一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應(yīng)用。一種Hsa-miR-145-5p試劑盒，包括Hsa-miR-145-5p基因定量檢測組分：包括Hsa-miR-145-5pPCR引物，10mM濃度的dNTP，RNase抑制劑，microRNA/cDNA逆轉(zhuǎn)錄引物，5倍濃度的buffer液，M-MLV，2倍濃度的SYBRGreenPCRMasterMix混合液及去離子水；Hsa-miR-145-5p熒光原位雜交探針：為與Hsa-miR-145-5p堿基互補的堿基序列，用DNA骨架、熒光基團cy3修飾；FSCN1免疫組化組分。本發(fā)明可用于喉鱗癌分子靶向治療藥物。
【專利說明】一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種人屬微小RNA，具體涉及一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]頭頸鱗癌為全世界第六位高發(fā)腫瘤，位居歐洲男性高發(fā)腫瘤的第4位，而喉鱗癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)源于喉黏膜上皮，發(fā)病率居頭頸鱗癌的第2位。據(jù)統(tǒng)計，目前全世界范圍內(nèi)喉鱗癌發(fā)病略有上升，且年輕化趨勢逐漸顯現(xiàn)。
[0003]喉解剖結(jié)構(gòu)局限且黏膜下淋巴管豐富，因此喉鱗癌具有局部侵襲及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)特性，成為患者治療后復(fù)發(fā)及預(yù)后不良的重要風(fēng)險因素，這也是近30年來喉鱗癌5年生存率并未有明顯提升的一個重要因素。在喉鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的過程中勢必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的異常表達，如抑癌基因的下調(diào)表達，癌基因的上調(diào)表達。因此探索這些與喉鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達紊亂的分子生物學(xué)機制著重要的臨床意義。
[0004]microRNAs (miRNAs)是目前新發(fā)現(xiàn)的一類長度約為22nt的內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，它能夠與其相應(yīng)靶基因信使RNA (mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(3’ -UTR區(qū))結(jié)合，從而降解mRNA或抑制其翻譯。研究表明miRNAs與腫瘤關(guān)系密切，充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤細胞生長、增殖、分化、凋亡、惡性間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細胞分化等方面發(fā)揮重要作用。
[0005]目前發(fā)現(xiàn)人類基因組編碼多達2000多種不同的miRNAs，miRNA調(diào)控基因組約30%編碼基因的表達。研究顯示約50%的miRNA位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或脆性位點，且不同類型腫瘤中miRNA表達譜存在較大差異。一些miRNA在惡性腫瘤中表達上調(diào)，這類miRNAs能通過抑制腫瘤抑制基因或控制細胞周期進程、分化或凋亡的基因，刺激細胞增殖及血管生成，促進腫瘤發(fā)生，這類miRNAs具有癌基因的作用，因此被稱為致癌性miRNA。與致癌性miRNA相反，在惡性腫瘤中表達下調(diào)的一些miRNAs可能通過負向調(diào)控癌基因和/或負向調(diào)控抑制細胞分化或凋亡的基因發(fā)揮抑癌基因的作用，稱為抑癌性miRNA。
[0006]越來越多的研究表明，具有致癌或抑癌作用的miRNA分子參與了包括肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腦腫瘤及白血病在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。迄今，miRNA的功能與癌癥形成的相關(guān)性研究已成為國內(nèi)外的熱點方向。目前在喉鱗癌的研究中，涉及miRNAs報道或相關(guān)研究極少。
