一種高通量快速檢測常見致病菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高通量快速檢測常見致病菌的方法，所述方法包括：采用針對多種致病菌標志性DNA序列的通用引物對對樣品進行PCR擴增，從而獲得所述致病菌的標志性DNA序列；使得所述致病菌的標志性DNA序列與分別針對所述致病菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針接觸，獲得帶有不同可檢測標記物的雜交產(chǎn)物；檢測可檢測標記物的信號以確定樣品中致病菌的存在或數(shù)量。本發(fā)明還提供了用于檢測致病菌的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒可準確快速、高通量地檢測致病菌，具有易操作、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，其應用前景廣泛。
【專利說明】一種高通量快速檢測常見致病菌的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床檢測、食品檢測、公共衛(wèi)生和細菌學領域。具體而言，本發(fā)明涉及 一種高通量、快速檢測致病菌（優(yōu)選臨床常見致病菌）的新方法。

【背景技術】
[0002] 細菌感染性疾?。ɡ缑谀蛳到y(tǒng)感染，如尿路感染）嚴重威脅人類健康且發(fā)病率 日益提高。常見的致病性細菌可導致多種疾病，例如：由大腸桿菌（E. coli)引起的腹瀉、 敗血癥；由金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus)引起的化膿感染、食物中毒、肺炎； 由肺炎克雷伯菌（K.peneumoniae)引起的上呼吸道、腸道感染；由糞腸球菌（E.faecalis) 引起的尿路感染、心內膜炎、膽囊炎、腦膜炎及傷口感染等；由陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)引起的醫(yī)源性感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及敗血癥等；由銅綠假單胞菌 (P. Aeruginosa)引起的醫(yī)源性感染、術后傷口感染、化膿性中耳炎等；由普通變形桿菌 (P. vulgaris)引起的泌尿系統(tǒng)感染、創(chuàng)口感染、呼吸道感染、食物中毒及敗血癥等；由黏質 沙雷菌（Serratia marcescens)引起的肺部感染、腦膜炎、心內膜炎、尿路感染、灼傷后敗血 癥等。
[0003] 針對細菌感染性疾病大量使用廣譜抗生素，雖然能夠抑制大部分致病菌，但會導 致耐藥菌株和變異菌株不斷出現(xiàn)，長期使用還會引發(fā)多種副作用，增加患者負擔和臨床治 療的復雜性。并且，某些疾病可能由多種致病菌共同導致，病因復雜。因此，檢測特定致病 菌并有針對性地抑制所測得的致病菌，有利于合理治療細菌感染性疾病。
[0004] 然而，以培養(yǎng)為基礎的傳統(tǒng)致病菌檢測方法存在耗時長、檢測敏感性受培養(yǎng)條件 限制等缺點，越來越不能滿足臨床的需要，因而開發(fā)快速、敏感、準確地檢測病原菌的方法 一直是人們追求的目標。近年來發(fā)展的生物芯片技術具有高通量、集成化、微型化及自動化 等特點，在檢測基因位點差異和分析基因表達水平等領域已得到廣泛應用，而在臨床致病 菌和耐藥性的檢測方面，則可為臨床抗生素的合理使用提供科學依據(jù)。
[0005] 目前，臨床和食品檢驗檢疫上細菌鑒定主要方法有：傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)和鑒定 方法、PCR、Southern Blot雜交（即DNA印跡法）、ELISA等分子生物學和免疫學方法。但 是，傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣、耗時費力，一般需要3-5天，ELISA方法雖然靈敏度高，但易受 污染，出現(xiàn)假陽性；采用多重PCR技術，雖然可以達到對單一菌的快速、準確和方便的診斷 目的，但在病原菌未明時，需要采用多種不同引物進行試驗，這對病原菌的復雜性和PCR程 序的多樣性來說是不夠理想的。
[0006] 隨著生物芯片技術的日趨成熟，高效、快速、準確、靈敏的生物芯片技術，被應用到 越來越多的領域，其中就包括臨床致病菌快速診斷領域。液相芯片技術是新近開發(fā)出的新 一代分子診斷技術平臺，該平臺既能保證信息質量，又能提供相對高通量的檢測，其高通 量、高精確性以及耗時短的特點為臨床常見菌的檢測提供了思路，可有效防止抗生素藥物 的濫用。
[0007] 目前最先進的技術是科學家韓健博士發(fā)明的Tem-PCR (target enriched multiplex PCR，祀序列富集多重PCR)技術與液相芯片檢測技術的結合運用，該技術能在一 次反應中對多種靶序列進行高度敏感和特異的擴增和檢測，其主要原理是，針對待擴增的 每一種靶序列，設計兩對巢式的特異性引物：FO，RO ;Fi，Ri。其中的Fi和Ri引物帶有一個 能被通用的超級引物（Super Primer)識別的標簽序列。巢式的祀序列特異性引物的濃度 極低，用于在PCR的最初幾個循環(huán)中富集目標序列。只有超級引物的濃度足以進行指數(shù)擴 增，而且只有反向超級引物進行了生物素的標記。最后通過液相芯片檢測平臺輸出信號，達 到檢測目的。該技術與普通PCR技術相比具有兼容性好、特異性強、效率超高、可半定量等 優(yōu)點，但是該技術存在對所需DNA模板要求高、PCR反應時間長、敏感性不夠強等缺點。
[0008] 細菌rRNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是細菌染 色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌染色體基因中，它的內部結構包 含保守區(qū)及可變區(qū)。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的基因，其長 度約為1500pb，是細菌分類學研究中最常用、最有用的"分子鐘"。
