發(fā)酵制備高純度賴氨酸鹽的方法及其產品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了發(fā)酵制備含L-賴氨酸鹽的產品的方法，其包括向產L-賴氨酸的菌導入一個被認為與賴氨酸代謝無關的基因，而且獲得的產品中賴氨酸含量可以得到提高。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產的產品，該產品相對于現(xiàn)有含L-賴氨酸鹽的產品，能夠顯著提高抗吸濕性，從而適宜長期保存，制備方法靈活性好而且成本可控。
【專利說明】發(fā)酵制備高純度賴氨酸鹽的方法及其產品
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產品的方法，其包括創(chuàng)新地向產L-賴氨酸的菌導入一個通常被認為與賴氨酸代謝無關的基因，而且獲得的產品中賴氨酸含量可以得到提高。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產的產品和應用等。
【背景技術】
[0002]L-賴氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應用于食品業(yè)、飼料業(yè)、制藥業(yè)及其他化學工業(yè)中，尤其是含有雜質的賴氨酸鹽(如，硫酸鹽、鹽酸鹽)，一般可以直接作為飼料添加劑使用。當前，L-賴氨酸的生產主要是通過微生物的發(fā)酵生產的，如可以利用棒狀桿菌生產。
[0003]在賴氨酸鹽的各類產品中，尤其是賴氨酸硫酸鹽，具有非常大的缺點，即具有較大的吸濕性，由此使得其中的含水量過高(如，大于3%)，這樣過高的產品濕度容易導致產品結塊，不易保存，尤其長期保存時容易發(fā)霉，這即使在作為安全要求較低的飼料使用時，也是不容許的。尤其是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，我國廣大農戶，牲畜飼養(yǎng)規(guī)模不大，賴氨酸鹽作為飼料添加劑用量不大，因此整包購進(往往單價更為便宜)的賴氨酸鹽產品，因此會有較多留存，長期保存時產品的吸濕性對他們的影響更大。
[0004]為此，日本味之素公司采用調節(jié)酸根陰離子與賴氨酸的當量比來克服這一缺陷，將酸根陰離子與賴氨酸的當量比調節(jié)為0.68、.95之間，即酸根陰離子的當量小于賴氨酸的當量，這樣可以在一定程度上降低產品的平衡濕度(參見中國專利第03120099號)。上述方法對于賴氨酸鹽酸鹽來說，會帶來比較良好的抗吸濕性，在相對濕度為33飛8%的常規(guī)保存環(huán)境下，基本能使得產品的平衡濕度控制在3%以下；然而，對于賴氨酸硫酸鹽來說，在此保存環(huán)境下，平衡濕度基本都超過3%，`甚至會超過5%。
[0005]經本發(fā)明人長期研究和實驗，令人意外地發(fā)現(xiàn)了，在抗吸濕性差的賴氨酸硫酸鹽中添加一定比例的其它類型的氨基酸，盡管會降低產品中賴氨酸硫酸鹽的純度，但是會使得賴氨酸硫酸鹽產品的抗吸濕性得到顯著提升，而且該純度的產品并不影響其作為賴氨酸飼料添加劑的效用。
[0006]而且，本發(fā)明人還研究出了一種新的發(fā)酵方法，與現(xiàn)有技術的不斷加強生成賴氨酸的代謝途徑的思路相反，打開非賴氨酸代謝的其他旁路，尤其是在十分復雜的代謝通路中令人意外地尋找到了一種酶，打開的程度非常適中，從而能發(fā)酵得到賴氨酸和其它類型氨基酸配比適當?shù)漠a品，無需過多的制備工藝步驟，得到的產品仍舊能夠作為賴氨酸飼料添加劑，而且抗吸濕性得到顯著提升。
[0007]進一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在該發(fā)酵所得到的產物中的賴氨酸含量在添加硫酸成鹽后很難逾越55%，而目前市場上銷售的產品中以較高和高濃度產品為主(一般賴氨酸含量達到55%或以上)，因此將產品中賴氨酸含量提升到55%或更高也是需要解決的技術問題。為此，本發(fā)明人還提供了一種成本可控的發(fā)酵生產高純度賴氨酸硫酸鹽的方法。
【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術問題在于提供新的發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產品的方法，其包括創(chuàng)新地向產L-賴氨酸的菌導入一個通常被認為與賴氨酸代謝無關的基因，而且使得獲得的產品中賴氨酸含量提高。另外，本發(fā)明還提供了該方法生產的產品和應用等。
