黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了黃瓜單拷貝基因在染色體上物理定位的方法，它是通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得黃瓜單拷貝基因，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳回收純化，以純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，然后將第二次PCR產(chǎn)物標(biāo)備探針。分別取黃瓜根尖和盛花期植株上的花蕾進(jìn)行酶解，涂片法制片，挑選分散度高的片子，并進(jìn)一步進(jìn)行胃蛋白酶處理后，備用。最后將標(biāo)好的探針雜交到處理好的載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察信號(hào)。本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增后切膠回收，之后再進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增的方法，不僅可以去除基因組DNA的干擾，而且解決了切膠回收率低的問(wèn)題；另外涂片法結(jié)合胃蛋白酶處理制作背景清晰且分散度高的片子可以提高信號(hào)的分辨率；通過(guò)此方法，可在染色體上直接檢測(cè)到的最短長(zhǎng)度為2kb的單拷貝基因，為黃瓜的細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供了可靠的保證。
【專(zhuān)利說(shuō)明】黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了利用熒光原位雜交技術(shù)直接將黃瓜單拷貝基因在染色體上進(jìn)行物理定位的方法，有利于開(kāi)展黃瓜的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
二、技術(shù)背景
[0002]黃瓜881:1^118 , 2X1 = 14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黃瓜具有一些特殊的性狀，如性別表型多樣化、線(xiàn)粒體的父性遺傳性等；同時(shí)黃瓜的基因組相對(duì)較小(約37014，染色體數(shù)目少，僅為14條，使得黃瓜成為近年來(lái)分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的模式物種之一。
[0003]細(xì)胞遺傳圖譜是指遺傳上標(biāo)記的探針在染色體上的位置，涉及了細(xì)胞學(xué)上的標(biāo)志，例如著絲粒、端粒、異染色質(zhì)區(qū)和核仁組織區(qū)等。伴隨著基因組研究的進(jìn)步，細(xì)胞遺傳圖譜不僅對(duì)于整合遺傳、分子和細(xì)胞學(xué)的信息具有重要的價(jià)值，并且能為染色體水平上觀察基因組結(jié)構(gòu)提供一種獨(dú)特的研究思路。
[0004]基因或特定序列的染色體物理定位是細(xì)胞遺傳相關(guān)研究的重要內(nèi)容之一。傳統(tǒng)的？1別技術(shù)對(duì)目標(biāo)片段長(zhǎng)度有一定的要求，一般片段至少在10?以上才能檢測(cè)到可見(jiàn)的信號(hào)。目前基因染色體物理定位的主要方法是利用包含該基因的大片段克隆進(jìn)行染色體熒光原位雜交，從而進(jìn)行相應(yīng)基因的物理定位，這些大片段克隆主要有8八0、^081111(1等。該方法依賴(lài)于大片段文庫(kù)的構(gòu)建、以及利用相應(yīng)的分子標(biāo)記篩選獲得特寫(xiě)的克隆，才能用于基因的物理定位。
[0005]構(gòu)建細(xì)胞遺傳圖譜最直接、最有效的方式是通過(guò)？13?直接將單拷貝基因定位到染色體上，多數(shù)基因的長(zhǎng)度在10?以下，這對(duì)？13?的檢測(cè)精度提出了新的挑戰(zhàn)。在植物染色體上，短片段序列的檢測(cè)更為很難，主要是由于植物細(xì)胞壁碎片和濃厚的細(xì)胞質(zhì)不易去除，背景較高，同時(shí)阻止了靶0嫩的順利進(jìn)入，最終導(dǎo)致了相對(duì)低的信噪比。迄今，單拷貝基因的？13?檢測(cè)僅來(lái)自于少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室的報(bào)道。例如1--%等人(1996年)在矮牽牛的有絲分裂中期染色體上用1.4^大小的探針定位了查耳酮合酶基因八^0^1(10等人(1998年)在水稻有絲分裂中期染色體上定位了一個(gè)1.29?大小的序列:1^1118(2006)等在玉米粗線(xiàn)期染色體上能檢測(cè)到3?的基因信號(hào)。然而，由于技術(shù)上的難度，單拷貝基因的染色體物理定位在植物中仍未見(jiàn)廣泛的應(yīng)用。