[0009] 在核糖體RNA(rRNA)特征序列中，經(jīng)研究認為16S rRNA及其類似的rRNA基因序列 作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適，其主要依據(jù)是：它們?yōu)榧毎灿?；其功能同源且最?古老；既含有保守序列又含可變序列；分子大小適合操作；它的序列變化與進化距離相適 應。依據(jù)16S rRNA序列繪制的生命進化樹，卡爾?沃斯（Carl Woese)將地球上的所有細胞 生物劃分為3個域（domain)，即古生菌（Archaea，也稱Archaebacteria)、細菌（Bacteria， 也稱Eubacteria)和真核生物（Eukarya)。16S rRNA序列分析作為微生物分類系統(tǒng)的主要 依據(jù)也得到了廣泛認同，隨著微生物核糖體數(shù)據(jù)庫的日益完善，該技術成為細菌分類和鑒 定的一個有力工具。
[0010] 關于16S rDNA的數(shù)據(jù)庫信息及分析軟件較其它分類鑒定用的基因豐富得多，如 RDP (http: //rdp. cme. msu. edu/html/) > ARB (http: //www. ard-home. de/) > ORS (http: // soul, mikro. biologie. tu-muenchen. de/0RS/)> OPD (http://www. com. msu. eduOPD/)及 PRMR0SE、CLUSTAL-X、PRMER PREMIER、DNA START等，各分析軟件因采用的算法不同而各 有所長。
[0011] 然而，本領域中尚未提供同時檢測樣品中多種致病菌的方法。本領域中仍然迫切 需要開發(fā)出能夠克服目前致病菌檢測中的不足，且能高通量、快速檢測多種致病菌的方法。


【發(fā)明內容】

[0012] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種高通量、快速檢測常見致病菌的方法，該方法具 有特異性強、敏感性高、檢測時間短、交叉反應少等優(yōu)點。本發(fā)明的另一個目的在于提供用 于本發(fā)明方法的試劑盒，以及本發(fā)明的方法和試劑盒在臨床常見菌檢測中的應用。
[0013] 在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種獲得樣品中致病菌的標志性DNA序列的 方法，所述致病菌為選自下組菌中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌 (K. peneumoniae，即 KPN)、奠腸球菌（E. faecal is，即 EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae,即 ECL)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa,即 PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris, 即 PV)、黏質沙雷菌（Serratia marcescens，即 SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,即SA);所述方法包括：
[0014] ⑴獲得針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物 和針對SEQIDN0:11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或SEQIDN0:12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA 的通用下游引物；
[0015] (ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進行PCR擴增，從而獲得 所述致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包 含所述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列。
[0016] 在一些優(yōu)選例中，通過以上所述的PCR擴增方法獲得的分別是SEQ ID N0:21-28 所示的各菌標志性DNA序列。
[0017] 在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物的序列針對SEQ ID N0:12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA 〇
[0018] 在一些優(yōu)選例中，所述通用上游引物的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3所示； 所述通用下游引物的序列如 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 或 SEQ ID NO:7 所示。
[0019] 在另一些優(yōu)選例中，所述致病菌為選自上組菌中的至少兩種。
[0020] 在一些實施方式中，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所示序列的15?17個 連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或或SEQ ID NO: 12的15?23個連續(xù)核苷酸序列完全互補的序列。
[0021] 在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物為與SEQ ID NO: 12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA或的15?23個連續(xù)核苷酸序列完全互補的序列。
[0022] 在另一些實施方式中，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所示序列的15?17 個連續(xù)核苷酸序列完全互補的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或SEQ ID NO: 12 的15?23個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
[0023] 在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物為與SEQ ID NO: 12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的15?23個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
