一種高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，它是導(dǎo)入了乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的編碼基因的梭菌。本發(fā)明還公開了上述基因工程菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用。通過本發(fā)明的方法，丙酮丁醇梭菌平均乙偶姻產(chǎn)量達到5g/L左右。
【專利說明】一種高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]3-羥基丁酮，又名乙偶姻(acetoin)、乙酰甲基甲醇，通常為淡黃色液體或晶體，天然存在于玉米、葡萄、草莓、干酪、肉類等食品中，是一種應(yīng)用廣泛的香料，我國國家標準GB2760-86規(guī)定其為允許使用的食用香料，美國食品和萃取協(xié)會(FEMA)安全號為2008。此夕卜，3-羥基丁酮還可以作為化學(xué)合成中的重要原料，比如可用于合成手性近晶材料和向列材料。
[0003]3-羥基丁酮的傳統(tǒng)化工制備主要是采用化學(xué)法或者酶法轉(zhuǎn)化，其原料主要是雙乙酰(丁二酮)和2，3-丁二醇。但是這些方法的原料昂貴，而且往往條件苛刻，設(shè)備要求高。另夕卜，還可以采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮。在微生物中，兩分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)作用下合成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸經(jīng)乙酰乳酸脫竣酶(acetolactate decarboxylase, ALDC)作用即可生成3_輕基丁麗。在一些微生物中，3-羥基丁酮還可以被進一步還原生成2，3- 丁二醇。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多可以產(chǎn)生3-羥基丁酮的菌種，例如:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等奶制品或者釀酒發(fā)酵菌株,可以產(chǎn)生少量的3-輕基丁酮(通常低于lg/L)。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)氣節(jié)桿菌(Enterobacter aerogenes)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)等主要用來生產(chǎn)2，3- 丁二醇的菌種也能夠產(chǎn)生3-羥基丁酮。
[0004]丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum),是目前生產(chǎn)丁醇的主要菌種。其發(fā)酵產(chǎn)物除丁醇外，還有丙酮和乙醇，因此在生產(chǎn)中又被稱為ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)發(fā)酵。通常,60g/L的葡萄糖經(jīng)丙酮丁醇梭菌發(fā)酵可產(chǎn)生12g/L的丁醇，6g/L的丙酮以及2g/L的乙醇，丁醇:丙酮:乙醇的比值為6:3:1 (w/w)。除ABE外，丙酮丁醇梭菌還會產(chǎn)生少量的3-羥基丁酮。在丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC824 中，3-羥基丁酮的產(chǎn)量通常情況下不足 lg/L (Collas, F., Kuit, ff., Clement, B.，MarchaljR.，Lopez-Contrerasj A.Μ.，MonotjF.，2012.Simultaneous production ofisopropanol，butanol, ethanol and 2，3-butanediol by Clostridium acetobutylicumATCC824engineered strains.AMB Express2,45 ;Roos，J.W.，McLaughlin，J.K., Papoutsakisj E.T., 1985.The effect of pH on nitrogen supply, cell lysis, andsolvent production in fermentations of Clostridium acetobutylicum.Biotechnol.Bioeng.27，681-694)。在控制攪拌速度和壓力的條件下，3-羥基丁酮最高產(chǎn)量達到2.2g/L (Doremus, M.G., Linden, J.C., Moreiraj A.R., 1984.Agitation and pressure effectson acetone-butanol fermentation.Biotechnol.Bioeng.27，852-860)。Kanouni 等人將丙酮丁醇梭菌ATCC824經(jīng)3-氟 丙酮酸誘變后，篩選得到最高3-羥基丁酮產(chǎn)量達3.5g/L的突變株(A.EI Kanouni, A.M.Junelles, R.Janat1-1drissi, H.Petitdemange, R.Gay, 1989.Clostridium acetobutylicum Mutants Isolated for Resistance to the PyruvateHalogen Analogs.CURRENT MICROBIOLOGY18, 139-144)，據(jù)我們所知，這是丙酮丁醇梭菌中目前文獻報道的最高乙偶姻產(chǎn)量。
