以采用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明啟動(dòng)子和/或目的基 因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。
[0059] 本發(fā)明的啟動(dòng)子、表達(dá)盒或載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使宿主表達(dá)蛋 白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌：或是低等真核細(xì)胞，如酵 母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體 和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主 為原核生物（如大腸桿菌）時(shí)，可以用CaCl 2法處理，也可用電穿孔法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核 生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法（如顯微注射、電穿孔、 脂質(zhì)體包裝等）。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn) 化法、花芽浸泡法等。對于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而 獲得轉(zhuǎn)基因的植物。
[0060] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，制備轉(zhuǎn)基因植物的方法是：將攜帶可操作連接的啟動(dòng)子和 目的基因的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌再將含啟動(dòng)子和目的基因的載體片段整合到植物的染 色體上。在本發(fā)明的實(shí)例中，所述的重組載體是帶有⑶S報(bào)告基因的pBIlOl. 1雙元載體， 將本發(fā)明的啟動(dòng)子構(gòu)建到該載體中GUS基因的上游，轉(zhuǎn)化植株，啟動(dòng)子將激活GUS基囚的表 達(dá)，所述啟動(dòng)受到啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的調(diào)控，可以有效模擬基因在體內(nèi)被激活轉(zhuǎn)錄的 狀況。
[0061] β -葡萄糖苷酸酶（⑶S)能催化裂解一系列的β -葡萄糖苷，產(chǎn)生具有發(fā)色團(tuán)或熒 光的物質(zhì)，可用分光光度計(jì)、熒光計(jì)或組織化學(xué)等方法對GUS活性進(jìn)行定量和空間定位分 析。在本領(lǐng)域中，GUS基因已被廣泛地用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因，特別是其 可被用于研究外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞和組織部位。
[0062] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，在本發(fā)明啟動(dòng)子的啟動(dòng)下，GUS基因可以特異地在水稻 胚中表達(dá)，而在其它組織中不表達(dá)。因此該啟動(dòng)子可以用于在胚中特異性改善水稻的性狀， 而不使得外源基因?qū)ζ渌M織造成影響。
[0063] 本發(fā)明的啟動(dòng)子、構(gòu)建物、或表達(dá)盒等可用于在水稻胚中特異表達(dá)外源基因，從而 改善水稻的農(nóng)藝性狀（如水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)），或增強(qiáng)水稻對不利環(huán)境（如冷凍、高溫、干旱、 病毒、病菌、蟲害或人工除草劑）的抵抗能力。本發(fā)明也可用于在水稻胚中特異性地生產(chǎn)蛋 白產(chǎn)物（如抗原蛋白及生物制劑），或用于研究外源基因在胚中的特定功能。
[0064] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0065] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0066] 實(shí)施例
[0067] 實(shí)施例1.水稻中胚特異性啟動(dòng)子的克隆
[0068] 以常規(guī)方法抽提的水稻基因組DNA為模板，利用以下引物對（SEQ ID NO. : 2和3)， 通過常規(guī)PCR方法擴(kuò)增出啟動(dòng)子Pl :
[0069] 正向引物：GGCTGCAGCGGCTGCTGTTCTTATGGC(SEQ ID N0:2)
[0070] 反向引物：GGGATCCTGCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID N0:3)。
[0071] 發(fā)明人還通過相同的方法，利用以下不同的反向引物擴(kuò)增出另外兩個(gè)啟動(dòng)子：P2 和P3 :
[0072] 反向引物：GGGATCCGCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID N0:4)
[0073] 反向引物：GGGATCCACTGCAAATCCGGTTAG(SEQ ID N0:5)。
[0074] 實(shí)施例2.構(gòu)建⑶S表達(dá)載體
[0075] 將實(shí)施例1獲得的啟動(dòng)子序列分別與市售載體PMD19-T載體（Takara公司）連接， 并進(jìn)行測序驗(yàn)證。然后用HindIII和BamHI雙酶切pMD19-T載體，回收約2kb的啟動(dòng)子片 段，將該片段和含有GUS報(bào)告基因的二元載體pBI 101. I (Clontech公司，美國）分別用限制 性內(nèi)切酶HindIII和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物通過凝膠回收后用T4-DNA連接酶進(jìn)行連 接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株中加以保存。
[0076] 獲得的最終載體命名為 pBIlOL 1-P1-GUS、pBIlOL 1-P2-GUS 和 pBIlOL 1-P3-GUS。用熱激轉(zhuǎn)化法將重組載體 pBIlOL 1-P1-GUS、pBIlOL 1-P2-GUS 和 pBIlOL 1-P3-GUS分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株中，并用PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。