[0024] 在一些優(yōu)選例中，所述致病菌的標志性DNA序列分別如下：a)SEQ ID N0:21所示 的大腸桿菌的標志性DNA序列；b)SEQ ID NO:22所示的肺炎克雷伯菌的標志性DNA序列；c) SEQ ID N0:23所示的糞腸球菌的標志性DNA序列；d)SEQ ID N0:24所示的陰溝腸桿菌的標 志性DNA序列；e) SEQ ID NO: 25所示的銅綠假單胞菌的標志性DNA序列；f) SEQ ID NO: 26 所示的普通變形桿菌的標志性DNA序列；g) SEQ ID NO: 27所示的黏質沙雷菌的標志性DNA 序列；h) SEQ ID NO: 28所示的金黃色葡萄球菌的標志性DNA序列。
[0025] 在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種檢測樣品中致病菌的方法，所述致病菌為選 自下組中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae，即KPN)、糞 腸球菌（E.faecalis，即EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae，即ECL)、銅綠假單胞 菌（P. Aeruginosa,即 PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris,即 PV)、黏質沙雷菌（Serratia marcescens，即SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，即SA);所述方法包括：
[0026] (A)采用本發(fā)明所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標志性DNA序列；
[0027] (B)提供分別針對所述致病菌的標志性DNA序列的相應特異性捕獲探針；
[0028] (C)在雜交條件下，使所述致病菌的標志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸， 并且在所述接觸之前、之時或之后用不同的可檢測標記物標記所述特異性捕獲探針或所述 致病菌的標志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復合物，獲得帶有不同可檢測標記 物的雜交產(chǎn)物；
[0029] (D)檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標記物的信號，以確定樣品中各種待測 致病菌的存在或數(shù)量。
[0030] 在另一些優(yōu)選例中，所述方法用于同時檢測出樣品中選自上組菌中的至少兩種。
[0031] 在一些實施方式中，所述方法用于臨床樣品檢測、食品檢驗、食品加工過程檢測或 化妝品檢測，優(yōu)選用于臨床樣品檢測。
[0032] 在另一些實施例中，所述可檢測標記物選自：編碼微球、或其它載體（如熒光標記 物、發(fā)光蛋白等）。
[0033] 在另一些實施例中，所述方法還包括在步驟（A)之后，分離和/或純化所述所述致 病菌的標志性DNA序列、和/或將所述所述致病菌的標志性DNA序列與可檢測標記物連接。 在一些實施例中，所述可檢測標記物是生物素、抗生物素、抗體、標記細胞或發(fā)光蛋白。
[0034] 在一些實施方式中，所述樣品來源于：生物組織、體液、血液、尿液或食品。
[0035] 在另一些實施例中，所述樣品是DNA樣品或菌液。
[0036] 在另一些實施例中，所述樣品中可包含所述菌組內致病菌中的一種或多種。
[0037] 在另一些實施方式中，其特征在于，所述特異性捕獲探針選自：
[0038] a)針對SEQ ID NO: 21所示的大腸桿菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針；b)針 對SEQ ID NO: 22所示的肺炎克雷伯菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針；c)針對SEQ ID N0:23所示的糞腸球菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針；d)針對SEQ ID N0:24所示的陰 溝腸桿菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針；e)針對SEQ ID N0:25所示的銅綠假單胞菌 標志性DNA序列的特異性捕獲探針；f)針對SEQ ID N0:26所示的普通變形桿菌標志性DNA 序列的特異性捕獲探針；g)針對SEQ ID NO: 27所不的黏質沙雷菌標志性DNA序列的特異 性捕獲探針；和h)針對SEQ ID NO:28所示的金黃色葡萄球菌的特異性捕獲探針。
[0039] 在另一些優(yōu)選例中，所述特異性捕獲探針的G/C為45?60%，優(yōu)選50?55%。
[0040] 在另一些實施例中，所述特異性捕獲探針的長度為20-25bp，更優(yōu)選22bp。
[0041] 在另一些實施例中，所述特異性捕獲探針的Tm值為40-60°C，優(yōu)選52°C。
[0042] 在另一些實施例中，所述特異性捕獲探針的5'端將修飾或封閉，以便于與編碼微 球偶聯(lián)。
[0043] 在另一些實施例中，所述特異性捕獲探針選自下組：
[0044] a) SEQ ID NO: 13所示的大腸桿菌的特異性捕獲探針；
[0045] b) SEQ ID NO: 14所示的肺炎克雷伯菌的特異性捕獲探針；
[0046] c) SEQ ID NO: 15所示的糞腸球菌的特異性捕獲探針；
[0047] d) SEQ ID NO: 16所示的陰溝腸桿菌的特異性捕獲探針；
[0048] e) SEQ ID NO: 17所示的銅綠假單胞菌的特異性捕獲探針；
[0049] f) SEQ ID NO: 18所示的普通變形桿菌的特異性捕獲探針；
[0050] h) SEQ ID NO: 19所示的黏質沙雷菌的特異性捕獲探針；和
[0051] i) SEQ ID NO: 20所示的金黃色葡萄球菌的特異性捕獲探針。
[0052] 在另一些實施方式中，步驟（C)中的所述可檢測標記物為編碼微球，所述編碼微 球采用可產(chǎn)生不同可信號的標記物編碼。
[0053] 在一些實施例中，所述標記物選自：不同顏色的標記物或其不同比例的組合。在另 一些實施例中，所述標記物選自：不同顏色的熒光標記物，或不同比例的兩種或兩種以上的 突光標記物的組合。