[0005]提高丙酮丁醇梭菌的3-羥基丁酮產(chǎn)量有以下幾方面的意義:
[0006](I)提高傳統(tǒng)ABE發(fā)酵的經(jīng)濟效益。目前丁醇價格約1.1萬元/噸，丙酮0.8萬元/噸，乙醇0.55萬元/噸。按照3噸糖產(chǎn)I噸溶劑來算，ABE發(fā)酵的產(chǎn)品價值只是略高于原料(約3200元/噸糖)，使得生物法生產(chǎn)ABE經(jīng)濟效益很差。然而3-羥基丁酮價格較高，化學(xué)法制備的3-羥基丁酮價格約10萬元/噸，生物法生產(chǎn)的3-羥基丁酮約25萬元/噸。因此提高ABE發(fā)酵中的3-羥基丁酮產(chǎn)量將顯著提高ABE發(fā)酵的經(jīng)濟效益。
[0007](2)有利于開發(fā)以3-羥基丁酮為代謝前體的其他重要化學(xué)品。ABE發(fā)酵中，丁醇是一個疏水性很強的化合物，對細胞有很大的毒性，限制了丁醇的發(fā)酵效率。相比丁醇，2，3-丁二醇或者2-丁醇對細胞的毒性較小。尤其是2-丁醇具有與1-丁醇相似的性質(zhì)，因此可以替代1-丁醇用于第二代生物燃料。通過在丙酮丁醇梭菌中導(dǎo)入乙偶姻還原酶即可將3-羥基丁酮還原生成2，3- 丁二醇，2，3- 丁二醇同時也是2- 丁醇的前體。然而研究表明丙酮丁醇梭菌中3-羥基丁酮的合成是這些途徑中的限制步驟(WardWell，S.A., Yang, Y.T., Chang, H.Y., San, K.Y., Rudolph, F.B., Bennett, G.N., 2001.Expressionof the Klebsiella pneumoniae CG21acetoin reductase gene in Clostridiumacetobutylicum ATCC824.J Ind Microbiol Biotechnol.27,220-227;Siemerink, M.A, , Kuit, ff., Lopez Contreras, A.M., Eggink, G., van der Oost, J., Kengen, S.ff., 2011.d-2,3-Butane diol Production Due to Heterologous Expression of an AcetoinReductase in Clostridium acetobutylicum.Appl.Environ.Microbiol.77，2582-2588)。因此，強化丙酮丁醇梭菌3-羥基丁酮的合成，提高其產(chǎn)量對2，3- 丁二醇以及2- 丁醇等的開發(fā)都有重要意義。
[0008](3)在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),霍亂弧菌(Vibrio Cholerae)等中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子alsR通過感應(yīng)乙酸的積累和pH的降低并以乙酸為共調(diào)節(jié)物促進ALS和ALDC基因的表達，進而促進3-羥基丁酮的生成。因此3-羥基丁酮的生成避免了微生物生存環(huán)境的酸化，具有“解毒”的作用。然而，在野生丙酮丁醇梭菌中，這種解毒作用主要是通過丙酮等溶劑的生成來完成，這或許是3-羥基丁酮產(chǎn)量低的原因。事實上，在丙酮丁醇梭菌中3-羥基丁酮和丙酮的生成也確實具有此消彼長的相反關(guān)系。因此，通過強化3-羥基丁酮的合成，丙酮產(chǎn)量就會降低。碳源由生成三碳化合物丙酮轉(zhuǎn)向生成四碳化合物3-羥基丁酮，產(chǎn)品得率會進一步提升，并且3-羥基丁酮較丙酮不易揮發(fā)，對產(chǎn)品回收也有幫助。
[0009]為了提高丙酮丁醇梭菌3-羥基丁酮的產(chǎn)量，研究通常強化乙酰乳酸合成反應(yīng)，而非強化乙酰乳酸脫羧反應(yīng)。因為通常認為，乙酰乳酸合成反應(yīng)對3-羥基丁酮的生成貢獻更大，而即使在缺乏ALDC的情況下乙酰乳酸仍可以自發(fā)脫羧生成3-羥基丁酮。然而，無論是在丙酮丁醇梭菌中表達其自身的ALS還是枯草芽孢桿菌的ALS，3-羥基丁酮產(chǎn)量均沒有提高(Wardwel 1，S.A.Metabolism of acetoin in C.acetobutylicum ATCC824.RiceUniversity.1999)。這表明丙酮丁醇梭菌中通過表達ALS來強化乙酰乳酸的合成反應(yīng)對3-羥基丁酮產(chǎn)量的影響甚小。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，通過強化乙酰乳酸脫羧反應(yīng)提高梭菌的3-羥基丁酮產(chǎn)量。
[0011]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0012]本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌的應(yīng)用。
[0013]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0014]一種高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，它是導(dǎo)入了乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的編碼基因的梭菌。