[0009]具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產品的方法，其包括:
(1)將編碼氨基酸序列如SEQID No:1所示的蛋白或其變體的多核苷酸導入產L-賴氨酸的菌；
(2)在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng)步驟(I)獲得的菌，并收集培養(yǎng)的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸:
賴氨酸51~55份，優(yōu)選為51.5~53.5份，更優(yōu)選為52.3份；
天冬氨酸1.2^1.8份，優(yōu)選為1.45^1.6份，更優(yōu)選為1.54份；
蘇氨酸0.8^1.1份，優(yōu)選為0.9^1份，更優(yōu)選為0.94份；
絲氨酸0.4~0.65份，優(yōu)選為0.5~0.6份，更優(yōu)選為0.56份；
谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.2~2.6份，更優(yōu)選為2.4份；
甘氨酸0.75~1.1份，優(yōu)選為0.85~I份，更優(yōu)選為0.92份；
丙氨酸1.2^1.6份，優(yōu)選為1.3^1.5份，更優(yōu)選為1.4份；
纈氨酸0.75^1.1份，優(yōu)選為0.85^1份，更優(yōu)選為0.93份；
甲硫氨酸0.3~0.5份，優(yōu)選為0.35~0.48份，更優(yōu)選為0.42份；
異亮氨酸0.45~0.75份，優(yōu)選為0.55~0.65份，更優(yōu)選為0.61份;
亮氨酸廣1.5份，優(yōu)選為1.2^1.35份，更優(yōu)選為1.27份；
酪氨酸0.5^0.8份，優(yōu)選為0.6^0.75份，更優(yōu)選為0.67份；
苯丙氨酸0.5^0.8份，優(yōu)選為0.6^0.7份，更優(yōu)選為0.64份；
組氨酸0.8~1.2份，優(yōu)選為0.9~1.05份，更優(yōu)選為0.97份；和，
精氨酸，0.9^1.3份，優(yōu)選為f 1.2份，更優(yōu)選為1.1份；
(3)取通過步驟(2)制備的上清液，進行純化，得到賴氨酸純度提高的級份，優(yōu)選級份中賴氨酸純度提高至75~95% (w/w),更優(yōu)選至76~92.6% (w/w),更加優(yōu)選至78~83% (w/w),最優(yōu)選至 80.7% (w/w) ；
(4)另取通過步驟(2)制備的上清液，加入硫酸，并任選進行濃縮，得到酸化的上清液;
和
(5)將步驟(3)獲得的級份加入硫酸，并噴入干燥機，在干燥機內形成顆粒核心，而后向該干燥機噴入步驟(4)獲得的酸化的上清液，包裹上述顆粒核心，然后干燥至含水率小于3% (w/w)。
[0010]在本發(fā)明的【具體實施方式】中，所述多核苷酸編碼氨基酸序列如SEQ ID No:l所示的蛋白。與現(xiàn)有技術的不斷加強生成賴氨酸的代謝途徑的思路相反，本發(fā)明第一方面的方法通過引入RNA聚合酶sigma-32因子來適中地打開非賴氨酸代謝的其他旁路，從而能一次性發(fā)酵得到賴氨酸和其它類型氨基酸配比適當?shù)漠a品，無需過多的制備工藝步驟。RNA聚合酶sigma-32因子通過特異性地對熱休克啟動子起作用，而參與熱休克過程，影響熱休克相關蛋白的轉錄，從而對谷氨酸發(fā)酵中的微生物克服代謝產生的毒物產生影響。盡管RNA聚合酶sigma-32因子已經被公開(可參見NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)蛋白和基因登錄號AAB18436.1 ;也可參見中國專利申請第96193336號)，但是RNA聚合酶sigma-32對賴氨酸發(fā)酵以及對其中的氨基酸產生分布的影響卻沒有任何啟示。因此，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，所述變體的氨基酸序列為對如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列添加、缺失或取代一個和幾個氨基酸殘基而獲得的氨基酸序列。