[0054] 在一些實施例中，所述編碼微球與捕獲探針偶聯(lián)。在一些實施例中，所述偶聯(lián)通過 EDC法進行。在另一些實施例中，所述偶聯(lián)是通過NHS偶聯(lián)劑進行的。在另一些實施例中， 所述微球是聚苯乙烯微球，并根據(jù)其表面帶有的分子殘基的不同，可以結合不同的探針分 子。
[0055] 在另一些實施方式中，步驟（D)中的所述檢測采用選自下組的一種或多種系統(tǒng)或 儀器：液相芯片檢測系統(tǒng)、流式細胞儀或固相芯片。
[0056] 在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種用于檢測致病菌和/或治療致病菌感染 的試劑盒，所述致病菌為選自下組中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌 (K. peneumoniae，即 KPN)、奠腸球菌（E. faecal is，即 EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae,即 ECL)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa,即 PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris, 即 PV)、黏質沙雷菌（Serratia marcescens，即 SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,即SA);所述試劑盒包含：
[0057] (i'）針對SEQIDN0:10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC的通用上游引物和針 對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物 對所述樣品進行PCR擴增，可獲得所述致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于 所述致病菌的16SrDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列；
[0058] (ii'）針對所述致病菌的標志性DNA序列的相應特異性捕獲探針、各種可檢測標 記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標記物的連接物；
[0059] (iii'）一個或多個容器和/或包裝物；
[0060] (iv'）任選的，PCR擴增用試劑；
[0061] (ν'）任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標記物的試劑；
[0062] (vi'）任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0063] (vii'）任選的，使用說明書；
[0064] (viii'）任選的，致病菌治療劑。
[0065] 在一些優(yōu)選例中，所述試劑盒用于同時檢測出樣品中至少兩種選自上組的菌。
[0066] 在本發(fā)明的第四方面中，提供了下述物質在制備檢測致病菌和/或治療致病菌感 染的試劑盒中的用途：
[0067] ⑴針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針 對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物 對所述樣品進行PCR擴增，可獲得所述致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于 所述致病菌的16SrDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列；
[0068] (ii)針對所述致病菌的標志性DNA序列的相應特異性捕獲探針、各種可檢測標記 物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標記物的連接物；
[0069] (iii) 一個或多個容器和/或包裝物；
[0070] (iv)任選的，PCR擴增用試劑；
[0071] (V)任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標記物的試劑；
[0072] (Vi)任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0073] (Vii)任選的，使用說明書；
[0074] (Viii)任選的，致病菌治療劑。
[0075] 在一些實施例中，所述可檢測標記物是微球。
[0076] 在本發(fā)明的其它方面中，還提供了本發(fā)明上述方法和試劑盒在檢測致病菌和/或 治療致病菌感染中的用途。
[0077] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0078] 下面結合附圖對本發(fā)明作進一步說明，其中這些顯示僅為了圖示說明本發(fā)明的實 施方案，而不是為了局限本發(fā)明的范圍。
[0079] 圖1 :針對菌A-菌F的16S rDNA基因的通用引物和特異性捕獲探針的設計示意 圖。
[0080] 圖2 :采用通用引物對（SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2)PCR擴增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0081] 圖3 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4)PCR擴增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0082] 圖4 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5)PCR擴增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0083] 圖5 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6)PCR擴增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0084] 圖6 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:7)PCR擴增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0085] 圖7 :采用通用引物對（SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9)PCR擴增不同菌株的凝膠電泳 圖。