[0015]其中，所述乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的編碼基因來自于梭菌屬、芽孢桿菌屬或克雷伯氏菌屬。具體為如下I)至4)中任一所述的基因:
[0016]I)其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
[0017]2)其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；
[0018]3)嚴格條件下可與序列表中SEQ ID No:1或SEQ ID No:2限定的DNA序列雜交且編碼乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的DNA分子；
[0019]4)與SEQ ID No:1或SEQ ID No:2的序列具有90%以上的同源性且編碼乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的DNA分子。
`[0020]其中，所述的梭菌為丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbuty lacetoni cum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、產(chǎn)芽抱梭(C.sporogenes)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)或肉毒梭菌(C.botulinum)。優(yōu)選為 C.acetobutylicum ATCC824 和
C.acetobutylicum CGMCC5234。
[0021]其中，丙酮丁醇梭菌Clostridium,acetobutylicum CGMCC5234,菌株號為 B3,其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC N0.5234，保藏日期2011年9月9日，該菌株的信息記載在中國專利201210075094.X，申請日2012年3月20日。
[0022]上述高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌的構(gòu)建方法，從梭菌屬、芽孢桿菌屬或克雷伯氏菌屬菌株中克隆乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的基因，并通過電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入梭菌中進行表達。
[0023]上述高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌的構(gòu)建方法，優(yōu)選的是，從丙酮丁醇梭菌
C.acetobutylicum ATCC824中克隆乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的基因，并通過電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum CGMCC5234中進行表達。
[0024]上述高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌在生產(chǎn)3-羥基丁酮中的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的通過強化乙酰乳酸脫羧反應(yīng)來提高3-羥基丁酮產(chǎn)量的方法，可以顯著提高梭菌的乙偶姻產(chǎn)量，使原料由生成丙酮轉(zhuǎn)向生成更多的乙偶姻，而丁醇產(chǎn)量不受影響，即提高了梭菌發(fā)酵的產(chǎn)品得率也提高了梭菌發(fā)酵的產(chǎn)品價值。[0026]有益效果:本發(fā)明的高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌的基因轉(zhuǎn)錄分析表明，乙酰乳酸脫羧反應(yīng)對3-羥基丁酮產(chǎn)量有更大的影響。通過在丙酮丁醇梭菌中強化乙酰乳酸脫羧反應(yīng)，將3_輕基丁麗廣量由初始1.8g/L左右大幅提聞到5g/L左右；而丙麗由4.5g/L左右降低至2g/L，總?cè)軇?ABE和3-羥基丁酮)得率也由0.35g/g提高到0.39g/g。顯著提高了丙酮丁醇梭菌發(fā)酵的經(jīng)濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是丙酮丁醇梭菌代謝網(wǎng)絡(luò)示意圖。
[0028]圖2重組丙酮丁醇梭菌B3 (pIMPl-ALDC)發(fā)酵液氣相色譜圖譜，按出峰先后順序依次為:3.711min,丙酮；4.126min,乙醇；5.409min, 丁醇；6.734min, 3-輕基丁酮；
7.767min,乙酸；9.299min，丁酸。
【具體實施方式】
[0029]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0030]下述實施例中如無特殊說明，所用方法均為常規(guī)方法，如《分子克隆:實驗室手冊》(New York:Cold Spring Habor Laboratary Press, 1989)中所述的方法。所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。
[0031]下述實施例以丙酮丁醇梭菌為例闡明本發(fā)明的提高梭菌3-羥基丁酮產(chǎn)量的方法。
