hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于醫(yī)學領域的hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其主要特征是以內切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation Mix連接經PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態(tài)細胞以純化擴增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染離體傳代呈對數(shù)生長的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經G418篩選含陽性重組子的細胞，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達、免疫組化、細胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT介導體外研究T淋巴細胞模型凍存于液氮，為從細胞水平在體外長期研究相關疾病的發(fā)病機制奠定基礎。
【專利說明】hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及端粒酶逆轉錄酶催化亞基(hTERT)介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，主要用于醫(yī)學免疫學研究領域，為開展T淋巴細胞或與T淋巴細胞相關的各種研究提供細胞模型并保存其科研資源。

【背景技術】
[0002]人類血液中的有形成份分為紅細胞、白細胞和血小板。其中的白細胞以中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞為主。淋巴細胞又分為T淋巴細胞(T細胞)和B淋巴細胞(B細胞)等。
[0003]已知T細胞是由胸腺內的淋巴干細胞分化而成，是淋巴細胞中數(shù)量最多，功能最復雜的-類細胞。按其功能可分為三個亞群:輔助性T細胞、抑制性T細胞和細胞毒性T細胞。T細胞的細胞膜上有許多不同的標志，主要是表面抗原和表面受體。這些表面標志都是結合在細胞膜上的巨蛋白分子。T細胞是相當復雜的不均一體、又不斷在體內更新、在同一時間可以存在不同發(fā)育階段或功能的亞群。按免疫應答中的功能不同，又可將T細胞分成若干亞群，一致公認的有:輔助性T細胞(Helper T cells, Th)，具有協(xié)助體液免疫和細胞免疫的功能；抑制性T細胞(Suppressor T cells, Ts)，具有抑制細胞免疫及體液免疫的功能；效應T細胞(Effector T eells, Te)，具有釋放淋巴因子的功能；細胞毒T細胞(cytotoxic T cellS，Tc)，具有殺傷靶細胞的功能；遲發(fā)性變態(tài)反應T細胞(Td)，有參與IV型變態(tài)反應的作用；放大T細胞(Ta)，可作用于Th和Ts，有擴大免疫效果的作用；處女或天然T細胞(Virgin or Natural T cells),他們和抗原接觸后分化成效應T細胞和記憶T細胞；記憶T細胞(Tm)，有記憶特異性抗原刺激的作用。
[0004]其中，Th細胞又被稱為CD4+細胞，因為其在表面表達CD4(cluster ofdifferentiat1n^:)。通過與 MHC II (主要組織相容性復合體，major histocompatibilitycomplex)遞呈的多肽抗原反應被激活。MHC II在抗原遞呈細胞(antigen presentingcells,APCs)表面表達。一旦激活，可以分泌細胞因子，調節(jié)或者協(xié)助免疫反應。Tc細胞又名為⑶8+細胞，其表面表達⑶8.這類細胞可以通過MHCI與抗原直接結合。T淋巴細胞還可進一步分為輔助/誘導T淋巴細胞(⑶3+⑶4+)、抑制/細胞毒T淋巴細胞(⑶3+⑶8+)、CD4+T 細胞純真亞群(CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+)和記憶亞群(CD4+CD45RA-/CD4+CD45R0+)、功能亞群(CD28+)、激活亞群(CD38+、HLA-DR+)、凋亡亞群(CD95+)等。
[0005]T細胞是淋巴細胞的主要組分，T細胞的正常功能對人類抵御疾病非常重要。T細胞不產生抗體，其免疫應答是細胞免疫，如與靶細胞特異性結合，破壞靶細胞膜，直接殺傷靶細胞；釋放淋巴因子，最終使免疫效應擴大和增強；輔助或抑制B細胞產生抗體。在抵御疾病感染、腫瘤形成中起重要作用。而B細胞是通過產生抗體起作用?？贵w存在于體液里，所以B細胞的免疫作用叫作體液免疫。
[0006]淋巴細胞的平均壽命一般為7天左右，不能在體外較長時間的傳代培養(yǎng)。因為淋巴細胞在體外培養(yǎng)時易于在短時間內死亡，所以難以開展需在體外長期培養(yǎng)的淋巴細胞生物學功能的研究。為了解決這個問題，國內外文獻報道用EB病毒轉染法使B淋巴細胞永生化,建立B淋巴細胞系(株)，以滿足上述科研的需要。建立這種永生B淋巴細胞系的原理基于B淋巴細胞表面有EB病毒的受體。而T淋巴細胞的表面沒有EB病毒的受體，所以就無法用該方法來建立永生T淋巴細胞系。至今尚未見有關可在體外長期傳代培養(yǎng)的T淋巴細胞系的建立方法。
[0007]國外文獻報道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發(fā)病機制。
[0008]但最近有研究發(fā)現(xiàn)，SV40Tag轉染的細胞伴隨著DNA損傷修復機制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細胞致瘤性轉化。此外，長期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉染SV40Tag的細胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數(shù)細胞會最終進入危機期(M2期)而死亡，說明細胞并未獲得永生化。同時SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，因此SV40Tag轉染的細胞對某些研究也存在一定程度的限制性。
[0009]國外研究表明，導入外源性hTERT可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對“正?！钡纳L特征?？梢杂糜谌祟惡蛣游锬承┓N類的細胞模型的建立，對借助于研究轉基因永生化細胞模型而研究原始細胞的特性，從而研究其發(fā)病機制，具有重要的意義。
[0010]在口腔醫(yī)學領域，日本學者Kamata、Fujita和Fujii轉染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數(shù)達150次以上，細胞均表現(xiàn)原有的生物學特性，誘導培養(yǎng)后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經期綜合癥細胞模型、子宮內膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型。等等。
[0011]但是，至今尚未見有關以hTERT構建可用于在體外從細胞水平研究與T淋巴細胞相關疾病發(fā)病機制的永生T細胞模型及其細胞庫的文獻報道，也無法開展相關項目的研究。為了解決上述問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。


【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明的目的是要提供以hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建方法，另一目的是為在體外從細胞水平研究T淋巴細胞相關疾病的發(fā)病機制提供hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫。
