hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于醫(yī)學領域的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其主要特征是以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo，以Ligation Mix連接經(jīng)PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態(tài)細胞以純化擴增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染離體傳代呈對數(shù)生長的唐氏綜合征細胞，使重組子與細胞DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽性重組子克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達、免疫組化、細胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT介導唐氏綜合征體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平在體外長期研究其發(fā)病機制奠定基礎。
【專利說明】hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及端粒酶逆轉錄酶催化亞基(hTERT)基因重組(介導)構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，主要用于醫(yī)學遺傳學研究領域，為唐氏綜合征的體外研究提供細胞模型并保存其科研資源。

【背景技術】
[0002]唐氏綜合征亦名21-三體綜合癥，即患者多了一條21號染色體，表現(xiàn)為先天愚型。我國每年新發(fā)唐氏綜合征(21三體綜合癥或先天愚型)1.6萬-2萬例，將造成經(jīng)濟損失達73億-90億，給社會和家庭造成了嚴重的心理負擔和精神痛苦，已嚴重影響我國的人口質量，已成為社會發(fā)展的沉重負擔和可持續(xù)發(fā)展的嚴重障礙。
[0003]近年來，國內(nèi)外將唐氏綜合征列為重大出生缺陷之一，作為重點干預對象，并建立了相應的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法以預防唐氏綜合征的出生。在《國民經(jīng)濟和社會發(fā)展的第十一個五年規(guī)劃綱要》中強調(diào)，要加大唐氏綜合征等出生缺陷的干預力度，以改善出生人口素質；在《國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》中將唐氏綜合征等出生缺陷的研究列為優(yōu)先主題。
[0004]目前對唐氏綜合征等出生缺陷的研究主要是針對遺傳、生物、物理、化學因素與發(fā)病(率)的關系以及其早期篩查和診斷方面，如國外有大量的文獻報道，21三體等出生缺陷的發(fā)生與地區(qū)性、受孕時間、有害物接觸史等環(huán)境因素呈顯著相關;Malini SS等報道在18?29歲孕婦的21三體患兒中，91.3%具有外祖母高齡生育的特征；近親婚配時所存在的兩個相同隱性基因與生育唐氏綜合征等出生缺陷患兒的關系；Graaf、Rudnicka等報道孕婦的體重、吸煙習慣、孕產(chǎn)次與唐氏綜合征篩查指標有關；另有國內(nèi)學者報道孕婦吸煙、微量元素、心理因素、飲食、TORCH感染等與唐氏綜合征等出生缺陷相關。
[0005]但是，由于沒有可在體外長期培養(yǎng)的、可用于發(fā)病機制研究的永生細胞模型及其細胞庫，就難以從細胞水平在體外研究唐氏綜合征細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制，從而嚴重限制了唐氏綜合征的進一步研究。
[0006]國外文獻報道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發(fā)病機制。
[0007]但最近有研究發(fā)現(xiàn)，SV40Tag轉染的細胞伴隨著DNA損傷修復機制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細胞致瘤性轉化。此外，長期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉染SV40Tag的細胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數(shù)細胞會最終進入危機期(M2期)而死亡，說明細胞并未獲得永生化。同時SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，因此SV40Tag轉染的細胞對某些研究也存在一定程度的限制性。
[0008]國外研究表明，導入外源性hTERT可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對“正常”的生長特征。可以用于人類和動物某些種類的細胞模型的建立，對借助于研究轉基因永生化細胞模型而研究原始細胞的特性，從而研究其發(fā)病機制，具有重要的意義。
[0009]在口腔醫(yī)學領域，日本學者Kamata、Fujita和Fujii轉染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數(shù)達150次以上，細胞均表現(xiàn)原有的生物學特性，誘導培養(yǎng)后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細胞模型、子宮內(nèi)膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型。等等。
[0010]但是，至今尚未見有關以hTERT構建可用于在體外從細胞水平研究唐氏綜合征發(fā)病機制的永生細胞模型及其細胞庫的文獻報道，也無法開展相關項目的研究。為了解決上述問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是要提供以端粒酶逆轉錄酶催化亞基(hTERT)基因重組(介導)構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫的方法，另一目的是為在體外從細胞水平研究唐氏綜合征的發(fā)病機制提供hTERT介導唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫。
[0012]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligat1n Mix連接經(jīng)PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染法導入離體傳代呈對數(shù)生長的唐氏綜合征細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選的陽性重組子的克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產(chǎn)物、免疫組織化學染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT介導唐氏綜合征體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平在體外長期研究唐氏綜合征的發(fā)病機制奠定基礎。