[0006]目前，單拷貝基因在黃瓜中期和粗線(xiàn)期染色體上的定位仍未見(jiàn)報(bào)道，我們通過(guò)改進(jìn)制片技術(shù)，并利用純化的單拷貝基因進(jìn)行檢測(cè)，能在染色體上看到明顯的單拷貝基因的信號(hào)，最小能檢測(cè)到2?的基因片段，從而實(shí)現(xiàn)了單拷貝基因在染色體上的直接物理定位。

三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]技術(shù)問(wèn)題
[0008]本發(fā)明黃瓜單拷貝基因在染色體上的物理定位方法的目的，是針對(duì)以往黃瓜單拷貝基因無(wú)法在黃瓜染色體上進(jìn)行直接定位等缺陷，發(fā)明能通過(guò)？13?在黃瓜中期和粗線(xiàn)期染色體上檢測(cè)到小至2?長(zhǎng)度的單拷貝基因的信號(hào)，為制作高分辨率的黃瓜染色體的物理圖譜奠定了基礎(chǔ)，加快了黃瓜的細(xì)胞遺傳學(xué)研究進(jìn)展。
[0009]技術(shù)方案
[0010]本發(fā)明所提供的黃瓜單拷貝基因在染色體上的物理定位，其特征在于:在黃瓜中期和粗線(xiàn)期染色體上觀察到了清晰明顯的且片段小至2?的單拷貝基因探針的信號(hào)。
[0011]上述黃瓜單拷貝基因能夠定位在染色體上，是通過(guò)以下方法獲得的:
[0012]取黃瓜植株根尖以及盛花前期和盛花期大小的花蕾，分別用固定液固定備用。
[0013]取出固定好的根尖和花蕾，處理之后酶解，然后用涂片法制片，鏡檢，進(jìn)一步用胃蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)的去除，然后用乙醇梯度干燥，備用。
[0014]根據(jù)黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，隨機(jī)選擇黃瓜單拷貝基因，利用0設(shè)計(jì)引物，利用長(zhǎng)片段酶進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，然后進(jìn)行切膠回收。
[0015]將得到的回收產(chǎn)物作為0嫩模版，再進(jìn)行二次擴(kuò)增。
[0016]將二次產(chǎn)物標(biāo)成探針備用，通過(guò)？1別，將探針雜交到黃瓜染色體上，在熒光顯微鏡下觀察信號(hào)。
[0017]有益效果
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0019]1)黃瓜單拷貝基因通過(guò)？1別能夠在黃瓜中期和粗線(xiàn)期染色體檢測(cè)到信號(hào)(圖1和2)，且檢測(cè)到的探針信號(hào)的最小片段小于21^(圖4)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，充分提高了靶信號(hào)的靈敏度。
[0020]2)現(xiàn)有的技術(shù)在定位目標(biāo)基因時(shí)，主要利用大片段文庫(kù)進(jìn)行？13?定位，這需要事先構(gòu)建好相應(yīng)的文庫(kù)，需要特定的條件。同時(shí)還需要在文庫(kù)中篩選獲得包含目標(biāo)基因的克隆，程序相當(dāng)繁瑣。而使用現(xiàn)在的方法可以直接進(jìn)行基因的定位，檢測(cè)到的最小探針長(zhǎng)度為2吐，適合于絕大多數(shù)基因的定位需要。
[0021]3)在材料準(zhǔn)備方面，制作分散度高的片子，這樣可以使雜交上去的探針信號(hào)更加清晰，提高了定位的準(zhǔn)確性，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。
[0022]4)將擴(kuò)增出來(lái)之后，進(jìn)行切膠回收，這樣可以去除基因組0嫩的干擾，使得目標(biāo)探針信號(hào)在染色體上清晰可辨。

四、【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1:利用本發(fā)明制作的單拷貝基因在黃瓜粗線(xiàn)期染色體上的定位，單拷貝基因的信號(hào)明顯，無(wú)重復(fù)序列的干擾。
[0024]圖2:單拷貝基因在黃瓜五號(hào)染色體中期染色體上的定位，中期染色體分散度高，很容易分辨出信號(hào)的定位。
