一種人活性顆粒酶a重組蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種人活性顆粒酶A重組蛋白的制備方法，利用PCR擴(kuò)增得到人活性顆粒酶A基因，將其插入到與原核表達(dá)載體pET24a(+)相應(yīng)酶切位點中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)-aGzmA，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后獲得工程菌pET24a(+)-aGzmA/BL21。該工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)人活性顆粒酶A重組蛋白，重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)。利用鎳親和層析柱可以分離得到純度高達(dá)95％以上的重組蛋白，且該重組蛋白經(jīng)BLT底物溶液進(jìn)行活性測定顯示出較好的酶解活性。該方法具有成本低、操作簡單、蛋白表達(dá)量高等特點，并且制備的重組蛋白具有生物學(xué)活性和易于純化。
【專利說明】一種人活性顆粒酶A重組蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地涉及了一種人活性顆粒酶A重組蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]顆粒酶A(Granzyme A, GzmA)是一種存在于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)及天然殺傷性細(xì)胞(Natural killer, NK)中的絲氨酸蛋白酶。顆粒酶 A主要誘導(dǎo)一種caspases非依賴性的細(xì)胞凋亡，它通過顆粒的胞吐作用釋放，在穿孔素 (Perforin)協(xié)同作用下進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞漿中，并聚集在細(xì)胞核，通過裂解SET復(fù)合物，釋放的脫氧核糖核酸酶匪232H1對染色體DNA形成單股DNA鏈切(缺)口而引起DNA斷裂，最終引起靶細(xì)胞的凋亡。近來的大量研究發(fā)現(xiàn)，在一些健康捐助者的血清中檢測到了顆粒酶A 的存在，而當(dāng)炎癥發(fā)生時，在血清和其他體液中可檢測到更高水平的顆粒酶A，說明顆粒酶 A除了具有細(xì)胞毒性功能外，還可能在細(xì)胞外發(fā)揮促進(jìn)炎癥和降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，從而允許細(xì)胞毒性細(xì)胞接近組織內(nèi)的祀細(xì)胞，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。因此，獲得具有活性的人活性顆粒酶A重組蛋白對于開展其生物學(xué)功能及分子機(jī)制的研究具有重要的理論和實際意義。
[0003]大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是一種簡便、高效的原核表達(dá)系統(tǒng)，具有成本低、蛋白表達(dá)量高、操作簡單等特點，并且可以將表達(dá)產(chǎn)物與His標(biāo)簽進(jìn)行共表達(dá)，從而可以利用鎳柱親和層析法對目的蛋白進(jìn)行分離和純化。親和層析純化蛋白具有簡單、快速、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點，是蛋白分離純化的最好方法之一。
[0004]N(a) -Benzyloxycarbonyl-L-1ysine Thiobenz (BLT)是一種類膜蛋白酶和顆粒相關(guān)的絲氨酸酯酶高度敏感性的底物，被絲氨酸蛋白酶如顆粒酶A切割后，BLT能夠與
5,5' -Dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB)反應(yīng)，在 412nm 處具有最大吸收值。吸光度值越高，說明蛋白活性越好，從而可以用于檢測 人顆粒酶A重組蛋白的酶解活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出了一種人活性顆粒酶A重組蛋白的制備方法，包括人活性顆粒酶A重組蛋白的表達(dá)、分離純化及其活性測定。本方法得到的人活性顆粒酶A重組蛋白去除了人顆粒酶A的N末端的28個氨基酸，并在C末端增加了 6個組氨酸，以方便利用鎳層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化。本方法依次包括以下步驟:
[0006]a)獲得人活性顆粒酶A的DNA片段
[0007]以含有人顆粒酶A全長基因的質(zhì)粒pET24a-GzmA為模板，經(jīng)PCR獲得所述人活性顆粒酶A的DNA片段。
[0008]b)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)-aGzmA
[0009]將所述人活性顆粒酶A基因的DNA片段和原核表達(dá)載體pET24a (+)分別用 Nde I和Xho I雙酶切后回收酶切片段，利用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，得到所述pET24a (+) -aGzmA 重組質(zhì)粒。
[0010]對pET24a (+)-aGzmA重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定:所述pET24a (+)-aGzmA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)后提取質(zhì)粒并用Nde I和Xho I雙酶切鑒定，得到目的DNA條帶，證明 pET24a (+) -aGzmA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0011]c)獲得人活性顆粒酶A表達(dá)菌pET24a (+) -aGzmA/BL21