[0013]本發(fā)明以PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳提純hTERT，經(jīng)基因載體pLXSNneo和脂質體轉染法導入唐氏綜合征細胞而構建其細胞模型，其組織細胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規(guī)的胰蛋白酶消化，以僅使引起細胞粘連的膠原被消化或使細胞懸浮，減少了細胞壁的蛋白質被消化而傷及細胞，使細胞培養(yǎng)的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的特定培養(yǎng)基，使細胞不會生長過快而影響hTERT基因的整合，也不會因缺少營養(yǎng)或細胞生長刺激因子而使細胞在未達到要求的匯合率、未進入對數(shù)生長期前就過早死亡，或對數(shù)生長期縮短；制備的細胞系在-196°C液氮中凍存I個月后復蘇培養(yǎng)，均能生長出貼壁細胞；在作細胞系染色體鑒定時，秋水仙素的用量及作用時間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計數(shù)和分析；此外，與SV40相t匕，以hTERT構建細胞模型更可以使細胞保持正常表型及分化特征，更能保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性及渡過M2危機期等生長特征，對在體外從細胞水平研究唐氏綜合征的病理機制具有更大的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明制備的唐氏綜合征細胞模型(貼壁生長)圖。
[0015]如圖1，細胞傳代至第66代、培養(yǎng)至第7天時，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細胞生長變慢、變稀疏。

【具體實施方式】
[0016]1、hTERT 的提取:①酶切 pClneo-hTERT:hTERT 位于質粒 pClneo-hTERT 的 EcoRI與SalI位點之間，pLXSNneo載體多克隆位點(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點。市售購買pCIneo-hTERT質粒，溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中，加2uL10 X酶切緩沖液和18uLH20，加入限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，力口入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應，按常規(guī)PCR法擴增hTERT后，收取擴增物以備電泳。②hTERT電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10 %瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的標準對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動，在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(30min)，關閉電源。③hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長波紫外光源下將含目標hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加A2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7_)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5mlEppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺式離心機上最高速2分鐘,吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次,上清轉入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。
[0017]2、hTERT與pLXSNneo載體的連接:取9u I上述純化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、
Iμ 110mmol /T, ATP、10ul Ligat1n Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo 空載體混合，15°C 溫育 24h，構建 pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0018]3、pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉到一個含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值?0.4，在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用Sorvall6S2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預冷的0.1nMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?。②以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200 μ I轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物(體積彡10 μ 1，DNA ( 50ng)，輕輕旋轉以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每90mm平板可達200 μ I)已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴增重組子:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_?4，為提高產(chǎn)量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min),于4°C,6000g離心1min,用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20°C或_70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。④重組質粒的鑒定與擴增:挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，370C，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4°C、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質粒；WEcoRI和HindIII雙酶切重組質粒反應體系:限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10 X buffer2ul、重組質粒1ul、加水補足至20ul，37 V酶切l(wèi)h。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進行0.8%瓊脂糖電泳，時間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測定重組質粒的序列；重組質粒經(jīng)酶切、測序鑒定準確后，將含有該質粒的細菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴增培養(yǎng)，按大劑量質粒抽提試劑盒說明書進行大劑量質粒抽提純化，紫外分光光度計測定質粒濃度及純度后備用。