[0032]酵母粉購自英國OXIOD公司，目錄號1023098 ;蛋白胨購自英國OXIOD公司，目錄號 594566。
[0033]LB培養(yǎng)基配方為:10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl,固體培養(yǎng)基另加15g/L瓊脂粉。用于大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)。
[0034]2xYTG培養(yǎng)基配方為:16g/l蛋白胨，10g/l酵母粉，4g/l NaCl, 5g/l葡萄糖。用于培養(yǎng)制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的丙酮丁醇梭桿菌。
[0035]P2平板培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨3g/L,七水合硫酸鎂3g/L,乙酸銨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，磷酸氫二鉀lg/L，瓊脂粉15g/L。
[0036]實施例1:構(gòu)建含有乙酰乳酸脫羧酶基因CAC2967表達質(zhì)粒的丙酮丁醇梭菌。
[0037]采用細菌基因組試劑盒提取對數(shù)生長中后期的丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC824基因組DNA，用以下引物進行PCR擴增其乙酰乳酸脫羧酶基因CAC2967:
[0038]ALDC-s CATATGATTGAAGAAGTGATCCCTAATCAT (劃線部分為 NdeI 識別位點)；
[0039]ALDC-as GAAATAAGTAAAGTTGAGAAATAACATATG (劃線部分為 NdeI 識別位點)。
[0040]采用TAKARA公司的高效保真酶Primerstart進行PCR擴增，擴增程序為:950C 3min ；98°C 10s、55°C 15s、72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序后確定其序列如SEQ ID No:1所示。
[0041]將所得PCR產(chǎn)物純化回收后，與經(jīng)Nde I酶切后的pMPI_ptb載體(Mermelstein, L.D., Welker, N.E., Bennett, G.N., Papoutsakis, E.T., 1992.Expressionof cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC824.BiotechnologylO, 190 - 195)在T4DNA連接酶作用下連接，構(gòu)建得到載體pMPl-ALDC。
[0042]將質(zhì)粒P 頂 Pl-ALDC 轉(zhuǎn)化到 E.coli T0P10 (pAN2)中，E.col i ToplO 購自北京天根生化科技有限公司(目錄號CB104)。pAN2為甲基化質(zhì)粒(Heap, J.T., Pennington, 0.J., Cartman, S.T., Carter, G.P., Minton, N.P., 2007.The ClosTron: a universal geneknock-out system for the genus Clostridium.J Microbiol Methods70, 452-464)。并將轉(zhuǎn)化后細胞涂布于含有氨芐青霉素和四環(huán)素素的LB平板上，挑取單菌落富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，P IMP 1-ALDC質(zhì)粒即是甲基化后的P IMP 1-ALDC質(zhì)粒。
[0043]厭氧條件下，取2xYTG培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長至對數(shù)中期的C.acetobutylicum B3(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC N0.5234;地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)培養(yǎng)液60ml,4°C、4000rpm離心IOmin棄去上清,加入足量預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液EPB (270mM蔗糖，5mM NaH2PO4, pH7.4)，洗滌兩次，并用2.3ml EPB重懸。然后取570ul加入0.4cm電轉(zhuǎn)杯放置在冰浴中冷卻，并加入20ul甲基化的pMP1-ALDC質(zhì)粒，冰浴放置2min。2.0kV電壓，25uF電容進行電轉(zhuǎn)化。隨后將電轉(zhuǎn)液加入到lml37°C的2xYTG培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)4h，離心收集細胞IOOul并將細胞涂布于含有2.5ug/ml紅霉素的P2平板中。厭氧培養(yǎng)24-36h后，獲得含有pMPl-ALDC質(zhì)粒的重組丙酮丁醇梭菌，命名為C.acetobutylicum B3(pIMPl-ALDC)。
[0044]實施例2:構(gòu)建含有乙酰乳酸脫羧酶基因BSU36000表達質(zhì)粒的丙酮丁醇梭菌。
