一種應(yīng)用于核酸序列分析中的樣品純化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用于核酸序列分析中的樣品純化方法，可以用較少的時(shí)間，簡(jiǎn)便地從樣品中獲得高純度的目標(biāo)成分，減少檢測(cè)結(jié)果中的干擾峰；同時(shí)又能在不影響檢測(cè)效果的前提下，減少檢測(cè)所需的樣品量以及其它試劑的用量，從而降低核酸序列分析中的成本，有較高的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種應(yīng)用于核酸序列分析中的樣品純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于核酸序列分析中的樣品純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在核酸序列分析中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被廣泛應(yīng)用于各種核酸測(cè)序儀平臺(tái)。經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后獲得的樣品成分復(fù)雜，在用0嫩測(cè)序儀檢測(cè)前必須進(jìn)行純化，并且純化的效果對(duì)于最終的檢測(cè)效果極為重要。目前廣泛采用的乙醇沉淀法，通過(guò)向樣品溶液中加入乙醇，經(jīng)沉淀，離心后實(shí)現(xiàn)樣品中目標(biāo)成分與雜質(zhì)成分分離。該方法比較難獲得純度很高的樣品中的目標(biāo)成分，檢測(cè)結(jié)果中容易出現(xiàn)干擾峰；操作繁瑣，耗時(shí)；需要大量人工操作，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用于核酸序列分析中的樣品純化方法，可以用較少的時(shí)間，簡(jiǎn)便地從樣品中獲得高純度的目標(biāo)成分，減少檢測(cè)結(jié)果中的干擾峰；同時(shí)又能在不影響檢測(cè)效果的前提下，減少檢測(cè)所需的樣品量以及其它試劑的用量，從而降低核酸測(cè)序的成本。
[0004]本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于核酸序列分析中的樣品前處理方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:
(1)將用功能基團(tuán)改性的納米磁珠溶液分散于待純化的樣品溶液中并混合均勻，在室溫下培育5分鐘；
(2)將混合溶液放置于磁力裝置上2-3分鐘；
(3)用移液器將混合溶液中的液體吸干后，再加入乙醇的水溶液，在室溫下培育30秒，再將混合溶液中的液體吸干；
(4)再重復(fù)第3步1次；
(5)撤去磁力裝置，向吸干液體的混合溶液剩余物中加入緩沖液，再混合均勻；
(6)將混合溶液放置于磁力裝置上1分鐘后，將混合溶液中的上清液吸取出來(lái)，可以直接在核酸序列分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。
[0005]所述的方法中，用功能基團(tuán)改性的納米磁珠溶液與待純化的樣品溶液中的體積比為1:1-3:1,用功能基團(tuán)改性的納米磁珠溶液的濃度為101118/1^-1001118/1^。磁珠的直徑為50-800納米，磁珠的組分和重量含量百分比為:氧化釓20-50%，四氧化三鐵20-40%，二氧化硅:10-60%。乙醇水溶液的體積濃度為50%-95%。
[0006]所述的磁力裝置的磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.1-1特斯拉。
[0007]所述的緩沖液的主要成分為水，三羥甲基氨基甲烷和氯化氫；三羥甲基氨基甲烷和氯化氫的摩爾比為1 ；1，邱值在7-9，濃度為0.005-0.0511101/1。操作過(guò)程中，加入緩沖液與待純化的樣品溶液的體積比1:2-1:4。
[0008]所述的待純化樣品為經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者測(cè)序反應(yīng)之后獲得的樣品。測(cè)序前的聚合酶鏈?zhǔn)?(?)反應(yīng)體系參見(jiàn)各種用于核酸序列分析的聚合酶鏈?zhǔn)?(?)反應(yīng)體系，以八81公司的81^76 ^3.1體系為例，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系(10 1x1反應(yīng)體系)的成分為:0.5 —4此0？ 81^76反應(yīng)混合物，0-3 1x1的2丨5乂緩沖溶液，10卿01弓丨物，50-500叩的0嫩模板，加入去離子蒸懼水至10此。