[0012]將重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)_aGzmA加入到冰預(yù)冷的大腸桿菌BL21感受態(tài)中，于冰上放置30min后于42°C水浴熱擊90s ;加入無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)Ih后涂布于kan+LB平板， 經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，得到所述人活性顆粒酶A表達(dá)菌PET24a(+)-aGzmA/BL21。
[0013]d)人活性顆粒酶A重組蛋白的表達(dá)和鑒定
[0014]將所述人活性顆粒酶A表達(dá)菌PET24a(+)-aGzmA/BL21接種于LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜后再轉(zhuǎn)接于新的LB培養(yǎng)基中，搖菌至0D600 = 0.6~0.8之間；加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h 后于12000rpm離心2min，得到含有所述人活性顆粒酶A重組蛋白的菌體。
[0015]用PBS重懸菌體后，取樣加入2XSDS凝膠上樣緩沖液，于100°C煮沸IOmin ;將離心后的上清作為樣品，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE分析；菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，以小鼠抗His多克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，Western Blot鑒定人活性顆粒酶A的表達(dá)。
[0016]e)人活性顆粒酶A重組蛋白的純化
[0017]將工程菌PET24a(+)-aGzmA/BL21用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體用PBS重懸，置于超聲波破碎儀中進(jìn)行超聲破碎；離心收集沉淀，用結(jié)合緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl, 5mM咪唑、10%甘油、8M尿素)重懸，再次離心，收集上清，經(jīng)0.45iim濾膜過濾；將過濾后的溶液通過預(yù)處理好的鎳柱進(jìn)行親和層析純化，得到純化的人活性顆粒酶A重組蛋白。
[0018]在進(jìn)行人活性顆粒酶A重組蛋白的純化前，還可以先對重組蛋白表達(dá)形式的進(jìn)行確定，即步驟d)得到的含有人活性顆粒酶A重組蛋白的菌體用PBS重懸后`，置于超聲破碎儀中進(jìn)行超聲破碎。4°C、12000rpm,離心15min后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析， 檢測到人活性顆粒酶A重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。確定重組蛋白表達(dá)是包涵體的形式后，將沉淀用結(jié)合緩沖液重懸，使包涵體中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次離心，收集獲得的上清，0.45um濾膜過濾；將過濾后的溶液通過預(yù)處理好的鎳柱進(jìn)行親和層析純化，得到所述人活性顆粒酶A重組蛋白。
[0019]為了進(jìn)一步確定得到的人活性顆粒酶A重組蛋白具有所需的活性，本方法還包括以下步驟:
[0020]f)人活性顆粒酶A重組蛋白的活性鑒定
[0021]在96孔板每孔中加入200 ill BLT底物溶液，再加入20 ii I人活性顆粒酶A重組蛋白，37°C放置20min，用酶標(biāo)儀測定其在412nm處的吸光度值。
[0022]本方法步驟a)的人活性顆粒酶A基因的PCR擴(kuò)增中，上游引物序列(SEQ ID N0.1):5? -GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3';下游引物序列(SEQ ID N0.2):5’-C GCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3，。
[0023]本方法步驟d)所述的誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為IMm ;2 X SDS凝膠上樣緩沖液的成分包括 IOOmM pH6.8Tris-HCl、20%甘油、4% SDS、200mM2_ 巰基乙醇、0.2%溴酚蘭。
[0024]本方法步驟e)所述鎳柱親和層析純化是:將NiSO4通過親和層析凝膠柱以后，Ni2+與凝膠親和吸附；當(dāng)帶His標(biāo)記的人活性顆粒酶A重組蛋白濾液通過鎳柱時，人活性顆粒酶A重組蛋白與Ni2+親和吸附；用結(jié)合緩沖液(binding buffer)和洗漆緩沖液(washing buffer)洗去未結(jié)合的雜質(zhì),然后用含高濃度咪唑的洗脫緩沖液(elute buffer)使親和力減弱，將人活性顆粒酶A重組蛋白洗脫下來；洗脫下來的緩沖液中含有高濃度尿素和咪唑， 將其加入到處理好的透析袋中，然后將透析袋浸透在不含尿素和咪唑的緩沖液中，尿素和咪唑析出，透析袋中的蛋白即為高純度的人活性顆粒酶A重組蛋白。
[0025]本方法中，所述結(jié)合緩沖液的成分包括0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、5mM咪唑、10% 甘油、8M尿素；所述洗滌緩沖液的成分包括0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、60mM咪唑、10%甘油、8M尿素；所述洗脫緩沖液的成分包括0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、500mM咪唑、10%甘油、 8M尿素。