[0045]采用細菌基因組試劑盒提取對數(shù)生長中后期的枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)CGMCC N0.3720 (記載于中國專利201010171377.5中)。用以下引物進行PCR擴增其乙酰乳酸脫羧酶基因BSU36000:
[0046]BSU36000-S CATATGATGAAACGAGAAAGCAACATTC (劃線部分為 NdeI 識別位點)；
[0047]BSU36000-as TGAAGGAAGCCCTGAATAACATATG (劃線部分為 NdeI 識別位點)。擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后確定其序列如SEQ ID No:2所示。將擴增產(chǎn)物按照實施例1的方法導(dǎo)入丙酮丁醇梭菌獲得含有PMP1-BSU36000質(zhì)粒的重組丙酮丁醇梭菌，命名為C.acetobutylicumB3(pIMPl-BSU36000)。
[0048]實施例3:利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)ABE和3_羥基丁酮。
[0049]丙酮丁醇梭桿菌(C.acetobutylicum) B3 (pIMPl-ALDC)和 B3 (pMPl_BSU36000)在P2種子培養(yǎng)基(不加瓊脂，其他組分同P2平板培養(yǎng)基)中37°C靜止培養(yǎng)12h。分別以10% (v/v)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下=K2HPO40.5g/LjKH2PO40.5g/L;CH#00NH42.2g/L ；MgS04.7Η200.2g/L;MnSO4.H2O0.01g/L;NaC10.0lg/LjFeSO4.7H200.0lg/L ;對氨基苯酸 lmg/L;硫胺 lmg/L;生物素 0.01mg/L。37°C厭氧發(fā)酵60h。發(fā)酵液組分用氣相色譜檢測，氣相色譜檢測條件如下:火焰離子檢測器(FID)，AgilentHP-1NN0WAX19091N-236 毛細管色譜柱(60mX0.25mmX0.25um)，N2 為載氣，流速 2mL/min，分流比90:1，H2流速30ml/min，空氣流速300ml/min，進樣口溫度180°C，檢測器220°C，柱溫(程序升溫):70°C保留0.5min，然后以20°C /min的速率升溫到190°C，保留4min。氣相色譜出峰先后順序見圖2。發(fā)酵結(jié)果見表1，其中丙酮丁醇梭桿菌B3 (pIMPl-ALDC)和B3(pIMPl-BSU36000)所對應(yīng)的數(shù)據(jù)為任意挑選的10株重組菌的平均數(shù)據(jù)。
[0050]表I重組丙酮丁醇梭菌pMPl-ALDC及對照菌株發(fā)酵結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，其特征在于，它是導(dǎo)入了乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的編碼基因的梭菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的編碼基因來自于梭菌屬、芽孢桿菌屬或克雷伯氏菌屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的編碼基因具體為如下I)至4)中任一所述的基因: 1)其核苷酸序列如SEQID No:1所示； 2)其核苷酸序列如SEQID No:2所示； 3)嚴格條件下可與序列表中SEQID No:1或SEQ ID No:2限定的DNA序列雜交且編碼乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的DNA分子； 4)與SEQID No:1或SEQ ID No:2的序列具有90%以上的同源性且編碼乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述的梭菌為丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、產(chǎn)芽抱梭(C.sporogenes)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)或肉毒梭菌(C.botulinum)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述梭菌為C.acetobutylicum ATCC824 和 C.acetobutylicum CGMCC5234。
6.權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，從梭菌屬、芽孢桿菌屬或克雷 伯氏菌屬菌株中克隆乙酰乳酸脫羧反應(yīng)酶的基因，并通過電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入梭菌中進行表達。
7.權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)3-羥基丁酮的基因工程菌在生產(chǎn)3-羥基丁酮中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/60GK103436479SQ201310408255
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】應(yīng)漢杰, 丁鳳英, 陳勇, 柳東, 郭亭, 謝婧婧 申請人:南京工業(yè)大學(xué)