[0011]更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，所述變體的氨基酸序列為對如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列添加、缺失和取代一個或幾個氨基酸殘基而獲得的氨基酸序列，而且編碼該變體的多核苷酸導入產L-賴氨酸的菌后在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng),培養(yǎng)的上清液包含如本發(fā)明第一方面中所述重量配比的氨基酸。
[0012]本領域技術人員可以根據RNA聚合酶sigma-32因子的氨基酸序列推導出其編碼的核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子改造的核苷酸序列，以調節(jié)該代謝途徑打開的程度。在本發(fā)明的【具體實施方式】中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所不。
[0013]所述多核苷酸可以通過各種本領域技術人員所熟知的方式被導入產L-賴氨酸的菌，只要能夠使產L-賴氨酸的菌表達所述RNA聚合酶sigma-32因子即可。所述多核苷酸可以直接被導入，例如利用微粒體、基因槍等導入細胞；也可以間接被導入，例如可以通過構建在質粒等載體上導入細胞。導入的所述多核苷酸可以整合在細胞的基因組上表達，也可以游離表達。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，工程菌是大腸桿菌，更優(yōu)選是對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的大腸桿菌，最優(yōu)選是表達對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的二氫吡啶二羧酸合成酶的大腸桿菌(參見中國專利第94194962號)。由于大腸桿菌本身適合作為克隆宿主菌，因此優(yōu)選所述多核苷酸是通過氯化鈣轉化法導入大腸桿菌的。
[0014]在本文中，在表示配比時所用的“份”，是為了表示在所屬組合物中，各成分的重量配比，這對于本領域技術人員來說是能夠理解的。重量“份”在對組合物中一種以上的成分進行限定時，可以看作是這些成分在該組合物中的比例。
[0015]在本文中，接種量具有本領域技術人員所能常規(guī)理解的含義，具體在以體積百分比表示的時候，指的是菌體培養(yǎng)液(接入的菌液)體積相對于被接入的培養(yǎng)基體積的百分比量。
[0016]在本文中，“純度”是本領域技術人員所熟知的術語，是不計入水的含量，即指的是產品中某一非水物質占脫水產品的量?！凹兌取蓖ǔ？梢砸再|量百分比來表示。
[0017]可以通過經過純化而提高了賴氨酸純度的級份和直接酸化而進行噴霧的上清液的比例，來調節(jié)最終產品中的賴氨酸含量。精準控制獲得上述級份的上清液和直接酸化而進行噴霧的上清液比例，也能夠精準控制最終產品中的賴氨酸含量，保持產品質量的穩(wěn)定性。然而，純化會增加成本，而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在飼料領域沒有必要追求過高的純度，只需要把產品中有效成分純度提升至適合飼料產品推廣應用的程度即可，如55%。因此，步驟
(3)中所取的通過步驟(2)制備的上清液一般要小于步驟(4)中所另取的通過步驟(2)制備的上清液，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟(3)中所取的通過步驟(2)制備的上清液與步驟(4)中所另取的通過步驟(2)制備的上清液的體積比為0.5-1.5:2~4，優(yōu)選為
0.75~1.25:2.5~3.5，更優(yōu)選為 1:3。
[0018]本發(fā)明第一方面的方法中加入硫酸，從而可以和賴氨酸這一堿性氨基酸成鹽，更易于在干燥過程中凝結成顆粒。硫酸的加入量與上清液和/或級份中賴氨酸的比例可以是恒定的。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(4)中，所述通過步驟(2)制備的上清液中的賴氨酸與加入的硫酸的摩爾比為1-3:0.5~1.5，優(yōu)選為1.5~2.5:0.75~1.25，更優(yōu)選為2:1。也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(5)中，所述步驟(3)獲得的級份中的賴氨酸與加入的硫酸的摩爾比為1-3:0.5~1.5，優(yōu)選為1.5~2.5:0.75~1.25，更優(yōu)選為2:1。
