一種中國對蝦dwd抗菌肽分子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，還公開了該DWD抗菌肽在制備抗菌蛋白與蛋白酶抑制劑蛋白方面的應用。利用本發(fā)明制備的重組中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結構域（DWD）抗菌肽能夠直接抑制常見細菌的生長，而且可以抑制細菌生長過程中分泌的蛋白酶的活性，可以在食品抗菌生物試劑、醫(yī)用抗生素替代品方面具有較大的應用前景。
【專利說明】—種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結構域(DWD)的抗菌肽分子的制備方法，以及這種DWD抗菌肽分子的抑菌活性與蛋白酶抑制劑活性的應用，屬于基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]長期以來，在我國食品和藥品行業(yè)存在著一個難以解決的問題，那就是食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)廣泛使用的保鮮劑、抗菌劑、抗生素帶來的嚴重后果。食品行業(yè)目前廣泛使用的保鮮劑、抗菌劑多數屬于化學藥品和試劑，這些化學藥品和試劑與食品的包裝存在于一個空間，一旦被人體吸收將造成十分不良的后果；醫(yī)藥行業(yè)被廣泛使用的抗生素，目前已經暴露出了濫用抗生素從而不斷刺激病菌浸染和致病能力增強的后果，因此，在食品和藥品行業(yè)尋找綠色、安全、對人體健康沒有影響的生物類抗菌物質，已經是一個科學研究的熱點問題了。
[0003]在動物的進化史上，低等的動物不像我們人類具有特別發(fā)達的后天獲得性免疫系統(tǒng)，它們僅僅具有一個固有的、特定的先天免疫系統(tǒng)，正是因為這個較為低等的先天免疫系統(tǒng)的防御功能，才使得數量眾多的、進化地位低等的無脊椎動物進化到今天仍然存在于地球上，這也說明了這個低等的先天免疫系統(tǒng)防御功能的強大之處。通過不斷研究，存在于低等無脊椎動物體內先天免疫系統(tǒng)的神秘面紗逐漸被揭開，原來在先天免疫系統(tǒng)中主要存在著細胞免疫和體液免疫兩種方式，當病毒、細菌、真菌入侵這類動物機體的時候，這兩種免疫途徑幾乎是同時發(fā)揮功能的。其中，值得一提的是先天免疫系統(tǒng)體液免疫途徑中的抗菌肽分子是清除入侵細菌和真菌的主要免疫效應分子，而且，抗菌肽分子幾乎是體液免疫途徑中多種信號傳導途徑的最后表達出來的那個執(zhí)行清除功能的效應分子，針對革蘭氏陽性細菌、針對革蘭氏陰性細菌以及針對真菌入侵的各種信號傳導途徑，通過免疫刺激信號的逐級傳遞和放大，最終激活了相關抗菌肽基因的轉錄與翻譯，從而形式抗菌功能。因此，抗菌肽分子表達量的高低，直接關系到病原是否能夠被徹底清除。
[0004]在眾多抗菌肽分子中，有一類分子比較特別，這類抗菌肽分子的典型特點就是存在著由8個半胱氨酸殘基形成的4對二硫鍵而折疊形成的一個球狀實體結構域,這個結構域被稱為乳清酸性蛋白結構域，簡稱WAP結構域，在不同的分子中WAP結構域的數量有所不同，常見的是存在一個和兩個WAP結構的抗菌肽分子。這類具有乳清酸性蛋白結構域的抗菌肽分子在發(fā)揮清除細菌作用的過程，主要是通過分子的活性位點針對細菌細胞壁的特殊結構進行破壞，從而引起細菌細胞壁產生“漏洞”將細胞內溶物釋放出來，引起細菌自身的死亡，所以，這類抗菌肽的抗菌活性具有廣泛的作用范圍。所以，這類抗菌肽具有如下的優(yōu)點:第一，作用范圍廣。第二，作用條件溫和。第三，不會引起細菌的抗藥性問題。第四，對人體無危害，因為它屬于蛋白質物質，進入人的腸道之后便可被蛋白酶徹底水解形成氨基酸營養(yǎng)物質。
[0005]中國對蝦是我國稀有的水產產品，集中分布在我國東部沿海，也是我國主要的水產經濟動物。中國對蝦在進化過程中，面臨白斑綜合癥病毒以及各種細菌的侵染能夠保持以較大的數量分布在我國東部沿海水域，說明其抗病毒、抗細菌、抗真菌能力特別強大。因此，如果將中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結構域(DWD)的抗菌肽在體外進行重組表達，獲得具有抗菌活性和蛋白酶抑制劑活性的重組分子，它在食品抗菌、醫(yī)用抗生素替代方面具有較大的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種中國對蝦具有雙乳清酸性蛋白結構域(DWD)抗菌肽的制備方法，同時提供該DWD抗菌肽抑菌活性和蛋白酶抑制劑活性的研究方法。
[0007]技術解決方案:
[0008]本發(fā)明的具體方法如下:
[0009]I)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段的克隆:取冷凍保存的中國對蝦3只-5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產品)進行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，具體方法參照試劑盒說明書。之后，以lyL-2yL中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作為擴增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段的一對引物，PCR反應的程序為:94°C預變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa公司產品)進行目的片段的純化與回收，獲得中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段溶解液；
[0010]2)中國對蝦DWD抗菌肽基因的原核表達載體的構建:取步驟(I)的中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段溶解液16 μ L，進行內切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達片段為16 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質粒載體溶解液10 μ L進行內切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，20 μ L的體系中質粒載體溶解液為10 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各I μ L，IOXH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進行10h_12h連接，獲得連接產物；