[0077] 實(shí)施例3.轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0078] 將構(gòu)建好的載體pBIlOL l-Pl-GUS、pBI10L 1-P2-GUS 和 pBIlOL 1-P3-GUS 分別轉(zhuǎn) 化至市售的農(nóng)桿菌GV3101菌株，然后通過花浸法對野生型水稻中花11進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0079] 實(shí)施例4.⑶S組織化學(xué)染色
[0080] 對構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS染色，結(jié)果如圖1所示，其中，A顯示了轉(zhuǎn)基因植株 的根；B顯示了轉(zhuǎn)基因植株的莖和生長點(diǎn)（SAM) ;C顯示了轉(zhuǎn)基因植株的葉；D顯示了轉(zhuǎn)基因 植株的小花結(jié)構(gòu)；E、F顯示了轉(zhuǎn)基因植株未成熟種子的幼胚；G顯示了轉(zhuǎn)基因植株未成熟種 子的橫切面；H顯示了轉(zhuǎn)基因植株未成熟種子的胚乳；I顯示了轉(zhuǎn)基因植株未成熟種子幼胚 的橫切面。
[0081] 從本實(shí)施例的結(jié)果可以明顯發(fā)現(xiàn)，通過⑶S染色，pBIlOL 1-P2-GUS和 pBIlOL 1-P3-GUS沒有明顯的⑶S顯色反應(yīng)，而pBIlOL I-Pl-GUSl能夠觀察到顯色部位，且 顯色部位集中在幼胚中，尤其是胚的盾片面。說明Pl序列是胚特異性地正確啟動(dòng)GUS基因 表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0082] 由此，本發(fā)明得到了在胚以及盾片中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0083] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種啟動(dòng)子元件，所述啟動(dòng)子元件選自下組： (a) 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸； (b) 核苷酸序列與SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95%(較佳地彡98%)，且具有水稻 胚中特異啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子活性的多核苷酸； (c) 如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60個(gè)（較佳地1-30,更 佳地1-6個(gè)）核苷酸，且具有水稻胚中特異啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子活性的多核苷酸。
2. -種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與外源基因可操作連接的權(quán)利要求1所 述的啟動(dòng)子元件。
3. -種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5'至3'依次具有下述元件：權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子 元件、基因0RF序列和終止子。
4. 一種載體，所述載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件、或權(quán)利要求3所述的表達(dá) 盒。
5. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體、或其染色體上整合有外 源的權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件、或其染色體整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒。
6. 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件，權(quán)利要求2所述的構(gòu)建物，權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒 的用途，用于特異性調(diào)控外源基因在水稻胚中的表達(dá)。
7. -種在水稻胚中特異性表達(dá)外源基因的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作連接的權(quán)利要 求1所述的啟動(dòng)子元件； (b) 將步驟（a)得到的構(gòu)建物導(dǎo)入水稻細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞； (c) 將步驟（b)中轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞再生成水稻植株，從而使所述外源基因在水稻胚中 特異性表達(dá)。
8. -種制備轉(zhuǎn)基因水稻的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供下述水稻細(xì)胞，所述水稻細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述載體、或其染色體整合有權(quán) 利要求1所述啟動(dòng)子、或其染色體整合有權(quán)利要求3所述表達(dá)盒； (b) 將（a)的水稻細(xì)胞再生為水稻植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
9. 一種水稻愈傷組織或水稻體細(xì)胞胚胎，所述水稻愈傷組織或水稻體細(xì)胞胚胎包下述 水稻細(xì)胞或由下述水稻細(xì)胞構(gòu)成：所述水稻細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體、或其染色體 整合有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件、或其染色體整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒。
【文檔編號】C12N15/82GK104419707SQ201310401718
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】時(shí)振英, 戴爭妍 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院