[0019]純化可以通過本領域的常規(guī)純化手段來純化，如膜過濾、層析、結晶等手段來進行。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，純化是層析純化，優(yōu)選是凝膠過濾層析純化，更優(yōu)選是Sephadex G_10層析純化。這樣的純化設備一般可以通過市場渠道購買。另外，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，純化后可以對純化直接得到的級份進行濃縮，從而獲得進行以 后步驟的級份。
[0020]液體的濃縮和干燥可以通過本領域常用的設備，如，蒸發(fā)器、干燥機和/或烘箱，來進行。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，在步驟(4)中，另取通過步驟(2)制備的上清液，加入硫酸，進行濃縮(優(yōu)選用蒸發(fā)器濃縮)，得到酸化的上清液；然后在步驟(5)中，將步驟
(3)獲得的級份加入硫酸，并噴入流化床干燥機，在該干燥機內形成顆粒核心，而后向該干燥機噴入步驟(4)獲得的酸化的上清液，包裹上述顆粒核心，然后于烘箱干燥至含水率小于3% (w/w)。
[0021]在第二方面，本發(fā)明提供了含L-賴氨酸硫酸鹽的顆粒(其優(yōu)選是飼料添加劑顆粒)，其包括顆粒核心和包裹該核心的外層，其中顆粒核心的L-賴氨酸含量為6(T72% (w/w),優(yōu)選為61~70.6% (w/w),更優(yōu)選為62~65% (w/w),最優(yōu)選為63.5% (w/w),外層的L-賴氨酸含量為51~55% (w/w)，優(yōu)選為51.5~53.5% (w/w)，更優(yōu)選為52.3% (w/w)0上述內外層結構的顆粒也能夠使得體內在后被降解內部高賴氨酸純度的顆粒核心更可能較持續(xù)地發(fā)揮作用，因此可能提高飼料添加劑的功效。
[0022]經動物證實，即使進一步包含發(fā)酵雜質，本發(fā)明第二方面的顆粒在對動物喂飼中使用仍舊是安全的，更由于其他種類的氨基酸的加入，甚至還可以進一步提高飼料添加劑的功效。因此，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的顆粒是飼料添加劑。
[0023]經本發(fā)明人長期研究和實驗，令人意外地發(fā)現(xiàn)了，在抗吸濕性差的賴氨酸硫酸鹽中添加一定比例的其它類型的氨基酸，會使得賴氨酸硫酸鹽產品的抗吸濕性得到顯著提升，因此適宜長期保存。在本文中，平衡含水率可以與平衡濕度互換使用，是本領域技術人員所常用的吸濕性指標，指的是在一定相對濕度環(huán)境下，產品含水率達到平衡(即，含水率既不會增加，也不會減少)時的含水率。優(yōu)選可以在常規(guī)保存條件下(相對濕度為33~58%)長期保存，本發(fā)明第二方面的產品的(平衡)含水率小于5% (w/w)，優(yōu)選小于3% (w/w)，更優(yōu)選小于 2.5% (w/w)。
[0024]本發(fā)明第二方面的顆?？梢圆缓衅渌s質(即，本發(fā)明第二方面的顆粒由氨基酸組成)，也可以進一步包含雜質，如發(fā)酵雜質。經本發(fā)明人研究，采用本發(fā)明第一方面的方法制備的產品中的其他雜質，并不能使上述比例的氨基酸產品在常規(guī)保存條件下含水率高于3% (w/w)0因此優(yōu)選本發(fā)明第二方面的顆粒是由本發(fā)明第一方面的方法制備的。
[0025]本發(fā)明第二方面的顆粒中顆粒核心和外層合計的賴氨酸含量可以超過55%(w/w)，因此優(yōu)選本發(fā)明第二方面的顆粒中L-賴氨酸含量不小于55% (w/w),優(yōu)選大于55% (w/w),如 55.1% (w/w)。[0026]在第三方面，本發(fā)明提供了含L-賴氨酸硫酸鹽的顆粒核心，其中L-賴氨酸含量為60-72% (w/w)，優(yōu)選為 61 -70.6% (w/w)，更優(yōu)選為 62-65% (w/w)，最優(yōu)選為 63.5% (w/w)。
[0027]在本文中，“顆粒核心”指的是可以在較大顆粒內部成為核心的較小顆粒。該顆粒核心的賴氨酸含量更高，雜質更少，因此該顆粒核心本身對動物喂飼的安全性和功效也是可以預期的。所以，優(yōu)選本發(fā)明第三方面的顆粒核心是飼料添加劑顆粒核心。