[0011]3)轉化大腸桿菌克隆菌株DH5CI感受態(tài)細胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)的連接產物轉化大腸桿菌克隆菌株DH5a感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產品)，主要是利用“熱激法”進行轉化，要求卡那霉素的最終質量體積濃度為25 μ g/ μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物 DWD-F:5'-tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5'-tactea ctc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應的一對引物,進行陽性克隆子的篩選，PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，進行LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性菌株菌液；
[0012]4)質粒提取:取步驟(3)的陽性菌株菌液lmL，利用質粒DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產品)進行質粒提取，具體提取方法可以參照試劑盒說明書，獲得陽性重組質粒;
[0013]5)轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細胞與陽性表達菌株的篩選:將步驟(4)的陽性重組質粒，利用“熱激法”轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產品)，要求卡那霉素的最終質量體積濃度為25 μ g/μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以前引物 DWD-F:5'_tac tea gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5'-tactea ctc RaR tct gcg ctt agacgg act g-3'作為菌落PCR反應的一對引物,進行陽性表達菌株的篩選，PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進行液體震蕩培養(yǎng)10h_12h，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rp m-200rpm，培養(yǎng)12h_14h，獲得陽性表達菌株菌液；
[0014]6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導表達與親和純化:將步驟(5)的陽性表達菌株菌液作為誘導表達的母液，從中取ImL菌液在無菌條件下轉接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質量體積濃度為50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm條件下轉培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進行誘導表達，IPTG最終物質的量濃度為0.3mmol/L,誘導表達的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導3h_4h,之后，6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進行菌體沉淀的超聲波破碎50min (功率200w,超聲破碎Is、間歇2s,全程50min),結束后12000rpm高速離心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱(上海生工生物工程有限公司產品)進行重組蛋白質的親和純化，方法可以參照試劑盒說明書，最后根據蛋白質電泳的結果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質IXelute洗脫合并液；
[0015]7)中國對蝦DWD抗菌肽液體抑菌功能檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質IXelute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對IXPBS緩沖液進行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進行液體抑菌功能檢測，方法為:選擇大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為液體抑菌試驗的菌種，將這些菌種事先進行3mL-5mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化10h-12h，之后，分別取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為對照樣品，分別另取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof?離心管中作為液體抑菌管，之后要在液體抑菌管里面加入100 μ L的經過濾膜過濾處理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm條件下搖菌培養(yǎng)5h-6h，之后利用分光光度計測定OD595的數值，最后以對照管的OD595作為對照，利用excel分析軟件進行數據處理，并且利用t-test檢驗方法分析顯著性差異；
[0016]8)中國對蝦DWD抗菌肽蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質IXelute洗脫合并液之后利用截留孔徑為3500Da的透析袋對IXPBS緩沖液進行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進行蛋白酶抑制劑活性的檢測，具體方法為:首選在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細菌——枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細菌)和綠膿桿菌(革蘭氏陰性細菌)，在LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)(不加抗生素)，然后用經過滅菌的牙簽挑去細菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經過滅菌的濾紙小圓片(直徑為8mm-10mm)，然后，預留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經過濾膜過濾除菌的DWD重組蛋白透析液、過濾除菌的I XPBS緩沖液、過濾除菌的BSA蛋白溶液(與DWD重組蛋白透析液的蛋白質濃度相同)，28°C條件下過夜培養(yǎng)，觀察透明圈出現的情況。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點:本發(fā)明涉及的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)重組表達的DWD抗菌肽分子，能夠抑制細菌的生長，也可以抑制細菌生長過程分泌的蛋白酶的活性，可以成為抗生素的良好替代產品，因此，在食品抗菌、醫(yī)用抗生素替代方面具有較大的應用潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]附圖1為重組中國對蝦DWD抗菌肽蛋白的誘導表達與親和純化的蛋白電泳結果圖；