[0007]發(fā)明人通過microRNA 芯片(Agilent human 8*15k miRNA V12.0)檢測了多名喉鱗癌患者及同患者癌旁正常黏膜切緣蠟包埋組織中差異表達的micix)RNA分子，發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中比癌旁正常黏膜組織中下調(diào)了約2.74倍，這說明Hsa-miR-145-5p可能在喉鱗癌中充當(dāng)抑癌基因的角色，發(fā)明人進一步通過生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光報告載體系統(tǒng)，結(jié)合喉鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的特點，描錠并驗證了 FSCNl是Hsa-miR-145-5p直接調(diào)控靶基因。
[0008]發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種Hsa-miR-145-5p試劑盒及其成熟體模擬物的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明是以Hsa-miR-145-5p 的前體序列 hsa-mir-145 M10000461 為 SEQ IDNo:1:CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU,為基礎(chǔ)進行的發(fā)明。
[0010]本發(fā)明提供了一種Hsa-miR-145_5p試劑盒,是由以下組合試劑構(gòu)成的: Hsa-miR-145-5p基因定量檢測組分:包括Hsa-miR-145_5p PCR引物，IOmM濃度的
dNTP, RNase抑制劑，microRNA/cDNA逆轉(zhuǎn)錄引物，5倍濃度的buffer液，M-MLV, 2倍濃度的SYBR Green PCR Master Mix混合液及去離子水；
Hsa-miR-145-5p熒光原位雜交探針:為與Hsa-miR-145_5p堿基互補的堿基序列，并采用DNA骨架修飾，同時用熒光基團cy3修飾；
FSCNl免疫組化組分:包括鼠抗人FSCNl單克隆抗體，鑲嵌過氧化物酶基團的羊抗鼠二抗，山羊非免疫血清，100倍濃度的PBS及1%。吐溫20混合液，DAB顯色色原、底物及緩沖液。
[0011]上述的試劑盒在喉鱗癌預(yù)后評估中的應(yīng)用，優(yōu)選地針對喉鱗癌石蠟包埋樣本。
[0012]進一步地，本發(fā)明還提供Hsa-miR-145-5p成熟體的模擬物在喉鱗癌細胞系H印_2及TU-177建立的喉鱗癌裸鼠移植瘤模型中的抗腫瘤治療，所述的Hsa-miR-145-5p成熟體模擬物hsa-miR-145-5p MIMAT0000437序列為為 SEQ ID No: 2:⑶CCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU，特征在于所有核苷酸進行2’ -甲氧基修飾，和/或5’端進行硫代修飾，和/或3’端進行硫代修飾，和/或5’或者3’端進行膽固醇修飾。
[0013]更進一步地，上述的Hsa-miR-145-5p的成熟體的模擬物對喉鱗癌細胞株H印-2及TU-177中細胞惡性間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物，即E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白的抑制表達。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)路線包括:
Hsa-microRNA-145-5p及其靶基因FSCNl所組成的試劑盒用于喉鱗癌預(yù)后評估(I)發(fā)明人基于 microRNA 芯片(Agilent human 8*15k miRNA V12.0)檢測了 4 例喉鱗癌患者及同一患者癌旁正常黏膜切緣蠟包埋組織中差異表達的microRNA分子，發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中比癌旁正常黏膜組織中下調(diào)了約2.74倍(P〈0.05)，表明Hsa-miR-145-5p是喉鱗癌中潛在的抑癌基因。
[0015](2)發(fā)明人結(jié)合喉鱗癌有易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵潤生長的特點，利用生物信息學(xué)預(yù)測到靶基因FSCNl,FSCNlmRNA全序列為，SEQ ID No:3。FSCNl與上皮源性腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，是一種潛在的癌基因。發(fā)明人通過雙熒光報告載體系統(tǒng)驗證了 Hsa-miR-145-5p與其靶基因FSCNl存在直接調(diào)控關(guān)系。
