一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體t305a及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A，是利用現(xiàn)代分子酶工程技術(shù)對(duì)來(lái)源于枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列進(jìn)行分子改造，通過(guò)易錯(cuò)PCR和活力篩選，獲得突變體T305A，將其基因插入pSE380構(gòu)建重組載體，導(dǎo)入大腸桿菌宿主表達(dá)。該突變體酶與野生型酶相比，在以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷形成左聚糖反應(yīng)中的底物濃度耐受性顯著提高，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率時(shí)的底物濃度由野生型酶的10%提高到突變體酶的25%，有利于提高批次產(chǎn)量和設(shè)備利用率，降低生產(chǎn)成本。
【專利說(shuō)明】—種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]左聚糖(Levan)是一類主要來(lái)源于微生物、通常以β-(2，6)糖苷鍵連接而成高分子量果聚糖。左聚糖已經(jīng)被證實(shí)具有多種生物學(xué)活性，在抗腫瘤，抗病毒，增強(qiáng)身體免疫等方面都有一定的效果。左聚糖還具有增強(qiáng)免疫應(yīng)激，改善腸道失衡的功能，是一種重要的食品添加劑，可以用于益生元、膳食纖維、低熱食品、減肥產(chǎn)品、降脂產(chǎn)品生產(chǎn)，還可以作為乳化劑、保濕劑、凝膠劑等等使用。左聚糖在保濕性能上和目前化妝品行業(yè)需求大價(jià)格高昂的透明質(zhì)酸具有同等效果，在化妝品行業(yè)的應(yīng)用有極大潛力。目前國(guó)內(nèi)的左聚糖市場(chǎng)主要由韓國(guó)進(jìn)口產(chǎn)品壟斷。
[0003]左聚糖鹿糖酶(levansucrase)又稱為果糖基轉(zhuǎn)移酶(fructosyltransferase,FTF, FTase, sucrose: 2, 6-D-fructan-6-D-fructosy I transferase, Lis, EC2.4.1.10),是一類可以將蔗糖水解成果糖和葡萄糖，并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用將蔗糖中的果糖基轉(zhuǎn)移形成果聚糖的酶。
[0004]目前國(guó)內(nèi)外已有一些利用微生物發(fā)酵方式產(chǎn)生左聚糖的研究，但還未成熟地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。而利用左聚糖蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)左聚糖的研究報(bào)道很少，將左聚糖蔗糖酶進(jìn)行分子改造提高效能的研究也開(kāi)展得很少。已經(jīng)報(bào)道的左聚糖蔗糖酶普遍存在著反應(yīng)最適溫度低、熱穩(wěn)定性不佳、底物濃度耐受性低或底物轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題，相當(dāng)多已經(jīng)報(bào)道的左聚糖蔗糖酶其蔗糖底物濃度超過(guò)10%則引起轉(zhuǎn)化率顯著下降，制約了生產(chǎn)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A及其應(yīng)用，該突變體能夠使以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷形成左聚糖反應(yīng)中的底物濃度耐受性顯著提高，由原酶的10%提高到突變體酶的25%，有利于提高批次產(chǎn)量和設(shè)備利用率。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A，是利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)將野生型基因上的第913個(gè)堿基由A替換為G，實(shí)現(xiàn)將野生型左聚糖蔗糖酶第305位氨基酸從原來(lái)的THR替換為ALA，改造得到一個(gè)新的左聚糖蔗糖酶突變體T305A。由于在工程菌構(gòu)建中酶切和連接反應(yīng)的需要，突變體T305A比野生型多一個(gè)氨基酸殘基Val，位于起始密碼子之后，因此在突變體T305A的氨基酸序列中，其第306位氨基酸對(duì)應(yīng)于野生型左聚糖蔗糖酶第305位。
[0007]一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)左聚糖鹿糖酶(levansucrase)突變體基因t305a，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質(zhì)T305A，由474個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所不。[0009]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質(zhì)T305A在以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)生左聚糖(Levan)中的應(yīng)用。
[0010]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質(zhì)T305A，在野生型酶第305位氨基酸殘基相同位點(diǎn)突變所得突變體在以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)生左聚糖中的應(yīng)用。
[0011] (I)左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a的獲得
[0012]所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a是根據(jù)Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢桿菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)兩端引物，其中上游引物Fl含有Nco I酶切位點(diǎn)，下游引物Rl含有Pst I酶切位點(diǎn)和6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽，
[0013]上游引物Fl 為:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGTTTGC
[0014]下游引物Rl 為:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGTTTGTTAATTGTTAATT。
[0015]通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得枯草芽孢桿菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因片段，連接到pSE380載體構(gòu)建出重組質(zhì)粒PSE-SS56A，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證該野生型左聚糖蔗糖酶氨基酸序列與已公布的NC_00964枯草芽孢桿菌Subsp.subtilis str.168的sacB基因編碼的左聚糖蔗糖酶的氨基酸序列僅有第472位一個(gè)氨基酸殘基不同；再以重組質(zhì)粒PSE-SS56A為模板，采用相同引物通過(guò)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生突變基因，將易錯(cuò)PCR產(chǎn)物連接到pSE380載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，通過(guò)抗性平板篩選重組子和活性測(cè)定得到突變體酶。