[0019]附圖2為重組中國對蝦DWD抗菌肽蛋白的液體抑菌結果圖；
[0020]附圖3為重組中國對蝦DWD蛋白的枯草芽孢桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結果圖；
[0021]附圖4為重組中國對蝦DWD蛋白的綠膿桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結果圖。
【具體實施方式】
`[0022]實施例1:中國對蝦DWD抗菌肽的重組表達與液體抑菌活性檢測
[0023]圖1中，I為誘導前大腸桿菌總蛋白，2為誘導后大腸桿菌總蛋白，3為純化后的重組中國對蝦DWD抗菌肽蛋白，4為標準蛋白質分子量。
[0024]圖2中，I為大腸桿菌對照組，2為大腸桿菌抑菌試驗組，3為綠膿桿菌對照組，4為綠膿桿菌抑菌試驗組，5為金黃色葡萄球菌對照組，6為金黃色葡萄球菌抑菌試驗組，7為白色念珠菌對照組，8為白色念珠菌抑菌試驗組，*表示數據之間存在顯著性差異。
[0025]I)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段的克隆:取冷凍保存的中國對蝦3只_5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產品)進行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，具體方法參照試劑盒說明書。之后，以lyL-2yL中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作為擴增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段的一對引物，PCR反應的程序為:94°C預變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa公司產品)進行目的片段的純化與回收，方法為:將切下的膠帶放入潔凈的1.5mL離心管中，加入400 μ L solution SN溶解液，在55°C -65°C條件下孵育5min-10min,間隔要求每間隔Imin晃動一次離心管，使膠帶充分溶解，之后將3S柱放回同一個收集管中，繼續(xù)加入500 μ L Wash Solution洗脫溶液，IOOOOrpm離心Imin,倒去收集管中的廢液，重復洗脫一次，倒去收集管中的廢液，將3S柱放回同一個收集管中，IOOOOrpm離心2min，將洗滌液充分去掉，將3S柱放入一個新的滅菌的RNase-Freel.5mL潔凈的離心管中，加入20 μ L-30 μ L無RNA酶的滅菌水，在超凈工作臺中室溫條件下放置2min，并且使離心管蓋子敞開，最后，IOOOOrpm條件下離心Imin,將目的產物收集在離心管中，獲得DWD抗菌肽基因表達片段溶解液；
[0026]2)中國對蝦具DWD抗菌肽基因的原核表達載體的構建:取步驟(I)的DWD抗菌肽基因表達片段溶解液16 μ L，進行內切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達片段為16 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質粒載體溶解液10 μ L進行內切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，20 μ L的體系中質粒載體溶解液為10 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各I μ L，IOXH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進行連接10h_12h，獲得連接產物；
[0027]3)轉化大腸桿菌克隆菌株DH5ci感受態(tài)細胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)中的連接產物轉化大腸桿菌克隆菌株DH5a感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產品)，主要是利用“熱激法”進行轉化，卡那霉素的最終質量體積濃度為25μ g/μ L，固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DffD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac teaetc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應的一對引物,進行陽性克隆子的篩選，PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，進行LB液體培養(yǎng) 基震蕩培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性克隆菌株菌液；
[0028]4)質粒提取:取步驟(3)的陽性克隆菌株菌液lmL，利用質粒DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產品)進行質粒提取，具體提取方法為:按照質粒提取試劑盒的要求，取陽性克隆菌株菌液ImL,在6000rpm條件下低速離心3min-5min,去掉上清，收集細胞沉淀，并且室溫條件下立即加入試劑盒中的Solution I溶液300yL (此溶液需要存放在4°C環(huán)境)，馬上用渦旋震蕩器將細胞沉淀充分振蕩混勻，繼續(xù)加入試劑盒中的Solution II溶液300 μ L,要求輕輕混勻至液體清亮，室溫條件下靜置3min-5min,之后繼續(xù)緩慢加入試劑盒中的Solution III溶液300 μ L,要求立即混勻，放在冰浴中5min_10min后在室溫條件下，12000rpm高速離心5min-10min,并且將上清轉移到新的1.5mL潔凈的離心管中，并且加入等體積的異丙醇，充分混勻之后再冰浴中放置5min-10min，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心10min-15min后，去掉上清,用70%乙醇溶液洗漆沉淀2次-3次，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心5min-10min,棄去上清,室溫條件下在超凈工作臺中干燥質粒沉淀，最后，加入20 μ L-30 μ L滅菌水進行溶解，獲得陽性重組質粒；