[0026]本方法中，不含尿素和咪唑的緩沖液成分為0.5M NaCl、20mM Tis_HCl、10%甘油。
[0027]本方法中，步驟f)的BLT底物溶液的成分包括500 U 120mM BLT貯存液、 500 u 120mMDTNB 貯存液、500 y 11% Triton X-100 和 48.5ml PBS。
[0028]本發(fā)明利用PCR擴(kuò)增得到人活性顆粒酶A基因，將其插入到與原核表達(dá)載體 pET24a (+)相應(yīng)酶切位點中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a (+) -aGzmA,經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后獲得工程菌pET24a (+) -aGzmA/BL21。該工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)人活性顆粒酶A重組蛋白，重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)。利用鎳親和層析柱可以分離得到純度高達(dá)95%以上的重組蛋白，且該重組蛋白經(jīng)BLT底物溶液進(jìn)行活性測定顯示出較好的酶解活性。該方法具有成本低、操作簡單、蛋白表達(dá)量高等特點，并且制備的重組蛋白具有生物學(xué)活性和易于純化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明方法中重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a (+)-aGzmA構(gòu)建流程圖。
[0030]圖2為人活性顆粒 酶A基因的PCR擴(kuò)增圖譜。第一泳道為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為:2000bp，1000bp，750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，第二泳道為 PCR 產(chǎn)物。
[0031]圖3為重組質(zhì)粒pET24a(+)-aGzmA酶切鑒定圖譜。第一泳道為為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為:2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp)，第二泳道為未酶切的質(zhì)粒pET24a (+) -aGzmA,第三泳道為Nde I和Xho I雙酶切后的pET24a (+) -aGzmA。
[0032]圖4為人活性顆粒酶A重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為:94.0KDa, 66.2KDa, 33.0KDa, 26.0KDa, 20.2KDa, 14.0KDa)，第二泳道為pET24a(+)-aGzmA/BL21未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第三泳道為pET24a(+)-aGzmA/ BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第四泳道為pET24a(+)/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果；第五泳道為空白菌大腸桿菌BL21經(jīng)IPGT誘導(dǎo)的電泳結(jié)果。
[0033]圖5為人活性顆粒酶A重組蛋白表達(dá)的westernblot鑒定結(jié)果。第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為:70.0KDa，50.0KDa，45.0KDa，35.0KDa，25.0KDa)，第二泳道為pET24a(+)-aGzmA/BL21未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第三泳道為pET24a(+) _aGzmA/BL21 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第四泳道為pET24a(+)/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果；第五泳道為空白菌大腸桿菌BL21經(jīng)IPGT誘導(dǎo)的電泳結(jié)果。
[0034]圖6為人活性顆粒酶A重組蛋白表達(dá)形式的檢測結(jié)果。第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為:94.0KDa, 66.2KDa,33.0KDa, 26.0KDa, 20.2KDa，14.0Kba)，第二泳道為pET24a(+)-aGzmA/BL21未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第三泳道為pET24a (+) _aGzmA/BL21 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第四泳道為誘導(dǎo)的PET24a(+)-aGzmA/BL21超聲破碎后上清的電泳結(jié)果；第五泳道為誘導(dǎo)的pET24a(+)-aGzmA/BL21超聲破碎后沉淀的電泳結(jié)果。[0035]圖7為純化的人活性顆粒酶A蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果。第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(自上向下依次為:66.2KDa, 33.0KDa, 26.0KDa, 20.2KDa)，第二泳道為 pET24a(+)-aGzmA/BL21未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第三泳道為pET24a(+) _aGzmA/BL21經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的電泳結(jié)果，第四泳道為純化蛋白的電泳結(jié)果。