[0013]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:以內切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligat1n Mix連接經PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染法導入離體傳代呈對數(shù)生長的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經G418篩選的陽性重組子的克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產物、免疫組織化學染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT介導T淋巴細胞體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平在體外長期研究與T淋巴細胞相關疾病的發(fā)病機制奠定基礎。
[0014]本發(fā)明以PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳提純hTERT，經基因載體pLXSNneo和脂質體轉染法導入T淋巴細胞而構建其細胞模型，其組織細胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規(guī)的胰蛋白酶消化，以僅使引起細胞粘連的膠原被消化或使細胞懸浮，減少了細胞壁的蛋白質被消化而傷及細胞，使細胞培養(yǎng)的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL/L胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的特定培養(yǎng)基，使細胞不會生長過快而影響hTERT基因的整合，也不會因缺少營養(yǎng)或細胞生長刺激因子而使細胞在未達到要求的匯合率、未進入對數(shù)生長期前就過早死亡，或對數(shù)生長期縮短；制備的細胞系在_196°C液氮中凍存I個月后復蘇培養(yǎng)，均能生長出貼壁細胞；在作細胞系染色體鑒定時，秋水仙素的用量及作用時間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計數(shù)和分析；此外，與SV40相比，以hTERT構建細胞模型更可以使細胞保持正常表型及分化特征，更能保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性及渡過M2危機期等生長特征，對在體外從細胞水平研究與T淋巴細胞相關疾病的病理機制具有更大的意義。

【具體實施方式】
[0015]1、hTERT 的提取:①酶切 pCIneo-hTERT:hTERT 位于質粒 pClneo-hTERT 的 EcoRI與SalI位點之間，pLXSNneo載體多克隆位點(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點。市售購買pCIneo-hTERT質粒，溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中，加2uL10 X酶切緩沖液和18uLH20，加限制性內切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應，按常規(guī)PCR法擴增hTERT后，收取擴增物以備電泳。②hTERT電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10 %瓊脂糖凝膠，倒入己封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面大約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的標準對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動，然后在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(30min)，關閉電源。③hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長波紫外光源下將含目標hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次,上清轉入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。
[0016]2、hTERT與pLXSNneo載體的連接:取9 μ I上述純化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、I μ 110mmol /T, ATP、10ul Ligat1n Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo 空載體混合，15°C 溫育 24h，構建 pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0017]3、pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉到一個含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值?0.4，在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?。②以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200 μ I轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物(體積彡10 μ 1，DNA ( 50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ 1S0C培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每90mm平板可達200 μ I)己轉化的感受態(tài)細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴增重組子:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_?4，為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min),于4°C,6000g離心1min,用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20°C或_70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。④重組質粒的鑒定與擴增:挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，370C，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4°C、10000r/min離心5min,按試劑盒說明書小量提取并純化重組質粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質粒反應體系:限制性內切酶各0.5ul、10Xbuffer2ul、重組質粒1ul、加水補足至20ul，37°C酶切Ih0酶切產物于80V電壓條件下進行0.8%瓊脂糖電泳，時間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測定重組質粒的序列；重組質粒經酶切、測序鑒定準確后，將含有該質粒的細菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴增培養(yǎng)，按大劑量質粒抽提試劑盒說明書進行大劑量質粒抽提純化，紫外分光光度計測定質粒濃度及純度后備用。
[0018]4、T淋巴細胞的收集:①以無菌操作提取在作其他實驗后多余、廢棄的含有T淋巴細胞的標本(如肝素抗凝血標本)。②將標本與等量1640培養(yǎng)液混勻后，沿管壁漸漸加入至IJ含有4ml淋巴細胞分離液的離心管中(混合血:淋巴細胞分離液=6:4)，3000轉離心10分鐘。③吸取白細胞層，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養(yǎng)液6ml，輕輕混勻，進行第一次洗滌。1500轉離心15分鐘。④棄上清液，再加6mll640全培養(yǎng)液進行第二次洗滌，離心1500轉15分鐘，棄上清液。
[0019]5、T淋巴細胞預培養(yǎng):將上述細胞接種于含5?lOnmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中，或接種于含20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中，一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6% IM HEPES緩沖液；15%胎牛血清(FBS)；