【具體實施方式】
[0086] 本發(fā)明主要是為了克服目前致病菌（尤其是臨床常見致病菌）檢測中的不足，提 供一種高通量快速檢測致病菌的方法，采用一對通用引物及特異性捕獲探針設計，通過液 相芯片實現(xiàn)信號輸出的方法，可同時、快速檢測多種致病菌。該方法高效、靈敏、特異性強、 交叉反應少，克服多重PCR及熒光檢測系統(tǒng)中存在的PCR反應引物設計繁瑣及產(chǎn)生交叉反 應等缺點。
[0087] 本發(fā)明人開發(fā)的以16S rDNA PCR技術為核心的新型致病菌快速檢測技術，只需 采用一對通用引物就可以對多種不同細菌的16S rRNA特征信息進行擴增，獲得的為包含 多重性的16S rDNA信息的PCR產(chǎn)物。這種常規(guī)的PCR方法，可以在一個小時之內完成擴 增反應。所獲得的PCR產(chǎn)物，采用與特異性引物偶聯(lián)的編碼微球，用液相芯片檢測系統(tǒng)（如 Luminex200)，可以實現(xiàn)多重性和高通量的檢測目標。
[0088] 獲得致病菌標志件DNA序列的方法
[0089] 本發(fā)明中提供了一種獲得樣品中致病菌的標志性DNA序列的方法，所述致病菌為 選自下組中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae，即KPN)、 奠腸球菌（E.faecalis，即EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae，即ECL)、銅綠假單 胞菌（P. Aeruginosa,即PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris,即PV)、黏質沙雷菌（Serratia marcescens，即SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，即SA)，所述方法包括：
[0090] ⑴獲得針對SEQ ID NO :10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC的通用上游引物和 針對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA 的通用下游引物；
[0091] (ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進行PCR擴增，從而獲得 所述致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包 含所述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列。
[0092] 如本文所用，術語"標志性DNA序列"是指位于各種致病菌16S rDNA中、且可由本 發(fā)明的通用引物對擴增獲得的特定序列，所述序列的兩端包含各菌共有的保守序列，而在 該序列內部具有各種致病菌獨有的特異性序列。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述致病菌 的標志性DNA序列分別如下：a) SEQ ID NO: 21所示的大腸桿菌的標志性DNA序列；b) SEQ ID NO: 22所示的肺炎克雷伯菌標志性DNA序列；c) SEQ ID NO: 23所示的糞腸球菌標志性DNA 序列；d) SEQ ID NO: 24所示的陰溝腸桿菌標志性DNA序列；e) SEQ ID NO: 25所示的銅綠假 單胞菌標志性DNA序列；f) SEQ ID NO: 26所示的普通變形桿菌標志性DNA序列；g) SEQ ID NO: 27所示的黏質沙雷菌標志性DNA序列；和h) SEQ ID NO: 28所示的金黃色葡萄球菌標志 性DNA序列。
[0093] 如本文所用，術語"特異性序列"或"可變區(qū)"可互換使用，均是指位于各種待測致 病菌16S rDNA基因內部、各種待測致病菌獨有的一段區(qū)域。通過分析和比較各種待測致病 菌的16S rDNA序列可確定該特異性序列的存在和具體位置。通常，該特異性序列兩端具有 各種致病菌共有的保守序列。所述的特異性序列可用于區(qū)分致病菌的種類。
[0094] 可采用序列比對、參考文獻（液體芯片技術定量測定人體血清CEA、AFP、 NSE 和 tPSA，粱惠儀等，J Mol Diagn Ther，2010 年 7 月，VoL 2, No. 4 ;王嘉莉等； High-Throughput, Sensitive,and Accurate Multiplex PCR-Microsphere Flow Cytometry System for Large-Scale Comprehensive Detection of Respiratory Viruses (以新技術平臺Luminex快速檢測具二甲氧基苯青霉素抗藥性的金黃色葡萄球 菌）2007 年 5 月 30 日提前公開· 10. 1128/JCM. 02501-06. 2007, 45(8) :2626. D0I:J. Clin. Microbiol. James R. Prudent等）、實驗驗證等本領域常規(guī)技術確定適用于本發(fā)明方法 的各待測致病菌的特異性序列或包含該序列的標志性DNA序列。關于16S rDNA的數(shù)據(jù) 庫信息及分析軟件在本領域中是已知的，例如RDP(http ://rdp. cme. msu. edu/html/)、 ARB (http: //www. ard-home. de/) > ORS (http: //soul, mikro. biologie. tu-muenchen. de/ ORS/)、OPD(http://www. com. msu. eduOPD/)及 PRMR0SE、CLUSTAL-X、PRMER PREMIER、DNA START等，各分析軟件因采用的算法不同而各有所長，這些數(shù)據(jù)庫和軟件均可用于本發(fā)明 中。