[0016](3)發(fā)明人提取了 188例喉鱗癌石蠟樣本總RNA，利用頸環(huán)引物法，經(jīng)qRT_PCR檢測發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-145-5p表達水平與喉鱗癌患者`不良臨床參數(shù)呈負相關(guān)，且表達水平越低，喉鱗癌患者的預(yù)后越差。
[0017](4)發(fā)明人利用免疫組化技術(shù)觀察了 188例喉鱗癌石蠟樣本切片中FSCNl的表達，發(fā)現(xiàn)FSCNl表達與喉鱗癌患者的不良臨床參數(shù)呈正相關(guān)，且表達水平越高，喉鱗癌患者的預(yù)后越差。
[0018](5)發(fā)明人通過進一步統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在Hsa-miR-145_5p低表達喉鱗癌中，F(xiàn)SCNl蛋白高表達占53.2%，低表達占16.0% ;而Hsa-miR-145_5p高表達喉鱗癌中，F(xiàn)SCNl蛋白低表達占84.0%，高表達占46.8%，呈現(xiàn)相反趨勢(P〈0.001)。秩和檢驗顯示在123例FSCNl蛋白高表達樣本中，Hsa-miR-145-5p表達強度低于其在65例FSCNl蛋白高表達樣本中的表達強度(P〈0.001)。兩者表達情況行相關(guān)性分析，秩相關(guān)系數(shù)r=-0.391 (P〈0.001)，顯示兩者表達為負相關(guān)趨勢。同時發(fā)明人通過熒光原位雜交技術(shù)，利用DNA骨架修飾合成Hsa-miR-145-5p互補的鑲嵌cy3熒光基團的RNA探針對喉癌石蠟切片進行孵育，共聚焦熒光顯微鏡下觀察不同Hsa-miR-145-5p表達狀態(tài)下FSCNl免疫組化的表達情況，同時用U6作為對照探針。發(fā)明人觀察到Hsa-miR-145-5p低表達腫瘤灶內(nèi)，F(xiàn)SCNl蛋白高表達。
[0019](6)發(fā)明人經(jīng)KM 法行生存分析并進行Log-rank檢驗，Hsa-miR-145_5p低表達患者總的平均時間為(85.01±5.24)個月，短于Hsa-miR-145-5p高表達患者總的平均時間(106.09±4.12)個月(X2=9.504，P=0.002);而FSCNl蛋白高表達患者總的平均時間為(79.74±4.43)個月，短于FSCNl蛋白低表達患者總的平均時間(122.83±1.77)個月(X之=33.712，P<0.001)。根據(jù)Hsa-miR-145-5p及FSCNl蛋白表達情況將患者進一步分類，其中miR-145低表達且FSCNl蛋白高表達患者總的平均生存時間為(76.98±5.59)個月，明顯低于miR-145高表達且FSCNl低表達患者總的平均生存時間(123.16±2.03)個月(X 2=27.614,/X0.001)。
[0020](7)發(fā)明人進一步通過(:(《模型，發(fā)現(xiàn)也&1111?-145-5?低表達/^50附蛋白高表達的相對危險度為12.69 (95%CI為2.83~56.91, P=0.001 )，是喉鱗癌患者預(yù)后的獨立影響因素。
[0021]本部分取得的有益技術(shù)效果是Hsa-miR-145-5p及FSCNl可作為喉鱗癌患者預(yù)后評估的分子生物學(xué)指標(biāo)，并可應(yīng)用于喉鱗癌預(yù)后評估的試劑盒。
[0022]成熟體模擬物在喉鱗癌細胞系Hep-2及TU-177建立的喉鱗癌裸鼠移植瘤模型中的抗腫瘤治療。
[0023]2.1發(fā)明人通過細胞培養(yǎng)技術(shù)對喉鱗癌細胞系Hep-2及TU-177進行培養(yǎng)，收集細胞后采用2X 106/100 ii L注射濃度，注射劑量為IOOii L進行造模，成瘤標(biāo)準(zhǔn)0.5mm3。
[0024]2.2發(fā)明人利用化學(xué)修飾合成Hsa-miR-145-5p成熟體模擬物，目的是讓藥物其特征是所有核苷酸進行2’ -甲氧基修飾，和/或5’端兩個核苷酸進行硫代修飾，和/或3’端四個核苷酸進行硫代修飾，和/或5’或者3’端進行膽固醇修飾。目的是使藥物在體內(nèi)發(fā)揮時效延長(如圖5)。結(jié)合藥物說明書及以往文獻參考劑量，注射濃度為lOnmol/0.lmL，注射量為0.1 mL，2次/周/部位(每周第I天、第4天注射)，連續(xù)注射4周。注射起始點為成瘤伊始，標(biāo)準(zhǔn)0.5_3。折射采用“十”多點注射。實驗終止后處死裸鼠，取瘤體并稱重。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩個細胞系的裸鼠移植瘤在接受藥物注射后，其腫瘤生長速度及終末腫瘤重量明顯慢于及低于NC組(注射無義序列)和Mock組(注射無菌PBS液)。