[0028]顆粒核心可以直接使用其中成分混合而成，但是優(yōu)選是由本發(fā)明第一方面的方法的步驟(1)、(2)、(3)和(5)制備的。所以，優(yōu)選本發(fā)明第三方面的顆粒核心是由如下方法制備的:
(1)將編碼氨基酸序列如SEQID No:1所示的蛋白或其變體的多核苷酸導入產L-賴氨酸的菌；
(2)在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng)步驟(I)獲得的菌，并收集培養(yǎng)的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸:
賴氨酸51-55份，優(yōu)選為51.5-53.5份，更優(yōu)選為52.3份；
天冬氨酸1.2-1.8份，優(yōu)選為1.45-1.6份，更優(yōu)選為1.54份；
蘇氨酸0.8-1.1份，優(yōu)選為0.9-1份，更優(yōu)選為0.94份；
絲氨酸0.4-0.65份，優(yōu)選為0.5-0.6份，更優(yōu)選為0.56份；
谷氨酸2-3份，優(yōu)選為2.2-2.6份，更優(yōu)選為2.4份；
甘氨酸0.75-1.1份，優(yōu)選為0.85-I份，更優(yōu)選為0.92份；
丙氨酸1.2-1.6份，優(yōu)選為1.3-1.5份，更優(yōu)選為1.4份；
纈氨酸0.75-1.1份，優(yōu)選為0.85-1份，更優(yōu)選為0.93份；
甲硫氨酸0.3-0.5份，優(yōu)選為0.35-0.48份，更優(yōu)選為0.42份；
異亮氨酸0.45-0.75份，優(yōu)選為0.55-0.65份，更優(yōu)選為0.61份;
亮氨酸廣1.5份，優(yōu)選為1.2-1.35份，更優(yōu)選為1.27份；
酪氨酸0.5-0.8份，優(yōu)選為0.6-0.75份，更優(yōu)選為0.67份；
苯丙氨酸0.5-0.8份，優(yōu)選為0.6-0.7份，更優(yōu)選為0.64份；
組氨酸0.8-1.2份，優(yōu)選為0.9-1.05份，更優(yōu)選為0.97份；和，
精氨酸，0.9-1.3份，優(yōu)選為f 1.2份，更優(yōu)選為1.1份；
(3)取通過步驟(2)制備的上清液，進行純化，得到賴氨酸純度提高的級份，優(yōu)選級份中賴氨酸純度提高至75-95% (w/w)，更優(yōu)選為76-92.6% (w/w)，更加優(yōu)選為78-83% (w/w)，最優(yōu)選為80.7% (w/w);和
(4)將步驟(3)獲得的級份加入硫酸，并噴入干燥機，在干燥機內形成顆粒核心。
[0029]在又一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第三方面的顆粒核心在制備含水率小的含L-賴氨酸硫酸鹽的飼料添加劑中的應用。優(yōu)選其中，(平衡)含水率小于5% (w/w)，更優(yōu)選小于3% (w/w),最優(yōu)選小于2.5% (w/w)。
[0030]優(yōu)選在本發(fā)明又一方面的應用中，含L-賴氨酸硫酸鹽的飼料添加劑是本發(fā)明第二方面的顆粒，其用作飼料添加劑。
[0031]本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明的產品抗吸濕性佳，使得產品中的含水率降低50%以上，適合于在我國南北方廣大地區(qū)長期儲存、運輸和使用；本發(fā)明的產品作為L-賴氨酸飼料，安全可靠，功效有所提升；本發(fā)明的發(fā)酵方法實施步驟簡單，其中僅使用一次發(fā)酵，即可獲得相應氨基酸種類的產品，其中無安全隱患；本發(fā)明的發(fā)酵方法分配使用柱層析，節(jié)約了生產成本，而且賴氨酸純度達到目前已經銷售的部分賴氨酸產品的純度，便于商業(yè)推廣；另外，本發(fā)明的發(fā)酵方法適應性強，通過經過純化的上清液的比例，可以調節(jié)本發(fā)明的產品中的賴氨酸濃度，滿足更高純度產品的需求。
[0032]為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。
[0033]另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。
[0034]
【具體實施方式】
[0035]以下通過實施例進一步說明本發(fā)明的內容。如未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學出版社)、 《微生物學實驗(第4版)》(高等教育出版社)以及相應儀器和試劑的廠商說明書等參考。