[0036]圖8為人活性顆粒酶A重組蛋白活性鑒定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0037]結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施本發(fā)明的過程、 條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識， 本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0038](I)人活性顆粒酶A的DNA片段的獲得；
[0039]步驟(1)包括以下步驟:以含人顆粒酶A全長基因的質(zhì)粒pET24a-GzmA為模板，利用PCR擴(kuò)增人活性顆粒酶A基因片段，上游引物序列(SEQ ID N0.1)為=Sy-GGAATTCCATATG ATTATTGGAGGAMTGMG-3'(下劃線部分為Nde I酶切位點，85-103);下游引物序列(SEQ ID N0.2)為:5，-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3，(下劃線部分為 Xho I 酶切位點，769-786)。 擴(kuò)增片段大小為723bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分析并回收。
[0040](2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a (+) -aGzmA的構(gòu)建與鑒定；
[0041]步驟⑵包括以下步驟:將人活性顆粒酶A的PCR擴(kuò)增片段和原核表達(dá)載體 pET24a(+)分別用Nde I和Xho I雙酶切后回收酶切片段，利用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)后涂Kan+LB平板培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單個菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，Nde I和Xho I雙酶切鑒定。挑選陽性重組子進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pET24a(+) -aGzmA。
[0042](3)人活性顆粒酶A表達(dá)菌pET24a (+) -aGzmA/BL21的獲得；
[0043]步驟(3)包括如下步驟:將制備的重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)-aGzmA加入到冰預(yù)冷的大腸桿菌BL21感受態(tài)中，于冰上放置30min后于42°C水浴熱擊90s ;按1: 3加入無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)Ih后涂布于kan+LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑單個菌落培養(yǎng)后即為人活性顆粒酶A表達(dá)菌，命名為pET24a(+) _aGzmA/BL21。
[0044](4)人活性顆粒酶A重組蛋白的表達(dá)和鑒定；
[0045]步驟(4)中的表達(dá)是指:將人活性顆粒酶A表達(dá)菌PET24a(+)-aGzmA/BL21接種于 LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜后再轉(zhuǎn)接于新的LB培養(yǎng)基中，搖菌至0D600 = 0.6~0.8之間；加 A IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h后于12000rpm離心2min，收集的菌體即為表達(dá)菌。
[0046]步驟⑷中的鑒定是指:用PBS重懸表達(dá)菌體后，取樣加入2XSDS凝膠上樣緩沖液，于100°C煮沸IOmin ;將離心后的上清作為樣品，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE分析；菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，以小鼠抗His多克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，Western Blot鑒定人活性顆粒酶A的表達(dá)。[0047](5)人活性顆粒酶A重組蛋白的純化；
[0048]步驟(5)中的包括以下步驟:將工程菌pET24a(+)_aGzmA/BL21用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體并用PBS重懸，然后置于超聲波破碎儀中進(jìn)行超聲破碎；4°C、12000rpm，離心 15min后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測到人活性顆粒酶A重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中；將沉淀用結(jié)合緩沖液0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、5mM咪唑、10% 甘油、8M尿素)重懸，使包涵體中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次離心，收集獲得的上清，