[0025]本部分取得的有益技術(shù)效果是Hsa-miR-145_5p成熟體模擬物經(jīng)過上述修飾，具備喉鱗癌裸鼠模型的抗腫瘤效果，可應(yīng)用于喉鱗癌分子靶向治療藥物。
[0026]成熟體的模擬物用于抑制細胞惡性間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物E-cadherin、N_cadherin、MMP-2及MMP-9的表達。
[0027]通過細胞轉(zhuǎn)染恢復(fù)Hsa-miR-145_5p的表達水平，檢測喉鱗癌細胞株H印-2、TU-177中細胞惡性間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)關(guān)鍵分子E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表達。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)恢復(fù)Hep-2及TU-177中Hsa-miR-145_5p表達后，E-cadherin表達上調(diào)，而 N-cadherin 表達下調(diào)，說明 E-cadherin 及 N-cadherin 是 Hsa-miR-145_5p-FSCNl 軸上的下游效應(yīng)分子；而MMP-2、MMP-9都發(fā)生下調(diào)表達，亦是Hsa-miR-145-5p-FSCNl軸上的下游效應(yīng)分子。這提示Hsa-miR-145-5p模擬物可以干擾喉鱗癌細胞EMT過程中，從而發(fā)揮抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)，有望成為喉鱗癌治療的分子靶向藥物。
[0028]本發(fā)明取得的有益技術(shù)效果是通過體外轉(zhuǎn)染技術(shù)，上調(diào)喉鱗癌細胞系H印-2、TU-177中Hsa-miR-145-5p的表達，可有效抑制細胞惡性間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9的表達，干擾喉鱗癌細胞EMT過程中，從而發(fā)揮抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)，有望成為喉鱗癌治療的分子靶向藥物。
[0029]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1:FSCN1蛋白在喉鱗癌中免疫組化染色；
A =FSCNl在喉鱗癌中陰性表達；B =FSCNl在高分化喉鱗癌中高表達；C =FSCNl在低分化喉鱗癌中高表達；D =FSCNl在聲門上型喉鱗癌中高表達；E =FSCNl在聲門型鱗癌中高表達；F =FSCNl在聲門下型鱗癌中高表達；G:PBS代替一抗的陰性對照。(放大倍數(shù)400倍)。
[0030]圖2 =FSCNl蛋白在不同了匪分期喉鱗癌中免疫組化染色；A=FSCNl在N+期喉鱗癌中的高表達=FSCNl在NO期鱗癌中低表達；C =FSCNl在T4期喉鱗癌中的高表達；D:FSCNl在Tl期喉鱗癌中的低表達。(放大倍數(shù)400倍)
圖3:Hsa-miR-145-5p不同表達狀態(tài)與FSCNl蛋白免疫組化顯色；
A-D:Hsa-miR-145-5p低表達喉癌病例中，癌組織中FSCNl蛋白呈高表達；其中A為細胞核DAPI顯像，B為腫瘤組織中Hsa-miR-145-5p熒光探針原位雜交低信號顯像，C為融合圖，D為腫瘤組織中FSCNl免疫組化染色呈高表達。E-H:Hsa-miR-145-5p低表達喉癌病例中，癌組織FSCNl蛋白呈高表達；其中E為細胞核DAPI顯像，F(xiàn)為腫瘤組織中Hsa-miR-145-5p熒光探針原位雜交呈低信號顯像，G為融合圖，H為該腫瘤組織中FSCNl免疫組化強著色。1-L:Hsa-miR-145-5p高表達喉癌病例中，癌組織FSCNl免疫組化染色強著色；其中I為細胞核DAPI顯像，J為腫瘤組織中Hsa-miR-145-5p熒光探針原位雜交呈高信號，K為融合圖，L為該腫瘤組織中FSCNl免疫組化弱著色。M-P:Hsa-miR-145-5p在正常喉黏膜上皮呈明顯陽性表達，而FSCNl在喉黏膜上皮組織中呈陰性表達。其中M為細胞核DAPI顯像，N為Hsa-miR-145-5p熒光探針原位雜交高信號，0為融合圖，P為FSCNl免疫組化陰性著色。
[0031]圖4:A-C:Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中原位雜交熒光顯像弱信號；D_F:U6在喉鱗癌組織中原位雜交熒光顯像強信號；G-1:Hsa-miR-145-5p在癌旁正常黏膜組織中原位雜交熒光顯像強信號J-L:U6在癌旁正常黏膜中原位雜交熒光顯像強信號。