[0036]實施例1 RNA聚合酶sigma-32因子基因構建體的制備
根據 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)的蛋白登錄號 AAB18436.1 的氨基酸序列，本發(fā)明人設計了適度表達型密碼子(非表達量優(yōu)化密碼子)，并通過商業(yè)途徑委托上海生工生物技術有限公司合成編碼RNA聚合酶sigma-32因子的基因并構建入大腸桿菌表達質粒pET-20b(+)(可購自美國Novagen公司，商品編號Cat.N0.69739-3)中?？寺∵^程參照《分子克隆實驗指南》以及所用商品化試劑的操作指南進行，簡要過程如下:
通過DNA自動合成儀，合成RNA聚合酶sigma-32因子基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(購自TaKaRa公司)將這些核酸片段的5’端進行磷酸化，然后等摩爾比混合這5個核酸片段后于65°C變性5分鐘，退火降溫至16°C，加入T4 DNA連接酶(購自TaKaRa公司)連接12小時。然后，取I μ L上述連接產物在50 μ L反應體積中進行PCR擴增，其中正向引物如序列表的SEQ ID No: 3所示(引入了 EcoR I內切酶位點)、反向引物如序列表的SEQ IDΝο:4所示(引入了 Xho I內切酶位點)，反應條件為:以94° C變性4分鐘，然后以94° C變性30秒、63° C退火60秒并72° C延伸35秒進行35個循環(huán)，最后以72° C延伸4分鐘并降溫至4° C。
[0037]瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產物，回收約900bp大小的片段，用EcoR I和XhoI雙酶切該片段，并與經這兩個內切酶酶切的pET-20b(+)質粒用T4 DNA連接酶進行連接，轉化入大腸桿菌ToplO F’中。挑出陽性克隆，抽提出其中的質粒，經測序驗證，相應核苷酸序列如本發(fā)明人設計的SEQ ID No:2所示，編碼了如SEQ ID No:1所示的RNA聚合酶sigma-32因子，由公司將構建好的質粒(命名為pET-sigma)寄回。
[0038]實施例2大腸桿菌發(fā)酵生產L-賴氨酸
對中國專利第94194962號所述的方法構建的產L-賴氨酸的大腸桿菌菌株W3110(tyrA)/pCABD2，轉化pET-sigma質粒，經鑒定獲得轉化陽性克隆(命名% W3110(tyrA)/pCABD2-sigma)后，將菌株 W3110(tyrA)/pCABD2 和 W3110 (tyrA)/pCABD2-sigma分別參照中國專利第03120099號進行賴氨酸發(fā)酵實驗。簡而言之，將菌株接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達到0.35，以5%的接種量接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基配方為:100g葡萄糖，60g (NH4)2SO4, 50g CaCO3, 35mL蛋白胨-B (SoyProtein Enzymatic Hydrolysate,購自上海信然生物技術有限公司，總氮含量不低于3%),Ig KH2PO4,400mg MgSO4.7H20，200mg L-甲硫氨酸，IOmg FeSO4.7H20，8.1mg MnSO4.4Η20,300 μ g生物素和200 μ g維生素BI，用Tris-HCl調節(jié)至pH7)中以36°C振蕩(250rpm)培養(yǎng)72小時。然后，離心收集培養(yǎng)基上清液(發(fā)酵液)，用HPLC定量上清液中的L-賴氨酸含量以及其他成分。結果如表I所示，相對于W3110(tyrA)/pCABD2的發(fā)酵液，W3110(tyrA)/pCABD2-sigma的賴氨酸含量略有下降，但其他氨基酸的種類和比例明顯提高，其他雜質(高于氨基酸分子量的雜質(糖、多糖、肽和蛋白)和低于氨基酸分子量的雜質(無機鹽))的含量基本不變，因此兩者發(fā)酵產物的性質如果有不同，估計是歸因于其他氨基酸的種類和比例。
[0039]表I發(fā)酵液中的成分比較
【權利要求】