[0019]4、pLXSNneo-hTERT重組子導入唐氏綜合征細胞及其陽性克隆的篩選:①唐氏綜合征細胞的收集與培養(yǎng):以無菌操作提取在作其他實驗或其他檢查后多余、廢棄的唐氏綜合征患兒羊水脫落細胞，以細胞終濃度約為I X 1VmL備用，取上述呈單個分散的細胞或經(jīng)處理后成為單個分散的細胞接種于含5?lOnmol/L胰島素、20 %胎牛血清的RPMI1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中，置于37°C，體積分數(shù)5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)，細胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細胞形態(tài)為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數(shù)生長期時，即考慮收集培養(yǎng)細胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l-2ml0.01%的膠原酶II液或胰酶(以消化液能覆蓋整個瓶底為準)，靜置2-10min (顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測)，吸去膠原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，轉入離心管離心沉淀，去上清液，細胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導入。②pLXSNneo-hTERT重組子的導入:方法1:在上法分離所得細胞中，選用脂質體轉染法，將上述2X 15個細胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細胞生成單層、細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時，轉染重組子pLXSNneo-hTERT，在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管么，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100 μ I無血清培養(yǎng)液中；管B，將20 μ I Lipofectamine溶于80 μ I無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min,吸去細胞培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞2次，在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入Iml無血清培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg° I/1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個細胞集落進行亞克隆，擴大培養(yǎng)后再加大G418濃度到800mg° L_\將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進行傳代擴增。方法2:吸取1/10-1/40細胞懸液，配制成終濃度為I X 105/mL細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，其中含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰島素，培養(yǎng)48h后，使細胞生成單層、細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時，采用脂質體轉染的方法，將重組子pLXSNneo-hTERT轉染至唐氏綜合征細胞內(nèi)，用含700mg/L G418的培養(yǎng)液篩選lwk，將G418濃度改為300mg/L，至出現(xiàn)陽性克隆，將其轉移至新培養(yǎng)瓶進行擴大、傳代培養(yǎng)；方法3:將上述的細胞懸液以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液配成5X 108/L終濃度的細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，待細胞長至90 %左右融合時用于轉染，將0.2 μ g含量的重組子pLXSNneo-hTERT,用DMEM或RPMI1640調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min ;脂質體6 μ 1，用DMEM調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min，兩種試劑輕輕混勻，室溫放置20min，將24孔板內(nèi)的細胞用DMEM洗3次，每孔加培養(yǎng)液100 μ 1，加Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合液，輕輕在細胞表面鋪均勻，于37°C C02培養(yǎng)箱放置6h，隨后用0.01g/L膠原酶將細胞消化，轉入6孔板內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基，次日加G418抗生素使終濃度為500mg/L，直到有單克隆細胞長出。約1d后有單克隆細胞集落長出，挑取并置于24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，以300mg/L的G418維持并穩(wěn)定傳代擴增培養(yǎng)。以此構建唐氏綜合征細胞模型(細胞系)。