[0009]本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，可以用較少的時(shí)間，簡(jiǎn)便地從樣品中獲得高純度的目標(biāo)成分，減少檢測(cè)結(jié)果中的干擾峰；同時(shí)又能在不影響檢測(cè)效果的前提下，減少檢測(cè)所需的樣品量以及其它試劑的用量，從而降低核酸測(cè)序的成本。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1.反應(yīng)體系的體積為5沿，使用0.5耵81^76 ^3.1進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醇沉淀法進(jìn)行純化的核酸片斷檢測(cè)圖，采用八卯116(1 0108781:61118公司的3730X1核酸序列分析儀進(jìn)行分析。
[0011]圖2.反應(yīng)體系的體積為5沿，使用0.125沿81^76 ^3.1進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用本發(fā)明中的方法進(jìn)行純化的核酸片斷檢測(cè)圖，采用八卯116(1 0108781:61118公司的3730X1核酸序列分析儀進(jìn)行分析。

【具體實(shí)施方式】
[0012]通過(guò)下述實(shí)施例有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但并不限制發(fā)明的內(nèi)容。
[0013]具體實(shí)施中采用八卯116(1 8108781:61118公司的81^76 ^3.1試劑盒，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，結(jié)果用八卯116(1 0108781:61118公司的3730核酸序列分析儀進(jìn)行分析。
[0014]實(shí)施例1對(duì)照實(shí)驗(yàn)
按照八卯116(1 0108781:61118公司的81^76末端染色系統(tǒng)的操作要求，5)^1反應(yīng)體系中應(yīng)加入0.5 1^1 81^1)76 (八卯116(1 8108781:61118公司的試劑)，2卿01引物〈5’ -161^^06^06600^61)，50叩的0嫩模板(普洛麥格公司，113^18重組噬菌體然后直接用去離子蒸餾水稀釋至5叱，進(jìn)行反應(yīng)，用乙醇沉淀法純化后，再用0嫩測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
[0015]反應(yīng)的條件為:在75 0條件下預(yù)熱3分鐘；45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:95 0變性10秒，50 0退火20秒，60 0延伸4分鐘。
[0016]乙醇沉淀法的具體步驟如下:
(1)向待純化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物中加入150沿混合溶液(1-丁醇:無(wú)水乙醇，35%:65^,/^)；
(2)用移液槍吸入壓出混合，確保反應(yīng)產(chǎn)物完全分散在混合溶液中；
(3)室溫下離心30分鐘，離心力為3500噸；
(4)將卩⑶板倒扣在凈化無(wú)塵濾紙上除去上清液；
(5)將？⑶板翻轉(zhuǎn)后放回離心機(jī)，室溫下離心1分鐘，離心力為500(父邑)；
(6)加入150耵洗液，洗液成分為:65%無(wú)水乙醇:35%0.1禮(乙二胺基四乙酸)，室溫下離心10分鐘，離心力為3，500 ( X 0 ；再將板倒扣在凈化無(wú)塵紙上除去上清液；
(7)將步驟6和步驟？重復(fù)操作一次； (8)將？⑶板放回離心機(jī)，室溫下離心1分鐘，離心力為500(父邑)；
(9)干燥后，用上樣緩沖液0嫩II(八卯11也6！11公司)重新溶解，即可進(jìn)行分析。
[0017]結(jié)果見(jiàn)附圖1。
[0018]實(shí)施例2，將實(shí)施例1中的反應(yīng)體系各組分的量降低到1/4，即5叱反應(yīng)體系中應(yīng)加入0.125 1^1 81^1)76 (八卯116(1 8108781:61118公司的試劑)，0.4卿01引物〈5’ -161^^06^06600^61)，12.5叩的0嫩模板(普洛麥格公司，肌3卹18重組噬菌體然后直接用去離子蒸餾水稀釋至5叱，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后采用本發(fā)明的方法進(jìn)行純化，再用0嫩測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0019]？?:??？反應(yīng)的條件與實(shí)施例1中的反應(yīng)條件相同。
[0020]本實(shí)施例中的納米磁珠溶液制備方法如下:
^0.0511101/1^56(:12^^501111, 0.111101/1 的？6?:13 溶液 50?[和 0.111101/1 的(^(勵(lì)3〉3