0.45 濾膜過濾；將過濾后的溶液通過預(yù)處理好的鎳層析柱后，用結(jié)合緩沖液和洗滌緩沖液(0.5MNaCl、20mM Tis_HCl、60mM咪唑、10%甘油、8M尿素)洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，最后用洗脫緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、500mM咪唑、10 %甘油、8M尿素)將人活性顆粒酶A 重組蛋白洗脫下來。洗脫下來的溶液放入到透析袋中進(jìn)行透析，尿素和咪唑析出，透析袋中的蛋白即為高純度的人活性顆粒酶A重組蛋白。
[0049](6)人活性顆粒酶A重組蛋白的活性鑒定。
[0050]驟(6)中的活性鑒定是指:先將500 u 120mM BLT貯存液、500 u 120mM DTNB貯存液、500 u 11% Triton X-100 和 48.5ml PBS 混合配制 BLT 底物溶液。取 200 yl BLT 底物溶液加入到96孔板中，再加入20 ii I人活性顆粒酶A重組蛋白，37°C放置20min，用酶標(biāo)儀測定其在412nm處的吸光度值。
[0051]實施例1
[0052]本實施例是本發(fā)明方法中重組質(zhì)粒pET24a(+)-aGzmA的構(gòu)建及鑒定，其流程如圖1所示，具體過程如下:
[0053]1.人活性顆粒酶A的DNA片段的獲得
[0054]根據(jù)GenBank中人顆粒酶A全長序列(CR456968.1)設(shè)計人活性顆粒酶A上下游引物，并引入相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點，上游引物序列(SEQ ID N0.1)為:5’-GGAA TTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3'(下劃線部分為Nde I酶切位點，85-103)下游引物序列(SEQ ID N0.2)為:5’ -CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3，(下劃線部分為 Xho I 酶切位點，769-786)。以含人顆粒酶A全長基因序`列的質(zhì)粒pET24a-GzmA為模板，利用人活性顆粒酶A的特異性引物SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段大小為723bp (包括人活性顆粒酶A基因序列702bp和部分上下游引物序列2ibp)，其中人活性顆粒酶A基因序列詳細(xì)如 SEQ ID N0.3 所示。PCR 反應(yīng)條件為 94°C 2min ；94°C 45s, 58°C 30s, 72°C lmin, 共35個循環(huán)；72°C再延伸IOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分析并回收。
[0055]人活性顆粒酶A基因PCR擴(kuò)增的電泳分析結(jié)果，如圖2所示。含人顆粒酶A全長基因的質(zhì)粒pET24a-GzmA的構(gòu)建方法見文獻(xiàn)(生物制品學(xué)雜志? 2012，25 (2):68-70.)。簡言之，根據(jù)GenBank公布的人顆粒酶A基因序列(CR456968.1)設(shè)計并合成引物，抽提NK92 細(xì)胞株總RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增得到人顆粒酶A全長基因。將人顆粒酶A全長基因的PCR 產(chǎn)物用EcoR I和Xho I雙酶切后插入到原核表達(dá)載體pET24a(+)相應(yīng)酶切位點中，構(gòu)建含人顆粒酶A全長基因的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定并進(jìn)行測序驗證，測序正確的質(zhì)粒命名為pET24a-GzmA。
[0056]2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)-aGzmA的構(gòu)建與鑒定
[0057](I)將人活性顆粒酶A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用Nde I和Xho I于37°C雙酶切3-8小時，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)同樣酶切處理的載體質(zhì)粒pET24a(+)在T4DNA連接酶作用下于16°C連接過夜，得到的連接產(chǎn)物是pET24a(+)-aGzmA重組質(zhì)粒。
[0058](2)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)菌后，涂Kan+LB平板進(jìn)行培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單個菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，Nde I和Xho I雙酶切鑒定。其酶切鑒定圖譜如圖3所示，在712bp (包括人活性顆粒酶A基因序列702bp和酶切位點序列IObp) 處有一特異性DNA條帶(第三泳道)，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。將該重組質(zhì)粒送生物公司進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示該基因序列與GenBank公布的序列一致。測序正確的質(zhì)粒命名為 pET24a (+)-aGzmA。
[0059]實施例2
[0060]本實施例為將實施例1中的重組質(zhì)粒pET24a (+) -aGzmA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21獲得工程菌PET24a(+)-aGzmA/BL21，并進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定，具體過程如下:
[0061]1.人活性顆粒酶A表達(dá)菌pET24a(+)_aGzmA/BL21的獲得