[0032]圖5:A:Hsa-miR-145-5p不同表達水平喉鱗癌患者生存曲線；B =FSCNl不同表達水平喉鱗癌患者生存曲線；C:Hsa-miR-145-5p與FSCNl不同表達組合分類的喉鱗癌患者生存曲線。
[0033]圖6:Hsa-miR-145-5p成熟體模擬物化學(xué)修飾示意圖。(1)2’-甲氧基修飾，(2)硫代修飾，(3)膽固醇修飾。
`[0034]圖7:裸鼠移植瘤注射經(jīng)化學(xué)修飾的Hsa-miR-145-5p成熟體模擬物后的抑瘤效果。A:TU-177裸鼠移植瘤注射藥物4周期間腫瘤生長曲線；B:A:Hep-2裸鼠移植瘤注射藥物4周期間腫瘤生長曲線；C:剝離后的移植瘤；D:各組移植瘤重量。(* P〈0.05)
圖8:A:Hep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后E-cadherin變化蛋白印跡圖；B:Hep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5表達后E-cadherin蛋白相對變化量；C:Hep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后N-cadherin變化蛋白印跡圖；D:Hep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后N-cadherin蛋白相對變化量。[0035]圖9:A:TU_177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145_5p表達后E-cadherin蛋白變化印跡圖；B:TU-177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后E-cadherin蛋白相對變化量；C:TU-177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145_5p表達后N-cadherin蛋白變化印跡圖；D:TU-177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后N-cadherin蛋白相對變化量。
[0036]圖10:A:1fep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145_5p表達后MMP-2變化蛋白印跡圖；B:Hep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后MMP-2蛋白相對變化量；C:Hep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后MMP-9變化蛋白印跡圖；D:1fep-2細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145_5p表達后MMP-9蛋白相對變化量。
[0037]圖11:A:TU-177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145_5p表達后MMP-2蛋白變化印跡圖；B:TU-177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后MMP-2蛋白相對變化量；C:TU-177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145-5p表達后MMP-9蛋白變化印跡圖；D:TU-177細胞中恢復(fù)Hsa-miR-145_5p表達后MMP-9蛋白相對變化量。
圖12:實施例PCR反應(yīng)條件。
【具體實施方式】
[0038]實施例1
Hsa-microRNA-145-5p及其靶基因FSCNl所組成的試劑盒用于喉鱗癌預(yù)后評估。
[0039]標(biāo)本來源及入選標(biāo)準(zhǔn)
(I)石蠟樣本來源于20001006年期間在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科初診并行手術(shù)的喉鱗癌患者。
[0040](2)患者入院前未行放化療、生物治療；患者除喉部原發(fā)腫瘤外，經(jīng)B超、CT、MR1、PET等檢查排除其他部位原發(fā)腫瘤；患者無乙肝、梅毒、結(jié)核等感染病史，無家族遺傳性疾病史。術(shù)后病理診斷為喉鱗狀細胞癌，癌旁切緣黏膜經(jīng)病理證實為正常黏膜組織；臨床資料記錄詳實。
[0041](3)本實驗經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，并遵循患者知情同意原則。
[0042]石蠟切片中總RNA提取及qRT-PCR檢測