[0020]5、pLXSNneo-hTERT轉染的唐氏綜合征細胞模型的傳代、擴增:收集上述經(jīng)脂質體轉染法導入pLXSNneo-hTERT的陽性單克隆細胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基配成約IX 105/mL的細胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、1nmoI/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，至細胞貼壁生長、匯合率達80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時收集細胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復傳代接種、培養(yǎng)，記錄代數(shù)并觀察細胞生長特點。如圖1，細胞傳代至第66代、培養(yǎng)至第7天時，呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細胞生長變慢、變稀疏。其中對數(shù)生長是指細胞生長速度快，細胞數(shù)量的增加與培養(yǎng)時間呈倍增關系，通常按常規(guī)按種細胞進行培養(yǎng)時，培養(yǎng)I?2天便可在顯微鏡下找到生長的單個細胞；4?5天時可見細胞集落，貼壁生長細胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的1/3，培養(yǎng)7?13天時可見貼壁生長細胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的2/3以上，甚至細胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達95?100% )，細胞光亮，無顆粒、無粗糙感等老化現(xiàn)象，也可據(jù)細胞計數(shù)與培養(yǎng)時間的關系來判斷；死亡的細胞少，每周因死亡而漂浮的細胞少于10% [通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞，因為正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內(nèi)；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經(jīng)死亡，方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數(shù)1000個細胞總數(shù)，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比]。
[0021]6、唐氏綜合征細胞模型生物學特性的鑒定:使用pLXSNneo-hTERT建立細胞模型(細胞系)后，鑒定的關鍵問題有:一是要求該細胞具有持續(xù)的增殖能力；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等表型保持不變。①觀察細胞形態(tài):在倒置光學顯微鏡下每日觀察細胞是否呈典型的上皮細胞樣貼壁生長，是否呈梭形、或小園形生長。本細胞系傳代擴增培養(yǎng)的細胞形態(tài)與正常人成纖維細胞形態(tài)無明顯差異；②觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉染細胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細胞懸液，經(jīng)計數(shù)，分別取1.4X 14細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數(shù)，計算均值，連續(xù)觀察直至細胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數(shù)的細胞換液，采用同樣方法觀察轉染細胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結果以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸(對數(shù))，描繪在半對數(shù)座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為47，XX，+21 ;或47，XY, +21 ;或相同于本發(fā)明采集的原代唐氏綜合征細胞，則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒有，也說明細胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細胞生長密度達85-95% (其中小園形細胞占10% )、處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物中按5mL培養(yǎng)液中加入預熱的250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時，吸干培養(yǎng)液，加入預熱的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37°C作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細胞，經(jīng)離心、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長試驗:將細胞以5X 104/ml接種于直徑為35mm軟瓊脂平皿內(nèi)，觀察三周后，未發(fā)現(xiàn)克隆形成，說明本實驗的永生化細胞不能在軟瓊脂內(nèi)形成克隆，符合永生化特點裸鼠致瘤試驗:將永生化細胞以3X107接種裸鼠背部皮下，2個月后，4只裸鼠均未見腫瘤形成，證明此細胞為非惡化細胞；⑥轉染細胞hTERT mRNA表達產(chǎn)物測定:按試劑盒做PCR擴增后電泳，檢出hTERT mRNA條帶。如以免疫組織化學檢測，hTERT轉染的細胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細胞內(nèi)；?轉染細胞端粒酶活性:收集細胞系，按試劑盒說明制備裂解液，作PCR擴增和電泳分析，以302nm紫外光觀察結果，可見呈端粒酶陽性條帶。⑧流式細胞術檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是hTERT整合、表達的結果；另外以流式細胞術檢測細胞增殖周期及細胞凋亡率，本細胞系的細胞增殖指數(shù)較轉染前后無明顯改變，轉染后細胞凋亡率較轉染前明顯降低。
[0022]所以，本發(fā)明的細胞模型為①細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；②細胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸，在hepatoZYME—SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成逾染色體核型為47，XX，+21 ;或47，XY, +21 ;或相同于本發(fā)明采集的原代唐氏綜合征細胞；④細胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；⑤細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性細胞的DNA中整合了 hTERT基因，表達hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；@細胞傳代至第66代、培養(yǎng)至第7天時，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96%以上。⑧用于唐氏綜合征發(fā)病機制的研究；@可再生性保存唐氏綜合征資源。