[0062](I)取4 ill重組質(zhì)粒pET24a (+) -aGzmA加入冰預(yù)冷的200 U I大腸桿菌BL21感受態(tài)中，冰上放置30min，42°C水浴熱激90s，然后迅速置冰上冷卻3min。加入600 U I不含抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻后置于37°C振蕩培養(yǎng)60min，取菌液涂布于kan+LB平板，正放平皿于37°C培養(yǎng)箱中30min，待其完全吸收后，倒置培養(yǎng)12-16小時直至單個菌落出現(xiàn)。
[0063](2)挑單菌落接種到kan+LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并經(jīng)雙酶切鑒定正確的大腸桿菌即為人活性顆粒酶A表達(dá)菌，命名為pET24a (+) -aGzmA/BL21。
[0064]2.人活性顆粒酶A重組蛋白的表達(dá)和鑒定
[0065](I) pET24a (+) -aGzmA/BL21 工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0066]從kan+LB平板上 挑取單菌落接種到3ml LB培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素)中， 370C 220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日按I %轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中后，37°C，220rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2~3h至0D600達(dá)到0.6-1.0。加入終濃度為lmmol/L的IPTG，37°C誘導(dǎo)表達(dá)6h。同時設(shè)pET24a(+)-aGzmA/BL21工程菌未誘導(dǎo)對照、空載體轉(zhuǎn)化菌pET24a(+)/BL21誘導(dǎo)對照和空白菌BL21誘導(dǎo)對照。
[0067](2)人活性顆粒酶A重組蛋白的鑒定
[0068]吸取Iml 菌液，12000rpm 離心 lmin，收集菌體。加入 80 y I PBS 和 20 y 15 X SDS 上樣緩沖液，混勻，煮沸l(wèi)Omin，使蛋白質(zhì)變性且與上樣緩沖液中的SDS、P -巰基乙醇充分結(jié)合。12000rpm離心lOmin，取上清進(jìn)行電泳。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示，在
26.0-33.0KDa處有一特異性蛋白條帶(第三泳道)，與預(yù)期的人活性顆粒酶A重組蛋白分子量相符。由于該重組蛋白為含有His標(biāo)簽的融合蛋白，將凝膠轉(zhuǎn)膜后，以小鼠抗His單克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，利用Western Blot對該重組蛋白進(jìn)行鑒定，其結(jié)果如圖5所示，在25.0-35.0KDa處有一特異性顯色條帶(第三泳道)，表明該重組蛋白能特異性地與抗His單克隆抗體結(jié)合。
[0069]實施例3
[0070]將實施例2中的重組蛋白利用鎳親和層析柱進(jìn)行分離純化，并對純化蛋白進(jìn)行活性測定，具體過程如下:
[0071]1.人活性顆粒酶A重組蛋白的分離純化
[0072](I)重組蛋白表達(dá)形式的確定[0073]表達(dá)菌體用PBS重懸后，置于超聲破碎儀中進(jìn)行超聲破碎。超聲條件為工作3s，間歇3s，400W，超聲總時長為lh，每30min添加冰塊并稍作等待，使菌液溫度下降，防止炭化。 破碎后，于4°C 12000rpm離心20min，取一定量的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，其結(jié)果如圖6所示，人活性顆粒酶A重組蛋白主要存在于沉淀中(第五泳道)，表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。
[0074](2)重組蛋白包涵體的制備與處理
[0075]將表達(dá)菌體超聲破碎儀破碎后，離心收集沉淀，用結(jié)合緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、5mM咪唑、10%甘油、8M尿素)重懸，使包涵體中的蛋白溶解在尿素溶液中，再次離心，收集獲得的上清，0.45 um濾膜過濾。 [0076](3)重組蛋白的鎳柱親和層析純化
[0077]用5個體積的50mMNiS04通過His親和層析柱以后，Ni2+與凝膠通過親和力結(jié)合在一起，再分別用5個體積的雙蒸水和5個體積的結(jié)合緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl, 5mM咪唑、10%甘油、8M尿素)洗去未結(jié)合的Ni2+。
[0078]將制備的重組蛋白溶液通過預(yù)處理好的鎳層析柱后，人活性顆粒酶A重組蛋白通過His與Ni2+親和吸附，然后用10個體積的結(jié)合緩沖液和6個體積的洗滌緩沖液(0.5M NaCl、20mMTis-HCl、60mM咪唑、10%甘油、8M尿素)將不能結(jié)合的雜質(zhì)洗掉，最后用3個體積的洗脫緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl、500mM咪唑、10%甘油、8M尿素)將人活性顆粒酶A重組蛋白洗脫下來，每管2mL依次收集洗脫液。
[0079]洗脫下來的人活性顆粒酶A重組蛋白溶液中含有8M尿素和500mM咪唑，將其放入處理好的透析袋中，透析袋浸透在不含尿素和咪唑的緩沖液(0.5M NaCl、20mM Tis-HCl, 10%甘油)中，尿素和咪唑析出，袋中的蛋白即為高純度的人活性顆粒酶A重組蛋白。人活性顆粒酶A重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，含人活性顆粒酶A蛋白序列、Xho I酶切位點對應(yīng)的氨基酸序列和6個組氨酸序列。將純化蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，其結(jié)果如圖7所示，表明利用鎳柱親和層析法可得到純度高達(dá)95%以上的重組蛋白。