[0025]圖3:三個(gè)單拷貝基因在黃瓜五號(hào)染色體粗線(xiàn)期染色體上的定位，能清晰的分辨出目標(biāo)信號(hào)在染色體上的分布。
[0026]圖4:2.0^的單拷貝基因片段在黃瓜四號(hào)中期染色體上的定位，充分顯示了黃瓜靶信號(hào)靈敏度的提高。五、

【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明黃瓜單拷貝基因在染色體上的定位的實(shí)施程序包括:
[0028](1)9(?產(chǎn)物的切膠回收:以黃瓜0嫩為模版，按照體系進(jìn)行第一次？⑶擴(kuò)增，然后將產(chǎn)物全部加到瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，針對(duì)不同的產(chǎn)物，分別切膠，然后根據(jù)試劑盒進(jìn)行回收，回收完之后對(duì)回收后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，得到不同的產(chǎn)物不同的濃度。
[0029](2)第二次？⑶擴(kuò)增及標(biāo)探針:根據(jù)產(chǎn)物的濃度不同，調(diào)整體系混樣。擴(kuò)增之后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。挑選濃度較高的第二次產(chǎn)物，分別標(biāo)成紅色和綠色的探針，備用。
[0030](3)材料準(zhǔn)備:在黃瓜植株上取適當(dāng)?shù)母庖约霸谑⒒ㄇ捌诤褪⒒ㄆ谌∵m當(dāng)大小的花蕾，分別放入體積比為3: 1的(甲醇:冰醋酸)3:(}(乙醇:冰醋酸)固定液中固定至少24小時(shí)，超過(guò)一周的話(huà)可將根尖和花蕾換到70%的乙醇中，酶解好備用。
[0031](4)制片:①取出酶解好的其中的一個(gè)花藥，放入另一新的1.51111離心管中，加入約100111的2 4固定液，將花藥搗碎，吸出約30111的含粗線(xiàn)期染色體的液體，涂于載玻片上，再加上100111的2:6固定液，在酒精燈上燒片干燥制片；②取出酶解好的其中一個(gè)根尖，放在干凈的載玻片上用鑷子敲碎，再加上100111的1:6固定液，在酒精燈上燒片干燥制片。
[0032]根據(jù)？1別程序，將探針加到載玻片上進(jìn)行雜交過(guò)夜，第二天進(jìn)行洗片，壓片。然后在熒光顯微鏡下觀察單拷貝基因的信號(hào)即可。
【權(quán)利要求】
1.黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位，其特征在于: 通過(guò)熒光原位雜交(FISH)，能在黃瓜中期和粗線(xiàn)期染色體上檢測(cè)到片段小至2.0kb的單拷貝基因的FISH信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在黃瓜中期和粗線(xiàn)期染色體上檢測(cè)到最短長(zhǎng)度為2kb的單拷貝基因的FISH信號(hào)，是通過(guò)以下方法獲得的: 1)黃瓜染色體上的單拷貝基因利用基因組DNA作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收； 2)利用切膠回收的DNA標(biāo)探針，若回收產(chǎn)物不夠，可以切膠回收的DNA為模板，再進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增后的產(chǎn)物標(biāo)探針； 3)取酶解好的花藥或根尖，加入適量固定液制成懸濁液涂片，再利用涂片法制片，鏡檢，挑選染色體分散度高的制片，進(jìn)一步利用胃蛋白酶消化去除細(xì)胞質(zhì)后，干燥備用； 4)將標(biāo)好的探針雜交到黃瓜染色體上，通過(guò)FISH檢測(cè)信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在黃瓜中期和粗線(xiàn)期染色體上檢測(cè)到了片段長(zhǎng)度最小達(dá).2.0kb的單拷貝基因的FISH信號(hào)，是由于探針既沒(méi)有基因組DNA的干擾，并經(jīng)過(guò)第二次PCR擴(kuò)增之后，濃度較高，而且經(jīng)過(guò)預(yù)處理的載玻片背景較干凈，易于探針雜交上去。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104419763SQ201310409784
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】婁群峰, 張?jiān)葡? 陳勁楓, 何玉華, 賈利, 程春燕, 李季 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)