[0029]5)轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細胞與陽性表達菌株的篩選:將步驟(4 )的陽性重組質粒，利用“熱激法”轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3 )感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產品)，那霉素的最終質量體積濃度為25 μ g/ μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后弓 I物 DWD-R:5 -tac tea ctc gagtct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應的一對引物,進行陽性克隆子的篩選,PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應產物進行質粒體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進行液體震蕩培養(yǎng)，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rpm-200rpm,培養(yǎng)12h-14h，獲得陽性表達菌株菌液；
[0030]6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導表達與親和純化:將步驟(5)的陽性表達菌株菌液作為誘導表達的母液，從中取ImL菌液在無菌條件下轉接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質量體積濃度為50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm條件下轉培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進行誘導表達，IPTG最終物質的量濃度為0.3mmol/L,誘導表達的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導3h_4h,之后，6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進行菌體沉淀的超聲波破碎50min (功率200w,超聲破碎Is、間歇2s,全程50min),結束后12000rpm高速離心收集上清液，取3mL-5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱(上海生工生物工程有限公司產品)進行重組蛋白質的親和純化，方法為:取出4°C條件下在20%酒精溶液中保存的His-tag凝膠親和柱，在室溫下將酒精流通至膠面之后，用3倍-5倍柱體積的去離子水充分洗柱，再用3倍-5倍柱體積的I XPBS緩沖液充分洗脫柱子，然后用5倍-10倍柱體積的試劑盒中的I X charge Buffer溶液流通洗柱,再用3倍-5倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液流通洗柱，之后就是反復上樣，要求用3mL-5mL超聲波破碎后的高速離心上清液反復流通柱子3次-5次，目的是讓重組蛋白與柱子凝膠顆粒充分結合，之后，用5倍-10倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液緩慢流通柱子,用3倍-5倍柱體積的I Xwash Buffer溶液緩慢流通柱子來除掉雜蛋白，之后，用6mL的I X elute洗脫溶液進行樣品的洗脫，并且用6只1.5mL eppendof離心管收集蛋白洗脫液,每管收集ImL,純化結果用質量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最后根據蛋白質電泳的結果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質I X elute洗脫合并液；
[0031]7)中國對蝦DWD抗菌`肽液體抑菌功能檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質IXelute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對IXPBS緩沖液進行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進行液體抑菌功能檢測，方法為:選擇大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為液體抑菌試驗的菌種，將這些菌種事先進行3mL-5mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化10h-12h，之后，分別取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為對照樣品，分別另取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof?離心管中作為液體抑菌管，之后要在液體抑菌管里面加入100 μ L的經過濾膜過濾處理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm條件下搖菌培養(yǎng)5h-6h，之后利用分光光度計測定OD595的數值，最后以對照管的OD595作為對照，利用excel分析軟件進行數據處理，并且利用t-test檢驗方法分析顯著性差異，試驗結果如圖2所示；
[0032]實施例2:中國對蝦DWD抗菌肽的重組表達與蛋白酶抑制劑活性檢測
[0033]圖3中，I為濾紙片上不加任何物質的對照，2為加15 μ LlXPBS的對照，3為加15 μ L BSA蛋白透析液對照，4為加15 μ L重組DWD蛋白透析液。
[0034]圖4中，I為濾紙片上不加任何物質的對照，2為加15 μ LlXPBS的對照，3為加15 μ L BSA蛋白透析液對照，4為加15 μ L重組DWD蛋白透析液。