切片機的切片刀經(jīng)去RNA酶處理，切不同樣本時，注意要用不同的接觸點去切，必要時更換新的切片刀。切片過程中，操作員帶帽子口罩。適度修剪組織石蠟包埋組織邊緣多余的石蠟，正式收集樣本前應(yīng)切除2-3片，除去暴露在空氣中的樣本。選擇厚度為20 u m,每個樣本共切4片，放入去RNA酶的EP管中，共計2份，其中1份用于實驗，1份備用。
[0043]試劑盒為美國Ambion?公司針對石臘樣本設(shè)計的總RNA提取試劑盒=RecoverAllTotal Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (AM1975)。按照說明書進行操作，操作步驟簡要概括如下:
(1)向裝有樣本的EP管中加入ImL 100% 二甲苯，充分混合并在50°C下孵育3 min ；
(2)4°C下以最大速度離心2 min,小心倒掉上層的二甲苯溶液；(3)用ImL100%無水乙醇洗兩遍；
(4)樣品管置于超凈臺中，空氣下干燥樣品管內(nèi)殘留的無水乙醇；
(5)樣品管中加入試劑盒附帶的蛋白水解酶4ii L及緩沖液200 u L，50°C下水浴鍋中孵育15 min,80°C下再次孵育15 min ；
(6)加入混有無水乙醇的分離液，將混合液體加入試劑盒附帶的濾柱中，離心；
(7)過濾柱中加入700UL洗滌液I，10000Xg下離心30 sec ；
(8)過濾柱中加入500ii L洗漆液2/3, 1000OXg下離心30 sec ;最后短暫離心一下，以盡量去除殘留液體；
(9)向濾柱中加入60iiL DNase 混合液(6 U L IOX DNase Buffer + 4 U L DNase +50 u L Nuclease-free Water)孵育 30 min ；
(10)過濾柱中加入700UL洗滌液I，10000Xg下離心30 sec ；
(11)過濾柱中加入500ii L洗漆液2/3,10000 Xg下離心30 sec ;最后短暫離心一下，以盡量去除殘留液體；本次洗滌共計2次；
(12)室溫下加入60ii L洗脫液對濾柱中的核酸進行洗脫；
(13)收集樣品置于_20°C下保存?zhèn)溆茫?br> (14)樣品進行質(zhì)檢，于紫外分光光度計中讀取A260/A280OD值。
[0044](15)逆轉(zhuǎn)錄；Hsa-miR-145-5p使用莖環(huán)法，逆轉(zhuǎn)錄引物為廣州萊德爾生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號:LP-mirl45-has ;在去RNase的PCR管中配置以下溶液:
【權(quán)利要求】
1.一種Hsa-miR-145-5p試劑盒,其特征在于,是由以下組合試劑構(gòu)成的: Hsa-miR-145-5p基因定量檢測組分:包括Hsa-miR-145_5p PCR引物，IOmM濃度的dNTP, RNase抑制劑，microRNA/cDNA逆轉(zhuǎn)錄引物，5倍濃度的buffer液，M-MLV, 2倍濃度的SYBR Green PCR Master Mix混合液及去離子水； Hsa-miR-145-5p熒光原位雜交探針:為與Hsa-miR-145_5p堿基互補的堿基序列，并采用DNA骨架修飾，同時用熒光基團cy3修飾； FSCNl免疫組化組分:包括鼠抗人FSCNl單克隆抗體，鑲嵌過氧化物酶基團的羊抗鼠二抗，山羊非免疫血清，100倍濃度的PBS及1%。吐溫20混合液，DAB顯色色原、底物及緩沖液。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒在喉鱗癌預(yù)后評估中的應(yīng)用。
3.Hsa-miR-145-5p的成熟體的模擬物質(zhì)，序列為⑶CCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU，其特征在于，所有核苷酸進行2’ -甲氧基修飾，和/或5’端進行硫代修飾，和/或3’端進行硫代修飾，和/或在5’或者3’端連接膽固醇修飾。
4.權(quán)利要求3所述的Hsa-miR-145-5p的成熟體的模擬物對喉鱗癌細胞株Ifep-2及TU-177中細胞惡性間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物，即E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白的抑制表達。`
【文檔編號】C12N15/11GK103667441SQ201310408755
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】王斌全, 高偉, 張春明, 陳鋼鋼, 皇甫輝, 溫樹信, 馮彥 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院