[0095] 如本文所用，術語"保守序列"或"共有序列"可互換使用，均是指各種致病菌的16S rRNA基因（16S rDNA)的標志性DNA序列中的一致序列。針對"保守序列"設計出的本發(fā)明 的通用引物可用于擴增出各種待測致病菌的標志性DNA序列。為了實現(xiàn)通用擴增的目的， 通常該保守序列位于可變區(qū)的兩端。
[0096] 如本文所用，術語"通用引物對"是指針對致病菌標志性DNA序列中的保守區(qū)域、 可用于擴增出包含各種致病菌的特異性序列的致病菌標志性DNA序列的一對通用引物。通 用上游引物（或稱"正向通用引物"）通常針對標志性DNA序列的上游；通用上游引物（或 稱"反向通用引物"）通常針對標志性DNA序列的下游。
[0097] 通用引物對的設計可根據(jù)本領域中常規(guī)的引物設計規(guī)則進行、采用已知的引物設 計軟件和/或由提供引物設計的公司提供專門的服務。本發(fā)明的通用上游引物和通用下游 引物分別針對SEQ ID N0:10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC和針對SEQ ID N0:11所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQ ID NO :12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA。例如 在本發(fā)明的一個實施例中，可采用SEQ ID N0:1或3的通用上游引物與SEQ ID N0:2、4、5、 6或7的通用下游引物組合形成通用引物對。
[0098] 在本發(fā)明的方法中，可采用本領域中已知的PCR方法和常規(guī)條件、采用本發(fā)明的 通用引物對，對樣品進行PCR擴增。也可對已知類型的菌種進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進 行測序，并將測序信息用于后續(xù)的特異性捕獲探針設計。
[0099] 致病菌檢測方法
[0100] 本發(fā)明中提供了一種檢測致病菌的方法，所述方法包括：
[0101] (A)采用如上所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標志性DNA序列；
[0102] (B)提供分別針對所述致病菌（一種或多種，優(yōu)選至少兩種）的標志性DNA序列的 相應特異性捕獲探針；
[0103] (C)在雜交條件下，使所述致病菌的標志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸， 并且在所述接觸之前、之時或之后用不同的可檢測標記物標記所述特異性捕獲探針或所述 致病菌的標志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復合物，獲得帶有不同可檢測標記 物的雜交產(chǎn)物；
[0104] (D)檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標記物的信號，以確定樣品中各種待測 致病菌的存在或數(shù)量。
[0105] 如本文所用，術語"特異性捕獲探針"或"捕獲探針"可互換使用，均是指針對可能 存在的某種致病菌在16S rDNA標志性DNA序列中的特異性序列設計的，從而可特異性捕獲 該種致病菌的16S rDNA擴增產(chǎn)物的探針。根據(jù)需要，本發(fā)明的捕獲探針可帶有或不帶有標 記物（如放射性、生物素、熒光標記物等）?？筛鶕?jù)本領域中常規(guī)的探針設計規(guī)則設計探針， 并人工合成探針。
[0106] 在本發(fā)明的一些實施方式中，SEQ ID NO : 13?20的捕獲探針序列分別特異性地 針對并可分別捕獲大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、普通變 形桿菌、黏質沙雷菌和金黃色葡萄球菌的標志性DNA序列，更具體而言是標志性DNA序列中 的特異性序列。
[0107] 可用各種可檢測標記物與捕獲探針連接，以使得被特定捕獲探針捕獲的序列上帶 有特定的標記，從而將特定可檢測標記與特定菌的序列對應起來，便于區(qū)分不同的細菌。所 述可檢測標記物包括但不限于：編碼微球、載體（例如熒光標記物、發(fā)光蛋白）等，優(yōu)選編碼 微球。連接標記物和捕獲探針的方法是本領域中所熟知的，本領域普通技術人員可根據(jù)所 選的標記物對捕獲探針或標記物進行修飾或改造，以得到兩者可相互連接（例如可參見許 艷軍，廈門大學2008年碩士學位論文：液相芯片中羧基功能性聚苯乙烯微球的制備、表征 及其在生物檢測中的應用、及其所引用的參考文獻等文獻）。
[0108] 如本文所用，術語"編碼微球"是指具有不同可檢測區(qū)分的特征（例如大小和/ 或顏色）、能與捕獲探針偶聯(lián)、并可被檢測設備區(qū)分的各種微球。微球的材料可為：聚苯 乙烯，如MultiAnalyte微球或SeroMap微球等。微球的直徑可為20nm_200 μ m，優(yōu)選5? 10 μ m，更優(yōu)選5.6 μ m。微球可用不同配比的染料（優(yōu)選熒光染料）染成不同的顏色（如 熒光色），從而獲得可多達數(shù)種、十數(shù)種、數(shù)十種、甚至百余種不同的編碼微球?？赏ㄟ^市售 途徑獲得編碼微球，例如購自凱杰生物、BIO-RAD或根據(jù)需要自行設計和制備編碼微球（例 如可參考陳瑋，液相芯片技術的原理與應用進展，成都醫(yī)學院病理教研室，成都醫(yī)院學報， 2008 (3) : 225-231，該文獻以其全文納入本文作為參考）。
[0109] 本發(fā)明的捕獲探針可經(jīng)過修飾或改造具有適于與編碼微球偶聯(lián)的接頭或基團，例 如可在捕獲探針的5'端連接AMB以用于進一步與編碼微球連接。捕獲探針與編碼微球的 偶聯(lián)，可采用本領域中已知的方法進行（例如可參考韓衛(wèi)寧等，液相芯片技術在核酸檢測 中的應用研究進展，現(xiàn)代預防醫(yī)學，2008 (10) : 1911-1915,該文獻以其全文納入本文作為參 考）。例如在適合捕獲探針上的接頭或基團與編碼微球上的相應結構連接或反應的條件下， 混合和孵化捕獲探針和編碼微球。
[0110] 在適當條件下，使采用通用引物對擴增得到的PCR產(chǎn)物與不同的捕獲探針-編碼 微球偶聯(lián)物雜交，以使得PCR產(chǎn)物帶有來自編碼微球的可檢測信號。雜交條件可參照廠商 提供的操作規(guī)程（例如Iuminex偶聯(lián)試劑盒的標準操作規(guī)程進行）或本領域中的常規(guī)條件 進行。