[0035]I)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段的克隆:取冷凍保存的中國對蝦3只-5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產品)進行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，具體方法參照試劑盒說明書。之后，以lyL-2yL中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作為擴增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段的一對引物，PCR反應的程序為:94°C預變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa公司產品)進行目的片段的純化與回收，方法為:將切下的膠帶放入潔凈的1.5mL離心管中，加入400 μ L solution SN溶解液，在55°C -65°C條件下孵育5min-10min,間隔要求每間隔Imin晃動一次離心 管，使膠帶充分溶解，之后將3S柱放回同一個收集管中，繼續(xù)加入500 μ L Wash Solution洗脫溶液，IOOOOrpm離心Imin,倒去收集管中的廢液，重復洗脫一次，倒去收集管中的廢液，將3S柱放回同一個收集管中，IOOOOrpm離心2min，將洗滌液充分去掉，將3S柱放入一個新的滅菌的RNase-Freel.5mL潔凈的離心管中，加入20 μ L-30 μ L無RNA酶的滅菌水，在超凈工作臺中室溫條件下放置2min，并且使離心管蓋子敞開，最后，IOOOOrpm條件下離心Imin,將目的產物收集在離心管中，獲得DWD抗菌肽基因表達片段溶解液；
[0036]2)中國對蝦具DWD抗菌肽基因的原核表達載體的構建:取步驟(I)的DWD抗菌肽基因表達片段溶解液16 μ L，進行內切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達片段為16 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質粒載體溶解液10 μ L進行內切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，20 μ L的體系中質粒載體溶解液為10 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進行過夜連接10h_12h，獲得連接產物；
[0037]3)轉化大腸桿菌克隆菌株DH5ci感受態(tài)細胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)中的連接產物轉化大腸桿菌克隆菌株DH5a感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產品)，主要是利用“熱激法”進行轉化，卡那霉素的最終質量體積濃度為25μ g/μ L，固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DffD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac teaetc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應的一對引物,進行陽性克隆子的篩選，PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，進行LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性克隆菌株菌液；[0038]4)質粒提取:取步驟(3)的陽性克隆菌株菌液lmL，利用質粒DNA小量提取試劑盒(TaKaRa公司產品)進行質粒提取，具體提取方法為:按照質粒提取試劑盒的要求，取陽性克隆菌株菌液ImL,在6000rpm條件下低速離心3min-5min,去掉上清，收集細胞沉淀，并且室溫條件下立即加入試劑盒中的Solution I溶液300 μ L (此溶液需要存放在4°C環(huán)境)，馬上用渦旋震蕩器將細胞沉淀充分振蕩混勻，繼續(xù)加入試劑盒中的Solution II溶液300 μ L,要求輕輕混勻至液體清亮，室溫條件下靜置3min-5min,之后繼續(xù)緩慢加入試劑盒中的Solution III溶液300 μ L,要求立即混勻，放在冰浴中5min_10min后在室溫條件下，12000rpm高速離心5min-10min,并且將上清轉移到新的1.5mL潔凈的離心管中，并且加入等體積的異丙醇，充分混勻之后再冰浴中放置5min-10min，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心10min-15min后，去掉上清,用70%乙醇溶液洗漆沉淀2次-3次，室溫條件下10000rpm-12000rpm離心5min-10min,棄去上清,室溫條件下在超凈工作臺中干燥質粒沉淀，最后，加入20 μ L-30 μ L滅菌水進行溶解，獲得陽性重組質粒；
[0039]5)轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細胞與陽性表達菌株的篩選:將步驟(4 )的陽性重組質粒，利用“熱激法”轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3 )感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產品)，那霉素的最終質量體積濃度為25 μ g/ μ L，將固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，之后，挑取固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:
5-tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物DWD-R:5 -tac tea ctc gagtct gcg ctt aga egg actg-3'作為菌落PCR反應的一對引物,進行陽性克隆子的篩選,PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應產物進行質粒體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進行液體震蕩培養(yǎng)，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rpm-200rpm,培養(yǎng)12h-14h，獲得陽性表達菌株菌液；