[0023]7、hTERT介導唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細胞，經(jīng)過消化、終止和離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細胞，細胞密度為5X105個/ml，加入凍存管，分裝、標注，經(jīng)4°C,0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存。以此法構建生物學特性穩(wěn)定的永生化唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，又可直接作為唐氏綜合征發(fā)病機制體外研究的細胞模型，以加速拓展唐氏綜合征研究的新途徑，從細胞水平在體外研究唐氏綜合征細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制。
[0024]8、細胞模型應用
[0025]I)細胞模型作為科研細胞
[0026]使唐氏綜合征細胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風疹病毒，巨細胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長期傳代的不同周期的活細胞、傳代過程的凋亡細胞、含有傳代培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液從不同角度和水平，研究染色體異常、其他異常、正常對照細胞模型對有害物的耐受性、有害物致出生缺陷的機制。例如應用常規(guī)方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs、等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運用原位雜交(FISH)、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術檢測基因所在研究細胞模型中的基因轉率表達、定位及調(diào)控；利用酶反應學、代謝組學技術鑒定細胞模型長期傳代中蛋白質代謝過程和關鍵的代謝產(chǎn)物；應用雙向電泳、MALD1-T0F質譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術研究細胞模型在長期傳代中的蛋白質功能及蛋白質問的相互作用，從活細胞培養(yǎng)過程動態(tài)、長期研究環(huán)境有害因素致出生缺陷的機制，例如:
[0027]①環(huán)境中常見的毒性物質苯并芘致唐氏綜合征出生缺陷的研究:使細胞模型和對照細胞分別在含有0.1、1.0,5.0、10.0,20.0pmoI/L苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，對比檢測在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時間的可作為細胞毒性指標的細胞凋亡、壞死、雙核細胞率和可作為遺傳毒性指標的微核率、核質橋率、核芽率，即在光學顯微鏡下計數(shù)10000個雙核細胞中的微核數(shù)、核質橋數(shù)和核芽數(shù)；500個活細胞中的凋亡和壞死細胞數(shù)、雙核細胞數(shù)，以及檢測細胞存活率，即應用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μ L 二甲亞砜,振蕩1min,使紫色結晶物充分溶解,本酶標儀以490nm測定各孔的吸光度值，計算出細胞存活率。還可以其他常規(guī)實驗方法檢測不同培養(yǎng)時間的含毒性物與不含毒性物、病例與正常細胞中各組細胞的基因突變、蛋白質組學、細胞分泌功能、染色體畸變、細胞存活率(壽命)等，以從活細胞培養(yǎng)過程中從細胞水平動態(tài)、長期研究環(huán)境有害因素致唐氏綜合征出生缺陷的機制。
[0028]②以某種病源微生物替換毒性物質苯并芘做同樣的研究，即可從活細胞培養(yǎng)過程中從細胞水平動態(tài)、長期研究生物因素致唐氏綜合征出生缺陷的機制。
[0029]③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學物質以及細胞模型共同培養(yǎng)，即可從活細胞培養(yǎng)過程中從細胞水平動態(tài)、長期研究藥物對致唐氏綜合征出生缺陷因素的治療效果及對出生缺陷的干預效果。
[0030]④同樣可用細胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗。
[0031]2)細胞模型作為質控細胞
[0032]實驗室的質量控制是開展實驗診斷項目的準入制度，已成為政府行為。唐氏綜合征細胞模型可用作質控細胞，用于室內(nèi)質控和室間質評。例如用細胞模型同步于臨床標本的染色體病實驗診斷方法，作常規(guī)細胞培養(yǎng)、染色體制備、染色體核型分析，以考核實驗過程的試劑質量、儀器性能、操作方法等是否可靠，相當于實驗中的陽性、陰性對照；可將細胞模型經(jīng)常規(guī)染色體制備、染色體核型分析所得到的圖像作整理后，發(fā)送到各相關實驗室，以考核各室對各種染色體異常圖像的診斷的準確性；可將細胞模型發(fā)送到各相關實驗室，在各室自行作出常規(guī)細胞培養(yǎng)、染色體制片、染色體核型分析后回報結果，對各室的診斷結果作室間質量評價，通過評比各室的準確性，以發(fā)現(xiàn)相關問題、解決問題、提高診斷質量；可將唐氏綜合征細胞模型與各種正常染色體細胞按質控所需要的種類及比例混合，制成含有不同種類和比例的混合質控細胞，作為熒光原位雜交(FISH)檢測染色體數(shù)目異常室內(nèi)質控細胞和室間質評細胞，如果某實驗室在作FISH中沒有檢測出(漏診)質控細胞的不同種類的染色體異常、沒有準確檢測出不同種類的染色體異常的比率(％ )，則說明實驗方法存在質量問題，應找原因改正?，F(xiàn)以幾種染色體異常細胞模型混合后制備的質控細胞在熒光原位雜交室間質評中的具體應用為例說明如下:
[0033]①準備質控細胞:取I例或數(shù)例唐氏綜合征及染色體正常細胞模型，按質控所需要的例次或比例混合而成質控細胞，混合的質控細胞還可經(jīng)擴增后發(fā)放使用。現(xiàn)以3例染色體數(shù)目異常細胞模型等比例細胞數(shù)混合為例，每種染色體數(shù)目異常的細胞各占20%。然后將質控細胞發(fā)送到各受試對象做室間質量評價。
[0034]②熒光原位雜交(FISH)檢測質控細胞染色體數(shù)目及結果判定:各受試對象收到質控細胞后，可酌情對質控細胞株進行傳代擴增后測試，以增加細胞數(shù)。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的AneuVys1n試劑盒,完成3條染色體的數(shù)目分析--第21號(SpectrumAqua,紅色)、X(Spectrum Green,綠色)、Y (Spectrum Orange,紅色)號染色體為計數(shù)探針(Chromosome Enumerating Probe, CEP),混合后雜交第I個區(qū)域，方法是取21、X和Y染色體探針，將質控細胞(與實驗室被檢標本)同步，經(jīng)2000r/min離心1min,去上清，留沉淀