1.發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產品的方法，其包括:(1)將編碼氨基酸序列如SEQID No:1所示的蛋白或其變體的多核苷酸導入產L-賴氨酸的菌；(2)在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng)步驟(I)獲得的菌，并收集培養(yǎng)的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸:賴氨酸51~55份，優(yōu)選為51.5~53.5份；天冬氨酸1.2-1.8份，優(yōu)選為1.45-1.6份；蘇氨酸0.8-1.1份，優(yōu)選為0.9-1份；絲氨酸0.4~0.65份，優(yōu)選為0.5~0.6份；谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.2~2.6份；甘氨酸0.75-1.1份，優(yōu)選為0.85-1份；丙氨酸1.2-1.6份，優(yōu)選為1.3-1.5份；纈氨酸0.75-1.1份，優(yōu)選為0.85-1份；甲硫氨酸0.3~0.5份，優(yōu)選為0.35~0.48份；異亮氨酸0.45~0.75份，優(yōu)選為0.55~0.65份；亮氨酸廣1.5份，優(yōu)選為1.2-1.35份；酪氨酸0.5-0.8份，優(yōu)選為0.6-0.75份；苯丙氨酸0.5-0.8份，優(yōu)選為0.6-0.7份；組氨酸0.8-1.2份，優(yōu)選為0.9-1.05份；和，精氨酸，0.9~1.3份，優(yōu)選為1~1.2份；(3)取通過步驟(2)制備的上清液，進行純化，得到賴氨酸純度提高的級份，優(yōu)選級份中賴氨酸純度提高至75~95% (w/w)，更優(yōu)選為76~92.6% (w/w)，更加優(yōu)選為78~83% (w/w)，最優(yōu)選為 80.7% (w/w)；(4)另取通過步驟(2)制備的上清液，加入硫酸，并任選進行濃縮，得到酸化的上清液；和(5)將步驟(3)獲得的級份加入硫酸，并噴入干燥機，在干燥機內形成顆粒核心，而后向該干燥機噴入步驟(4)獲得的酸化的上清液，包裹上述顆粒核心，然后干燥至含水率小于3% (w/w)。
2.權利要求1所述的方法，其中純化是層析純化，優(yōu)選是凝膠過濾層析純化，更優(yōu)選是Sephadex G-10 層析純化。
3.權利要求1所述的方法，其中，步驟(3)中所取的通過步驟(2)制備的上清液與步驟(4)中所另取的通過步驟(2)制備的上清液的體積比為0.5-1.5:2~4，優(yōu)選為0.75-1.25:2.5-3.5，更優(yōu)選為1:3。
4.權利要求1所述的方法，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
5.含L-賴氨酸硫酸鹽的顆粒(其優(yōu)選是飼料添加劑顆粒)，其包括顆粒核心和包裹該核心的外層，其中顆粒核心的L-賴氨酸含量為6(T72% (w/w)，優(yōu)選為70.6% (w/w)，更優(yōu)選為62~65% (w/w)，最優(yōu)選為63.5% (w/w)，外層的L-賴氨酸含量為51~55% (w/w)，優(yōu)選% 51.5~53.5% (w/w)，更優(yōu)選為 52.3% (w/w)。
6.權利要求5所述的顆粒,其含水率小于5%(w/w),優(yōu)選小于3% (w/w),更優(yōu)選小于.2.5% (w/w)。
7.權利要求5所述的顆粒，其是由權利要求f4之任一所述的方法制備的。
8.含L-賴氨酸硫酸鹽的顆粒核心(其優(yōu)選是飼料添加劑顆粒核心)在制備含水率小于.5% (w/w)(優(yōu)選小于3% (w/w),更優(yōu)選小于2.5% (w/w))的含L-賴氨酸硫酸鹽的飼料添加劑中的應用，其中所述含L-賴氨酸硫酸鹽的顆粒核心的L-賴氨酸含量為60-72%(w/w)，優(yōu)選為61-70.6% (w/w)，更優(yōu)選為62-65% (w/w)，最優(yōu)選為63.5% (w/w)。
9.權利要求8所述 的應用，其中所述含L-賴氨酸硫酸鹽的顆粒核心是由權利要求1-4之任一所述的方法的步驟(1)、(2)、(3)和(5)制備的。
10.權利要求8所述的應用，其中所述含L-賴氨酸硫酸鹽的飼料添加劑是權利要求.5-7之任一所述的顆粒。
【文檔編號】C12N15/70GK103451221SQ201310403477
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年11月7日 優(yōu)先權日:2012年11月7日
【發(fā)明者】馬吉銀, 陳崇安, 孟剛 申請人:寧夏伊品生物科技股份有限公司