[0016](2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證
[0017]用限制性內(nèi)切酶EcoR I對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切驗(yàn)證，根據(jù)線性重組質(zhì)粒的分子量初步判斷是否構(gòu)建成功，并進(jìn)一步將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序分析，得出連入外源片段的核酸序列，確定正確的轉(zhuǎn)化子。
[0018](3)基因工程菌株的構(gòu)建:
[0019]采用CaCl2化學(xué)法將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞，利用氨芐青霉素抗性平板初篩獲得重組子，將重組子經(jīng)液體培養(yǎng)，收集培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)超聲波破胞后，測(cè)定破胞的粗酶液酶活力進(jìn)行復(fù)篩，選出活力有改變的工程菌。用IPTG誘導(dǎo)工程菌表達(dá)重組蛋白，通過(guò)鎳親和層析法純化目的蛋白，檢測(cè)純化后的酶蛋白活力。
[0020]本發(fā)明的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和技術(shù)效果在于:
[0021]利用現(xiàn)代微生物生物技術(shù)和分子酶工程技術(shù)，獲得一個(gè)新的枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶突變體T305A，其在第305位氨基酸由野生型酶的THR突變?yōu)锳LA。該突變體酶與野生型酶相比，在以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷形成左聚糖反應(yīng)中的底物濃度耐受性顯著提高，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率時(shí)的底物濃度由野生型酶的10%提高到突變體酶的25%，有利于提高批次產(chǎn)量和設(shè)備利用率，降低生產(chǎn)成本，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為左聚糖蔗糖酶突變體基因PCR擴(kuò)增電泳圖。
[0023]圖2為連接有左聚糖蔗糖酶突變體基因的PSE380重組質(zhì)粒的單酶切驗(yàn)證電泳圖。
[0024]圖3為經(jīng)鎳親和層析純化后所得左聚糖蔗糖酶突變體T305A純化產(chǎn)物的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖。
[0025]圖4為左聚糖蔗糖酶野生型酶在不同底物濃度下將蔗糖轉(zhuǎn)化為左聚糖的相對(duì)產(chǎn)率和相對(duì)轉(zhuǎn)化率的變化。[0026]圖5為左聚糖蔗糖酶突變體T305A在不同底物濃度下將蔗糖轉(zhuǎn)化為左聚糖的相對(duì)產(chǎn)率和相對(duì)轉(zhuǎn)化率變化。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌菌種可以從菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)，也可以通過(guò)野外采集或者其他途徑獲得。微生物培養(yǎng)、基因克隆、表達(dá)技術(shù)和相關(guān)的技術(shù)方案是本領(lǐng)域中常用的成熟技術(shù)，涉及的專業(yè)術(shù)語(yǔ)也是本領(lǐng)域中常見(jiàn)的專業(yè)術(shù)語(yǔ)，實(shí)施例是說(shuō)明性的，而不是限定性的，不能被解釋為限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028]下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述:
[0029](I)左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a的獲得
[0030]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) sp.56A是本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選所得,經(jīng)過(guò)16S rRNA序列分析比對(duì)鑒定為枯草芽孢桿菌。通過(guò)提取枯草芽孢桿菌sp.56A的基因組DNA為模板，根據(jù)Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢桿菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)兩端引物，其中上游引物Fl含有Nco I酶切位點(diǎn)，下游引物Rl含有Pst I酶切位點(diǎn)和6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因，將PCR產(chǎn)物用Nco I和Pst I雙酶切后連接到同樣雙酶切的PSE380載體，構(gòu)建出攜帶有枯草芽孢桿菌sp.56A野生型左聚糖蔗糖酶基因的重組質(zhì)粒pSE-SS56A，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證該野生型左聚糖蔗糖酶氨基酸序列與已公布的NC_00964枯草芽孢桿菌Subsp.subtilis str.168的sacB基因編碼的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列僅有第472位一個(gè)氨基酸殘基不同；再以重組質(zhì)粒PSE-SS56A為模板，采用相同引物通過(guò)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生突變基因，將易錯(cuò)PCR產(chǎn)物連接到pSE380載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，通過(guò)抗性平板篩選重組子和活性測(cè)定得到突變體酶。
[0031 ]上游引物 Fl 為:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGITTGC [0032]下游引物Rl 為:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGTTTGTTAATTGTTAATT
[0033]常規(guī)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為:5XPrimer STAR PCR buffer5.0 μ L，2.5mmol/L 的dNTPs2.0yL, 50mmol/L 的上下游引物各 1.0 μ L，DNA 模板 0.5 μ L, Primer STAR?0.5 μ L,加超純水至反應(yīng)總體積為25 μ L
[0034]常規(guī)PCR擴(kuò)增條件為:95°C解鏈3min，94°C變性30sec ;42°C退火30sec ;72°C延伸3min ;共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)；然后于72°C繼續(xù)延伸lOmin。
[0035]易錯(cuò)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10XPCR bufferl0.Ομ L，25mmol/L 的MnCl22.0 μ L, 25mmol/L 的 MgCl222.0 μ L, 100mmol/L 的 dATP0.2 μ L, 100mmol/L 的dGTP0.2 μ L, IOOmmoI/L 的 dCTPl.0yL, IOOmmoI/L 的 dTTPl.0yL, 50mmol/L 的上下游引物各2.0 μ L，DNA模板I μ L，Lc Taq3.0U,加超純水至反應(yīng)總體積為100 μ L。