[0111] 可采用本領域中已知的方法檢測連接到所述PCR產(chǎn)物上的編碼微球的信號，以測 定致病菌的存在或數(shù)量。例如可采用熒光微球檢測系統(tǒng)、流式細胞儀或固相芯片等。當檢 測到與特定致病菌的捕獲探針偶聯(lián)的特定編碼微球信號時，表明被檢測的樣品中帶有此種 特定的致病菌。如需要的話，可通過編碼微球信號的強弱測定樣品中致病菌的數(shù)量。
[0112] 試劑盒及試劑的應用
[0113] 本發(fā)明中還提供了一種用于檢測致病菌的試劑盒，其包含：
[0114] (i'）針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和 針對 SEQ ID NO :11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQID NO :12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物 對所述樣品進行PCR擴增，可獲得所述致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于 所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列；
[0115] (ii'）針對所述致病菌的標志性DNA序列的相應特異性捕獲探針、各種可檢測標 記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標記物的連接物；
[0116] (iii'）一個或多個容器和/或包裝物；
[0117] (iv'）任選的，PCR擴增用試劑；
[0118] (ν'）任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標記物的試劑；
[0119] (vi'）任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0120] (vii'）任選的，使用說明書；
[0121] (viii'）任選的，致病菌治療劑。
[0122] 本發(fā)明中進一步提供了采用本發(fā)明的方法或試劑盒檢測致病菌和/或治療致病 菌感染中的用途。
[0123] 本發(fā)明的優(yōu)點
[0124] 利用本發(fā)明的技術，可在短時間內（4小時內，如2-3小時）對多種臨床常見致病 菌及其混合物進行準確、快速檢測；與傳統(tǒng)的檢測方法（細菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等） 以及醫(yī)院現(xiàn)用其它儀器檢測（例如西門子walkaway96微生物鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)原理還是傳 統(tǒng)檢測方法的原理）相比，新技術的特色和創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在：可以直接用菌液或待檢樣 品作為PCR模板進行快速多重PCR擴增，可同時對多種常見致病菌進行高通量并行檢測，一 次實驗即可得出全部結果，操作簡便快速，特異性強、靈敏度高。
[0125] 序列表說明
[0126] 本發(fā)明序列表中序列號與具體序列之間的對應關系如下表1所示：
[0127] 表1.序列表說明
[0128]

【權利要求】
1. 一種獲得樣品中致病菌的標志性DNA序列的方法，所述致病菌為選自下組菌中的一 種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae)、糞腸球菌（E. faecalis)、 陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa)、普通變形桿菌 (P. vulgaris)、黏質沙雷菌（Serratia marcescens)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus);所述方法包括： (i) 獲得針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和 針對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGA 的通用下游引物； (ii) 采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進行PCR擴增，從而獲得所述 致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所 述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所 示序列的15?17個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或12的15?23個連續(xù)核苷酸序列完全互補的序列。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所 示序列的15?17個連續(xù)核苷酸序列完全互補的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或12的15?23個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
4. 一種檢測樣品中致病菌的方法，所述致病菌為選自下組菌中的一種或多種：大腸 桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae)、糞腸球菌（E. faecalis)、陰溝腸桿菌 (Enterobacter cloacae)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa)、普通變形桿菌（P. vulgaris)、黏 質沙雷菌（Serratia marcescens)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus);所述方法 包括： (A) 采用權利要求1?3中任一項所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標志性DNA序 列； (B) 提供分別針對所述致病菌的標志性DNA序列的相應特異性捕獲探針； (C) 在雜交條件下，使所述致病菌的標志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸，并且 在所述接觸之前、之時或之后用不同的可檢測標記物標記所述特異性捕獲探針或所述致病 菌的標志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復合物，獲得帶有不同可檢測標記物的 雜交產(chǎn)物； (D) 檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標記物的信號，以確定樣品中各種待測致病 菌的存在或數(shù)量。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法用于臨床樣品檢測、食品檢驗、食 品加工過程檢測或化妝品檢測，優(yōu)選用于臨床樣品檢測或食品檢疫。
6. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述特異性捕獲探針選自： a) 針對SEQ ID NO: 21所示大腸桿菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針； b) 針對SEQ ID NO: 22所示肺炎克雷伯菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針； c) 針對SEQ ID NO: 23所示糞腸球菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針； d) 針對SEQ ID NO: 24所示陰溝腸桿菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針； e) 針對SEQ ID NO: 25所示銅綠假單胞菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針； f) 針對SEQ ID NO:26所示普通變形桿菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針； g) 針對SEQ ID NO: 27所示黏質沙雷菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針；和 h) 針對SEQ ID NO: 28所示金黃色葡萄球菌標志性DNA序列的特異性捕獲探針。
7. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（C)中的所述可檢測標記物為編碼微 球，所述編碼微球采用可產(chǎn)生不同可信號的標記物編碼。
8. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（D)中的所述檢測采用選自下組的一種 或多種系統(tǒng)或儀器：液相芯片檢測系統(tǒng)、流式細胞儀或固相芯片。
9. 一種用于檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒，所述致病菌為選自下組 菌中的一種或多兩種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae)、糞腸球菌 (E.faecalis)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa)、 普通變形桿菌（P. vulgaris)、黏質沙雷菌（Serratia marcescens)、金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus);所述試劑盒包含： (i'）針對SEQ ID N0:10所示序列的通用上游引物和針對SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 12所示序列的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品 進行PCR擴增，可獲得所述致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于所述致病菌 的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列； (ii'）針對所述致病菌的標志性DNA序列的相應特異性捕獲探針、各種可檢測標記物、 或各種特異性捕獲探針與可檢測標記物的連接物； (iii'）一個或多個容器和/或包裝物； (iv'）任選的，PCR擴增用試劑； (v'）任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標記物的試劑； (vi'）任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器； (vii'）任選的，使用說明書； (viii'）任選的，致病菌治療劑。
10. 下述物質在制備檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒中的用途： ⑴針對SEQ ID N0:10所示序列的通用上游引物和針對SEQ ID N0:11所示序列或 SEQ ID NO :12所示序列的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所 述樣品進行PCR擴增，可獲得所述致病菌的標志性DNA，其中，所述標志性DNA序列位于所述 致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨有的特異性序列； (ii) 針對所述致病菌的標志性DNA序列的相應特異性捕獲探針、各種可檢測標記物、 或各種特異性捕獲探針與可檢測標記物的連接物； (iii) 一個或多個容器和/或包裝物； (iv) 任選的，PCR擴增用試劑； (v) 任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標記物的試劑； (vi) 任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器； (vii) 任選的，使用說明書； (viii) 任選的，致病菌治療劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419703SQ201310412753
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權日:2013年9月11日
【發(fā)明者】王慧, 周賢, 李井泉, 韓雪松, 儲瑞藹 申請人:中國科學院上海生命科學研究院