0.2ml,離心管中加入4ml膠原酶37°C溫浴30min, 2000r/min離心lOmin,去上清,然后加入5ml預溫的15mol/L KCl,在37水浴中低滲25min, 2000r/min離心1min,去上清。加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定1min,離心2000r/min離心1min去上清,反復兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標本片自冰柜中取出，依次放人70%、85%、100%乙醇中脫水，室溫干燥，預處理好的玻片置73°C，70%甲酰胺中5min。在暗室中將兩種探針混合液各10 μ I加在玻片的靶區(qū)域，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中42°C雜交過夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜交效果，每例標本計數(shù)60?100個細胞，記錄雜交信號數(shù)目并采集圖像，要求細胞核膜必須完整，核內(nèi)雜交信號明亮清晰無重疊，信號彌散及微弱均不作統(tǒng)計。
[0035]③測試結果:經(jīng)探針雜交后，細胞內(nèi)的21號染色體顯示紅色的點，每條21號顯示I個紅色的點，2條則顯示2個紅色的點，3條則顯示3個紅色的點；細胞內(nèi)X(女性)染色體顯示綠色的點，每條X染色體顯示I個綠色的點，2條則顯示2個綠色的點，3條則顯示3個綠色的點；細胞內(nèi)Y(男性)染色體顯示紅色的點，每條Y染色體顯示I個紅色的點，2條則顯示2個紅色的點，3條則顯示3個紅色的點。如果實驗人員技術、操作、實驗器材、試劑等有質量問題，則21號染色體紅色的點、細胞內(nèi)X(女性)染色體綠色的點、細胞內(nèi)Y(男性)染色體紅色的點就沒有信號或難以辯認。
[0036]④另外，病例細胞模型可用于基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和 SNPs、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA 等基因檢測技術的陽性對照，或作為病例資源保存，備作用上述方法作基因突變、基因組學、蛋白質組學等檢測，以分析發(fā)病機理。
【權利要求】
1.一種用于醫(yī)學領域的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其主要特征是以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligat1nMix連接經(jīng)PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態(tài)細胞以純化擴增并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染離體傳代呈對數(shù)生長的唐氏綜合征細胞，使重組子與細胞DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽性重組子克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達、免疫組化、細胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT介導唐氏綜合征體外研究細胞模型凍存于液氮中，為從細胞水平(替代人體或動物直接試驗)在體外長期研究其發(fā)病機制奠定基礎。
2.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其特征是所指細胞模型為(I)細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；(2)細胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸，在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為47，XX，+21 ;*47，XY，+21 ;或相同于本發(fā)明采集的原代唐氏綜合征細胞；(4)細胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細胞的DNA中整合了 hTERT基因，表達hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)細胞傳代至第66代、培養(yǎng)至第7天時，呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達96%以上。(8)用于唐氏綜合征發(fā)病機制的研究；(9)可再生性保存唐氏綜合征資源。
3.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其特征是取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的唐氏綜合征患兒羊水脫落細胞構建之。
4.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其特征是用作傳代培養(yǎng)以備脂質體轉染法導入重組子的唐氏綜合征組織細胞，在原代擴增培養(yǎng)中，其收集指標是細胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細胞形態(tài)為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數(shù)生長期時收集細胞；用作脂質體轉染法導入重組子的傳代唐氏綜合征組織細胞，其時機選擇的指標是細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時的培養(yǎng)細胞；傳代細胞系收集的指標是選擇細胞貼壁生長的匯合率達80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時收集細胞；染色體核型分析的細胞收集指標是細胞生長密度達85-95%、小園形細胞占10%以上、處于對數(shù)生長期的細胞。
6.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長的唐氏綜合征組織細胞，作染色體核型分析時，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時。
7.根據(jù)權利要求1所述的hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，其特征是細胞庫的構建包括(I)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的hTERT介導的唐氏綜合癥細胞；(2)作傳代、擴大培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r/min，6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5 X 15個/ml的細胞懸液；(5)按照4°C，0.5h ；~20V,2h ;-70°C，過夜；入_196°C液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存hTERT介導唐氏綜合征細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號】C12N15/85GK104419676SQ201310407553
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月1日 優(yōu)先權日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 李曉, 舒靜, 馬裕, 鄭金川, 黃荷鳳 申請人:翁炳煥