[0036]易錯(cuò)PCR擴(kuò)增條件為:95°C解鏈3min，94°C變性30sec ;42°C退火30sec ;72°C延伸3min ;共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)；然后于72°C繼續(xù)延伸lOmin。
[0037]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的基因片段大小基本吻合(圖1)。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天澤公司產(chǎn)品)進(jìn)行純化，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。純化的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Nco I和Pst I雙酶切后連接到同樣雙酶切的PSE380載體，連接產(chǎn)物用CaCl2K學(xué)法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選挑取重組子。從挑取的重組子提取質(zhì)粒，用EcoR I單酶切驗(yàn)證，所得重組質(zhì)粒分子量與攜帶有目的片段的PSE380載體理論分子量基本吻合(圖
2)，則可進(jìn)一步進(jìn)行DNA測(cè)序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子。
[0038]用CaCl2K學(xué)法將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建基因工程菌。將構(gòu)建好的基因工程菌接種于含100 μ g/mL氨芐青霉素的5mL液體LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10h。取2.0mL的液體種子接種到含100 μ g/mL氨芐青霉素的200mL液體LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2-3h，當(dāng)0D_達(dá)到0.6~1.0之時(shí)，加入終濃度為0.5~1.0mmoI/L的IPTG，于20°C、200r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)20h左右，收集細(xì)胞，采用超聲波破胞制備粗酶液，經(jīng)過(guò)鎳親和層析純化，純化重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，得到比較明顯的單一條帶(圖3)，說(shuō)明重組酶純化效果較好，可用于酶活力測(cè)試。
[0039]本發(fā)明采用提取稱重法測(cè)定左聚糖蔗糖酶以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)生左聚糖的聚合酶活力。
[0040]酶活測(cè)定的步驟為:取適量的左聚糖蔗糖酶純化液，在適當(dāng)PH緩沖體系中與蔗糖反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系加入2-3倍無(wú)水乙醇，于4°C靜置過(guò)夜使多糖充分沉淀，同時(shí)使單糖盡量溶解在溶液里。然后在4°C用13000g離心30分鐘，棄去上清，所得左聚糖沉淀在60°C真空烘干至恒重，稱出左聚糖產(chǎn)物的重量，即可計(jì)算聚合酶活力。
[0041]野生型酶在蔗糖底物濃度為10%時(shí)達(dá)到最高的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率(圖4)，之后隨著底物濃度升高轉(zhuǎn)化率明顯逐步下降；而左聚糖蔗糖酶突變體酶T305A在蔗糖底物濃度為25%達(dá)到最高的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率(圖5)，之后才略有下滑。可見(jiàn)，僅僅在野生型酶第305位一個(gè)氨基酸殘基的改變對(duì)左聚糖蔗糖酶的底物濃度耐受性有顯著影響。
[0042]提高酶的底物濃度耐受性意味著可以在單個(gè)批次生產(chǎn)中投放更多的底物原料而不影響酶的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率，提`高設(shè)備利用率，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，更適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
[0043]應(yīng)該理解的是，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，例如，所述的野生型左聚糖蔗糖酶除了來(lái)源于枯草芽孢桿菌之外，還可以來(lái)源于地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、類芽孢桿菌等菌株。所述的載體適于在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、畢赤酵母等宿主中表達(dá)，也可通過(guò)電轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等將本發(fā)明的左聚糖蔗糖酶突變體轉(zhuǎn)入原核或者真核宿主中，以實(shí)現(xiàn)左聚糖蔗糖酶突變體的表達(dá)?；蛘咄ㄟ^(guò)酶工程技術(shù)對(duì)同一位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行替換。而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)左聚糖鹿糖酶(levansucrase)突變體基因t305a，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質(zhì)T305A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a，其特征在于，該突變體基因是根據(jù)Genbank已公布的NC_014479枯草芽孢桿菌str.W23的左聚糖蔗糖酶基因sacB全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)兩端引物，其中上游引物Fl含有Nco I酶切位點(diǎn)，下游引物Rl含有Pst I酶切位點(diǎn)和6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽， 上游引物 Fl 為:GATCCATGGTGAACATCAAAAAGITTGC 下游引物 Rl 為:GATCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGITTGTTAATTGTTAATT。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質(zhì)T305A在以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)生左聚糖Levan中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的左聚糖蔗糖酶突變體基因t305a編碼的蛋白質(zhì)T305A，在野生型酶第305位氨基酸殘基相同 位點(diǎn)突變所得突變體在以蔗糖為底物轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)生左聚糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK103484482SQ201310403373
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】楊輝, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)