I%青霉素和鏈霉素；PRMI1640補足到100% )，置于37°C，體積分數(shù)5% C02培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)1-2天，離心，去上清液，備用。
[0020]6、pLXSNneo-hTERT重組子導入T淋巴細胞及擴大培養(yǎng):在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100 μ I無血清培養(yǎng)液中；管8，將20 μ ILipofectamine溶于80 μ I無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下靜置45min,用無血清培養(yǎng)液洗漆上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，滴加至上述T淋巴細胞中，加入Iml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20% )，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg° L—1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細胞作擴大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg° L—1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細胞繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細胞增長慢，或細胞密度低，或培養(yǎng)液PH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進行等量換液。當總量達到14ml時轉移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2_3周加入5_10ml新鮮培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)至9-10周(約第75代)，仍處于對數(shù)生長期，即細胞增加數(shù)量與培養(yǎng)時間呈倍增關系，死亡細胞少于10% (通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細胞數(shù)量的增加情況；通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因為正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經死亡。方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數(shù)1000個細胞總數(shù)，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量的增加變慢、死亡細胞越來越多，直至細胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉，10分鐘，棄上清后，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5% — 二甲基亞楓(dimethyl sufoxide),95% FBS)混勻，成細胞懸浮液(細胞濃度約為105/ml)。凍存管分裝，lml/管，置-20°C 2h，再置-70°C 2h，然后凍存在-196°C液氮中(或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中)。以此構建永生化T淋巴細胞模型。
[0021]7、永生化T淋巴細胞模型生物學特性的鑒定:使用pLXSNneo-hTERT建立永生細胞后，鑒定的關鍵問題有:一是要求該細胞具有持續(xù)的增殖能力；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等表型保持不變。①觀察細胞形態(tài):可見淋巴細胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，具有淋巴母細胞化特征。②觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉染細胞，制成細胞懸液，經計數(shù)，分別取1.4X 14細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數(shù)，計算均值，連續(xù)觀察直至細胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數(shù)的細胞換液，采用同樣方法觀察轉染細胞在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結果以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸(對數(shù))，描繪在半對數(shù)座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒有，也說明細胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:按5mL培養(yǎng)液中加入預熱的250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時，經離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型裸鼠致瘤試驗:將hTERT永生化的細胞以3X107接種裸鼠背部皮下，2個月后，4只裸鼠均未見腫瘤形成，證明此細胞為非惡化細胞；⑤轉染細胞DNA中hTERT檢測:如以免疫組織化學檢測，hTERT轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細胞內；?mRNA表達產物測定:取100μ I體系的PCR擴增產物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產物，取2μ I DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I進行測序。⑦流式細胞術檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是hTERT整合、表達的結果。⑧DNA序列測定:按常規(guī)測序儀檢測，顯示hTERT基因序列。
[0022]所以，本發(fā)明的細胞模型為①T淋巴細胞轉染了 hTERT基因而成為可長期傳代培養(yǎng)的永生化T淋巴細胞模型T淋巴細胞模型的染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”;③細胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸，在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；④細胞不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；?細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；⑥因細胞的DNA中整合了 hTERT基因，所以表達hTERT基因的mRNA產物體外連續(xù)培養(yǎng)9-10周(第75代)仍處于對數(shù)生長期；⑧能反復凍存、長期傳代培養(yǎng)；⑨用于研究T淋巴細胞的功能和免疫機制；⑩可再生性地保存T淋巴細胞相關的遺傳資源。
[0023]8,hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的細胞，經離心分離(12001'/1^11，61^11)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細胞，細胞密度為5X105個/ml，加入凍存管，經4°C，0.5h ;-20°C，2h ;-70°C，過夜，Λ _196°C液氮凍存，以此法構建生物學特性穩(wěn)定的永生化T淋巴細胞模型及其細胞庫，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，又可直接作為T淋巴細胞相關疾病發(fā)病機制體外研究的細胞模型，以加速拓展T淋巴細胞相關疾病研究的新途徑，從細胞水平在體外研究T淋巴細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制。