[0040]6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導表達與親和純化:將步驟(5)的陽性表達菌株菌液作為誘導表達的母液，從中取ImL菌液在無菌條件下轉接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質量體積濃度為50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm條件下轉培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進行誘導表達，IPTG最終物質的量濃度為0.3mmol/L,誘導表達的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導3h_4h,之后，6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進行菌體沉淀的超聲波破碎50min (功率200w,超聲破碎Is、間歇2s,全程50min),結束后12000rpm高速離心收集上清液，取3mL-5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱(上海生工生物工程有限公司產品)進行重組蛋白質的親和純化，方法為:取出4°C條件下在20%酒精溶液中保存的His-tag凝膠親和柱，在室溫下將酒精流通至膠面之后，用3倍-5倍柱體積的去離子水充分洗柱，再用3倍-5倍柱體積的I XPBS緩沖液充分洗脫柱子，然后用5倍-10倍柱體積的試劑盒中的I X charge Buffer溶液流通洗柱,再用3倍-5倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液流通洗柱，之后就是反復上樣，要求用3mL-5mL超聲波破碎后的高速離心上清液反復流通柱子3次-5次，目的是讓重組蛋白與柱子凝膠顆粒充分結合，之后，用5倍-10倍柱體積的I Xbinding Buffer溶液緩慢流通柱子,用3倍-5倍柱體積的I Xwash Buffer溶液緩慢流通柱子來除掉雜蛋白，之后，用6mL的IXelute洗脫溶液進行樣品的洗脫，并且用6只1.5mL eppendof離心管收集蛋白洗脫液,每管收集ImL,純化結果用質量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最后根據蛋白質電泳的結果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質I X elute洗脫合并液；
[0041]7)中國對蝦DWD抗菌肽蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質I X elute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩沖液進行24h透析，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，透析液經過12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進行蛋白酶抑制劑活性的檢測，具體方法為:首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細菌——枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細菌)和綠膿桿菌(革蘭氏陰性細菌)，在LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)(不加抗生素)，然后用經過滅菌的牙簽挑去細菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經過滅菌的濾紙小圓片(直徑為8mm-10mm)，然后，預留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經過濾膜過濾除菌的DWD重組蛋白透析液、過濾除菌的I XPBS緩沖液、過濾除菌的BSA蛋白溶液(與DWD重組蛋白透析液的蛋白質濃度相同)，28°C條件下過夜培養(yǎng)，之后，觀察透明圈出現的情況，試驗結果如圖3和圖4所示。·
【權利要求】
1.一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:包含以下步驟: .1)中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段的克隆:取中國對蝦3只-5只，無菌條件下解剖收集肝臟組織供100mg-150mg，利用動物基因組DNA小量提取試劑盒進行中國對蝦肝臟基因組DNA的提取，之后，以I μ L-2 μ L中國對蝦肝臟基因組DNA作為模板，進行PCR反應來擴增中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，并且在凝膠成像儀紫外燈下將目的片段所在凝膠條帶切下回收，利用DNA膠回收試劑盒進行目的片段的純化與回收，獲得中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段溶解液； . 2)中國對蝦DWD抗菌肽基因原核表達載體的構建:取步驟(I)的中國對蝦DWD抗菌肽基因表達片段溶解液16 μ L，進行內切酶EcoR I和Xho I的雙酶切處理，20 μ L的體系中基因表達片段為16 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，同時，取大腸桿菌pET_28a質粒載體溶解液10 μ L進行內切酶EcoR I和Xho I雙酶切處理，.20 μ L的體系中質粒載體溶解液為10 μ L，內切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer緩沖液為2 μ L，無菌水6 μ L，之后，取雙酶切處理的DWD抗菌肽基因表達片段6 μ L，雙酶切處理后的大腸桿菌pET-28a質粒載體溶解液2 μ L，再加T4DNA連接酶I μ L和IOX ligationbuffer緩沖液I μ L，在16°C金屬浴中進行連接10h_12h，獲得連接產物； . 3)轉化大腸桿菌克隆菌株DH5ci感受態(tài)細胞與陽性克隆子的篩選:將步驟(2)中的連接產物轉化大腸桿菌克隆菌株DH5 α感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產品)，主要是利用“熱激法”進行轉化，卡那霉素的最終質量體積濃度為25 μ g/ μ L，固體LB培養(yǎng)基平板在37°C條件下培養(yǎng)10h-12h，之后，挑去固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:5'-tactea gaattc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tctgcg ctt aga egg act g_3'作為菌落PCR反應的一對引物,進行陽性克隆子的篩選,PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，.72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，進行LB液體培養(yǎng)基震蕩 培養(yǎng)10h-12h，獲得陽性克隆菌株菌液； 4)質粒提取:取步驟(3)中的陽性菌株菌液lmL，利用質粒DNA小量提取試劑盒進行質粒提取，獲得陽性重組質粒； 