[0080]2.人活性顆粒酶A重組蛋白的活性鑒定
[0081]根據(jù)人活性顆粒酶A可以裂解BLT底物溶液的特點，先按500 iil20mM BLT貯存液、500 u 120mM DTNB 貯存液、500 U 11% Triton X-100 和 48.5ml PBS 的配方配制 BLT 底物溶液。取200 ill BLT底物溶液加入到96孔板中，再加入20 U I人活性顆粒酶A重組蛋白，37 °C放置20min，用酶標(biāo)儀測定其在412nm處的吸光度值。同時分別以PBS和透析液為空白對照和陰性對照，其結(jié)果如圖8所示，表明純化的人活性顆粒酶A重組蛋白具有較高的酶解活性。
[0082]本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種人活性顆粒酶A重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:a)獲得人活性顆粒酶A的DNA片段以含有人顆粒酶A全長基因的質(zhì)粒pET24a-GzmA為模板，經(jīng)PCR獲得所述人活性顆粒酶A的DNA片段；b) 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)_aGzmA將所述人活性顆粒酶A基因的DNA片段和原核表達(dá)載體pET24a(+)分別用Nde I和Xho I雙酶切后回收酶切片段，利用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，得到所述PET24a(+)-aGzmA 重組質(zhì)粒；c)獲得人活性顆粒酶A表達(dá)菌pET24a(+) -aGzmA/BL21將重組表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)-aGzmA加入到冰預(yù)冷的大腸桿菌BL21感受態(tài)中，于冰上放置30min后于42°C水浴熱擊90s ;加入無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)Ih后涂布于kan+LB平板,經(jīng) 37°C培養(yǎng)過夜，得到所述人活性顆粒酶A表達(dá)菌PET24a(+)-aGzmA/BL21 ；d)人活性顆粒酶A重組蛋白的表達(dá)和鑒定將所述人活性顆粒酶A表達(dá)菌PET24a(+)-aGzmA/BL21接種于LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜后再轉(zhuǎn)接于新的LB培養(yǎng)基中，搖菌至0D600 = 0.6~0.8之間；加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h后于12000rpm離心2min,得到含有所述人活性顆粒酶A重組蛋白的菌體；e)人活性顆粒酶A重組蛋白的純化將所述菌體用PBS重懸，置于超聲波破碎儀中進(jìn)行超聲破碎；離心收集沉淀，經(jīng)重懸、 離心，過濾；將過濾后的溶液通過預(yù)處理好的鎳柱進(jìn)行親和層析純化，得到純化的人活性顆粒酶A重組蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)的人活性顆粒酶A基因的PCR擴(kuò)增中，上游引物序列(SEQ ID N0.1):5，-GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3';下游引物序列(SEQ ID N0.2):5，-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3’。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d)所述的誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為ImM; 2XSDS凝膠上樣緩沖液的成分包括IOOmM pH6.8Tris_HCl、20%甘油、4% SDS、200mM2_巰基乙醇、0.2%溴酚蘭。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e)中所述鎳柱親和層析純化是:將 NiSO4通過親和層析凝膠柱以后，Ni2+與凝膠親和吸附；當(dāng)帶His標(biāo)記的人活性顆粒酶A重組蛋白濾液通過鎳柱時，人活性顆粒酶A重組蛋白與Ni2+親和吸附；用結(jié)合緩沖液和洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，用含高濃度咪唑的洗脫緩沖液使親和力減弱，將人活性顆粒酶A 重組蛋白洗脫下來；將其加入到透析袋中，浸透在不含尿素和咪唑的緩沖液中，尿素和咪唑析出，得到高純度的人活性顆粒酶A重組蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液的成分包括0.5MNaCl, 20mMTis-HCl、5mM咪唑、10 %甘油、8M尿素；所述洗滌緩沖液的成分包括0.5M NaCl, 20mMTis-HCl、60mM咪唑、10 %甘油、8M尿素；所述洗脫緩沖液的成分包括0.5M NaCl、 20mMTis-HCl、500mM 咪唑、10%甘油、8M 尿素。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述不含尿素和咪唑的緩沖液的成分為 0.5MNaCl、20mM Tis_HCl、10%甘油。
【文檔編號】C12N15/57GK103555742SQ201310407820
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】江文正, 胡雪菲 申請人:華東師范大學(xué)