[0024]9、T淋巴細胞模型及其細胞庫的應用:用于集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料；直接作為T淋巴細胞相關疾病發(fā)病機制體外研究的細胞模型，以加速拓展T淋巴細胞相關疾病研究的新途徑，從細胞水平在體外研究T淋巴細胞相關疾病細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制。例如:
[0025]I)使T淋巴細胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風疹病毒，巨細胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長期傳代的不同周期的活細胞、傳代過程的凋亡細胞、含有傳代培養(yǎng)中所產生的代謝產物的培養(yǎng)液，應用常規(guī)方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運用原位雜交(FISH)、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術檢測基因所在研究細胞模型中的基因轉率表達、定位及調控；利用酶反應學、代謝組學技術鑒定細胞模型長期傳代中蛋白質代謝過程和關鍵的代謝產物；應用雙向電泳、MALD1-T0F質譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術研究細胞模型在長期傳代中的蛋白質功能及蛋白質間的相互作用，從活細胞培養(yǎng)過程動態(tài)、長期研究T淋巴細胞模型在各種情況下的耐受性及免疫機制。
[0026]2)使細胞模型和對照細胞分別在含有0.1、1.0、5.0、10.0、20.0pmol/L苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，檢測在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時間的可作為細胞毒性指標的細胞凋亡、壞死、雙核細胞率和可作為遺傳毒性指標的微核率、核質橋率、核芽率，即在光學顯微鏡下計數(shù)10000個雙核細胞中的微核數(shù)、核質橋數(shù)和核芽數(shù)；500個活細胞中的凋亡和壞死細胞數(shù)、雙核細胞數(shù)，以及檢測細胞存活率，即應用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內上清液，每孔加入150yL 二甲亞砜，振蕩lOmin，使紫色結晶物充分溶解，本酶標儀以490nm測定各孔的吸光度值，計算出細胞存活率。還可以其他常規(guī)實驗方法檢測不同培養(yǎng)時間的含毒性物與不含毒性物、T淋巴細胞模型與正常細胞中各組細胞的基因突變、蛋白質組學、細胞分泌功能、染色體畸變、細胞存活率(壽命)等，以從活細胞培養(yǎng)過程中從細胞水平動態(tài)、長期研究環(huán)境有害因素對T淋巴細胞功能、機制的影響。
【權利要求】
1.一種用于醫(yī)學領域的hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其主要特征是以內切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligat1n Mix連接經PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態(tài)細胞以純化擴增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染離體傳代呈對數(shù)生長的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經G418篩選含陽性重組子的細胞，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達、免疫組化、細胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT介導體外研究T淋巴細胞模型凍存于液氮，為從細胞水平(替代人體或動物直接試驗)在體外長期研究相關疾病的發(fā)病機制奠定基礎。
2.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是所指細胞模型為(I)T淋巴細胞轉染了 hTERT基因而成為可長期傳代培養(yǎng)的永生化T淋巴細胞模型；⑵T淋巴細胞模型的染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”;(3)細胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸，在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(4)細胞不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)因細胞的DNA中整合了 hTERT基因，所以表達hTERT基因的mRNA產物；(7)體外連續(xù)培養(yǎng)9-10周(第75代)仍處于對數(shù)生長期；(8)能反復凍存、長期傳代培養(yǎng)；(9)用于研究T淋巴細胞的功能和免疫機制；(10)可再生性地保存T淋巴細胞相關的遺傳資源。
3.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是原代T淋巴細胞取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的含有T淋巴細胞的標本。
4.根據(jù)權利要求1所述的hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的RPMI1640或含有20%胎牛血清、5?lOhmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液，轉染時胎牛血清濃度為20ml/L。
5.根據(jù)權利要求1所述的hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是用作脂質體轉染法導入重組子的T淋巴細胞，處于預培養(yǎng)后1-2天。
6.根據(jù)權利要求1所述的hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是作染色體核型分析時，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時。
7.根據(jù)權利要求1所述的hTERT介導T淋巴細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是細胞庫的構建包括(I)篩選經鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的hTERT介導的T淋巴細胞；(2)作傳代、擴大培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經消化、終止、離心(1200r/min，6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5 X 15個/ml的細胞懸液；(5)按照4°C，0.5h ；-20°C，2h ；-70°C，過夜；入-196°C液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存hTERT介導T淋巴細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號】C12N5/10GK104419726SQ201310407539
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月1日 優(yōu)先權日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 徐向榮, 沈國松, 李曉, 嚴愷, 黃荷鳳 申請人:翁炳煥