5)轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)感受態(tài)細胞與陽性表達菌株的篩選:將步驟(4)的陽性重組質粒，利用“熱激法”轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，卡那霉素的最終質量體積濃度為25μ g/μ L，固體LB培養(yǎng)基要求在37°C條件下過夜培養(yǎng)10h_12h，之后，挑去固體LB培養(yǎng)基平板表面的單個白色菌落，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg agaggc ccg cta aag c_3 和后弓丨物DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt aga eggact g-3'作為菌落PCR反應的一對引物，進行陽性克隆子的篩選，PCR反應的程序為:94°C預變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進行液體震蕩培養(yǎng)，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為:37°C，180rpm-200rpm，培養(yǎng)12h_14h，獲得陽性表達菌株菌液； 6)中國對蝦DWD抗菌肽的誘導表達與親和純化:將步驟(5)的陽性表達菌株菌液作為誘導表達的母液，從其中取ImL菌液在無菌條件下轉接到一瓶IOOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，要求卡那霉素的最終質量體積濃度為50 μ g/mL,在37°C、180rpm-200rpm條件下轉培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進行誘導表達，IPTG最終物質的量濃度為0.1mmol/L-0.5mmol/L,誘導表達的條件為在37°C、180rpm-200rpm條件下誘導3h_4h,之后,6000rpm低速離心收集菌體，用20mLlXPBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進行菌體沉淀的超聲波破碎40min-60min,結束后10000rpm-12000rpm高速離心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱進行重組蛋白質的親和純化，最后根據蛋白質電泳的結果合并洗脫液，得到目的重組蛋白質IXelute洗脫合并液； 7)中國對蝦DWD抗菌肽液體抑菌功能檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質IXelute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩沖液進行24h透析，12h期間更換一次I XPBS緩沖液，透析液經過10000rpm-12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進行液體抑菌功能檢測； 8)中國對蝦DWD抗菌肽蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質I X elute洗脫合并液利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩沖液進行24h透析，12h期間更換一次I XPBS緩沖液，透析液經過10000rpm-12000rpm高速離心之后的上清液作為被檢測樣品進行蛋白酶抑制劑活性的檢測。
2.根據權利要求1所述的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:以前引物 DWD-F:5'-tac tea gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5 -tac tea ctcgag tct gcg ctt aga egg act g-3作為擴增中國對奸DWD抗菌妝基因表達片段的一對引物，PCR反應的程序為:94°C預變性3min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 45s，最后 72°C后延伸 5min_10min。
3.根據權利要求1所述的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:選擇大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為液體抑菌試驗的菌種，將這些菌種事先進行3mL-5mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化10h_12h，之后，分別取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為對照樣品，分別另取ImL菌液放入潔凈的1.5mL eppendof離心管中作為液體抑菌管，之后要在液體抑菌管里面加入100 μ L的經過濾膜過濾處理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm條件下搖菌培養(yǎng)5h_6h，之后利用分光光度計測定OD595的數值，最后以對照管的OD595作為對照，利用excel分析軟件進行數據處理，并且利用t-test檢驗方法分析顯著性差異。
4.根據權利要求1所述的一種中國對蝦DWD抗菌肽分子的制備方法，其特征在于:首選在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細菌——枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細菌)和綠膿桿菌(革蘭氏陰性細菌)，在LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)(不加抗生素)，然后用經過滅菌的牙簽挑去細菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經過滅菌的濾紙小圓片(直徑為8mm-10mm)，然后，預留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經過濾膜過濾除菌的DWD重組蛋白透析液、過濾除菌的IXPBS緩沖液、過濾除菌的BSA蛋白溶液(與DffD重組蛋白透析液的蛋白質濃度相同)，28 °C條件下過夜培養(yǎng)，觀察透明圈出現的情況。
【文檔編號】C12Q1/02GK103451188SQ201310403797
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權日:2013年9月6日
【發(fā)明者】杜志強, 王金星, 趙小凡, 張雪峰, 王建英 申請人:內蒙古科技大學