溶液50此混合均勻，加熱至801，再向溶液中緩慢加入50此0.7^1/1的氫氧化鈉溶液。攪拌30分鐘后，將上述混合溶液加入到5001 0.5001/1正硅酸鈉溶液與5.84^1 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，再向混合溶液中加入0.018磺酸鈉，用此1溶液將邱值調(diào)節(jié)至6.0，待液體成為凝膠后，在2001的烘箱中干燥6小時(shí)，所得樣品粉碎后用去離子蒸餾水洗滌3次。再將所得的樣品粉末加入到5此水和300此甲醇的混合溶液中，與150此甘油混合后，用超聲波處理30分鐘。然后將混合溶液加熱至851攪拌3小時(shí)。冷卻后，用磁力裝置將反應(yīng)體系中的顆粒物質(zhì)吸附到反應(yīng)容器壁，將液體吸干后，移走磁力裝置，加入10001去離子蒸餾水?dāng)嚢韬?，再用磁力裝置將反應(yīng)體系中的顆粒物質(zhì)吸附到反應(yīng)容器壁，將其余液體吸干。最后加入50“ 3%丙二醛磷酸緩沖鹽溶液，磷酸緩沖鹽的濃度為0.1001/1,邱值為7.4),室溫下放置2小時(shí)即可使用。
[0021]本發(fā)明中的純化方法的操作程序如下:
(1)將納米磁珠溶液9叱分散于待純化的樣品溶液中并混合均勻，在室溫下培育5分鐘；
(2)將混合溶液放置于磁力裝置上2-3分鐘；
(3)用移液器將混合溶液中的液體吸干后，再加入150虬乙醇的水溶液(7090,在室溫下培育30秒，再將混合溶液中的液體吸干；
(4)再重復(fù)第3步1次；
(5)撤去磁力裝置，向吸干液體的混合溶液剩余物中加入
0.05001/1,邱8.0),再混合均勻；
(6)將混合溶液放置于磁力裝置上1分鐘后，將混合溶液中的上清液吸取出來(lái)，轉(zhuǎn)移到新板中即可直接在核酸序列分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。
[0022]結(jié)果見(jiàn)附圖2。
[0023]對(duì)比檢測(cè)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明所述方法，將核酸序列分析中各組分的用量降低50%以上，獲得的檢測(cè)結(jié)果也能達(dá)到甚至超過(guò)采用乙醇沉淀法進(jìn)行樣品處理所獲得的檢測(cè)結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種應(yīng)用于核酸序列分析中的樣品前處理方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)將用功能基團(tuán)改性的納米磁珠溶液分散于待純化的樣品溶液中并混合均勻，在室溫下培育5分鐘； (2)將混合溶液放置于磁力裝置上2-3分鐘； (3)用移液器將混合溶液中的液體吸干后，再加入乙醇的水溶液，在室溫下培育30秒，再將混合溶液中的液體吸干； (4)再重復(fù)第3步I次； (5)撤去磁力裝置，向吸干液體的混合溶液剩余物中加入緩沖液，再混合均勻； (6)將混合溶液放置于磁力裝置上I分鐘后，將混合溶液中的上清液吸取出來(lái)，可以直接在核酸序列分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中用功能基團(tuán)改性的納米磁珠溶液與待純化的樣品溶液中的體積比為1:1-3:1，用功能基團(tuán)改性的納米磁珠溶液的濃度為 lOmg/mL-lOOmg/mLo
3.磁珠的直徑為50-500納米，磁珠的組分和重量含量百分比為:氧化釓20-50%，四氧化三鐵20-40%，二氧化硅:10-60%。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，磁力裝置的磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.1-1特斯拉。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，乙醇水溶液的體積濃度為50%-95%。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，加入緩沖液與待純化的樣品溶液的體積比1:2-1:4，緩沖液的主要成分為水，三羥甲基氨基甲烷和氯化氫；三羥甲基氨基甲烷和氯化氫的摩爾比為I ;1，ρΗ值在7-9，濃度為0.005-0.05mol/L。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，核酸序列分析儀是指ABI.310，3100，3730 或 3730XL DNA 測(cè)序儀，Illumina HiSeq 1000，HiSeq 2000，HiSeq.2500, HiSeq 3000,或 MySeq DNA 測(cè)序儀，Megbase 1000 DNA 測(cè)序儀。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104419760SQ201310405339
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月7日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:上海畢歐橋生物科技有限公司