細胞培養(yǎng)改良的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)改良。本發(fā)明描述在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組蛋白例如抗體的改進方法和組合物。此外，本發(fā)明提供改良細胞培養(yǎng)基，包括改良生產(chǎn)培養(yǎng)基、補料溶液和組合補料，其可用于提高哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的蛋白生產(chǎn)率。
【專利說明】細胞培養(yǎng)改良
[0001]本申請是國際申請日為2007年9月13日的國際申請PCT / US2007 / 020027進入中國、申請?zhí)枮?00780041909.X的題為“細胞培養(yǎng)改良”的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請
[0003]本申請要求2006年9月13日申請的美國臨時申請60 / 845158、2006年12月21日申請的美國臨時申請60 / 876374的優(yōu)先權(quán)。上述各優(yōu)先權(quán)文件的內(nèi)容以參考形式并于本文。
[0004]【技術(shù)領(lǐng)域】和【背景技術(shù)】
[0005]重組DNA技術(shù)已提供了使得能夠用于包括治療、診斷、農(nóng)業(yè)及研究目的各種應(yīng)用的量的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法。
[0006]重組蛋白生產(chǎn)的目標之一是優(yōu)化細胞培養(yǎng)基和條件以獲得最大量的蛋白及最有效的生產(chǎn)方式。任何改良(包括增量改良)均可具有龐大的經(jīng)濟效益。在醫(yī)藥工業(yè)中，優(yōu)化用于疾病治療的生物制品的蛋白質(zhì)生產(chǎn)是有利的，因為在大規(guī)模生產(chǎn)生物制品時任何改良均可具有顯著影響。因此，仍需要最大化來自表達醫(yī)藥用生物蛋白的細胞培養(yǎng)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
[0007]通常，哺乳動物細胞培養(yǎng)基基于市售培養(yǎng)基配方，包括，例如，DMEM或Ham氏F12。通常，培養(yǎng)基配方并未充分富集(enriched)以支持細胞生長及生物蛋白表達的增加。仍需要改良細胞培養(yǎng)基、添加 劑及用于改良蛋白生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供用于改良細胞培養(yǎng)尤其哺乳動物細胞培養(yǎng)中的蛋白表達的方法及組合物。本發(fā)明涉及改良細胞培養(yǎng)基，包括用于蛋白表達和細胞生長的培養(yǎng)基和經(jīng)優(yōu)化用于蛋白表達的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基。
[0009]本發(fā)明也包括用于在哺乳動物細胞培養(yǎng)中高蛋白表達的最佳化方法和培養(yǎng)基。具體而言，最優(yōu)化細胞培養(yǎng)基用于在哺乳動物細胞培養(yǎng)物(例如CHO細胞)中表達抗體。也提供通過添加補充溶液(例如含有水解產(chǎn)物的溶液及濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液)促進蛋白生產(chǎn)的改良補料分批方法及組合物。
[0010]本發(fā)明提供用于哺乳動物細胞培養(yǎng)中的不含鹽的改良基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基。本發(fā)明包括包含A部分、B部分及C部分的無血清細胞培養(yǎng)基，其中A部分基本上由排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；B部分基本上由無機鐵來源組成；且C部分包含重組生長因子、緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、能量來源及至少兩種不同的非動物水解產(chǎn)物。
[0011]在一個實施方案中，A部分進一步包含非鐵金屬離子、維生素或二者組合。在一個實施方案中，B部分的無機鐵來源為檸檬酸鐵，例如約100-150mg / L或0.1-1mM終溶液濃度的檸檬酸鐵。在另一個實施方案中，B部分的無機鐵來源為檸檬酸鐵，例如約122.5mg /L或0.5mM終溶液濃度的檸檬酸鐵。
[0012]在一個實施方案中，C部分的重組生長因子選自胰島素或重組類似物、IGF-1及胰島素與IGF-1的組合，例如約4mg / L至13mg / L胰島素或其重組類似物。
[0013]在一個實施方案中，排除于經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之外的緩沖劑為HEPES緩沖劑。
[0014]在一個實施方案中，C部分的緩沖劑包含磷酸鹽緩沖劑、HEPES及碳酸氫鈉，例如約0.1至3g / L碳酸氫鈉、約0.1至3g/LHEPES。在一個實施方案中，C部分的緩沖劑包含1.6g / L碳酸氫鈉和/或約1.8g / LHEPES0在一個實施方案中，磷酸鹽緩沖劑包含約0.01至0.5g / L磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉。
[0015]在另一個實施方案中，C部分進一步包含天冬酰胺、谷氨酰胺或谷氨酰胺和天冬酰胺。
[0016]在一個實施方案中，C部分的滲透壓調(diào)節(jié)劑為NaCl，例如約1.0至6.5g / LNaCl。
[0017]在一個實施方案中，C部分的能量來源為單糖，例如葡萄糖(如D-葡萄糖)、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基包含至多約7.0g / L的葡萄糖。
[0018]在另一個實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基包含C部分的至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物，該類水解產(chǎn)物為植物源水解產(chǎn)物和既非動物源也非植物源的水解產(chǎn)物?？捎糜诒景l(fā)明的植物源水解產(chǎn)物的實例為大豆源水解產(chǎn)物。既非動物源也非植物源的水解產(chǎn)物的實例為酵母源水解產(chǎn)物。
[0019]在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基進一步包含甲氨喋呤。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基進一步包含約IOOnM至5000nM的甲氨喋呤。
[0020]在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基進一步包含細胞保護劑或表面活性劑?？捎糜诒景l(fā)明細胞培養(yǎng)基的表面活性劑的實例為甲基纖維素或pluronic多元醇,例如PluronicF-68。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含約0.l-5g / LPluronicF-68。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含約1.0g / LPluronicF-68。
[0021]在本發(fā)明的另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基進一步包含L-谷氨酰胺。
[0022]在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的pH值范圍為7.1至7.3。
[0023]在另一個實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基的滲透壓在約320至450m0sm / kg范圍內(nèi)。
[0024]本發(fā)明包括無血清細胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含下列各物質(zhì):基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約8-12ml / kg或116-126mg / L檸檬酸鐵；約2_6mg / kg重組人胰島素；約2_5g/kg無水葡萄糖；約0.1-0.5g / kgL-谷氨酰胺；約l_3g / kg碳酸氫鈉；約0.01-0.05g /kgNaH2P04 -H2O ;約 0.4-0.5g / kgNa2HP04.7Η20 ;及約 1.0-3.0g / kg 酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10.0ml / kg或122mg / L檸檬酸鐵；約4.0mg / kg重組人胰島素；約3.5g / kg無水葡萄糖；約0.29g/kgL_谷氨酰胺；約1.6g/kg 碳酸氫鈉；約 0.03g / kgNaH2P04.H2O ;約 0.43-0.44g / kgNa2HP04.7H20 ;及約 2.0g /kg酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基基本上由下列物質(zhì)組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10.0ml / kg或122mg / L檸檬酸鐵；約4.0mg / kg重組人胰島素；約3.5g / kg無水葡萄糖；約0.29g / kgL-谷氨酰胺；約1.6g / kg碳酸氫鈉；約0.03g/kgNaH2P04.H2O ;約0.43-0.44g/kgNa2HP04.7H20 ;及約 2.0g / kg 酵母源水解產(chǎn)物。
[0025]本發(fā)明進一步提供基本由下列各物質(zhì)組成的無血清細胞培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約8-12ml / kg或116-126mg / L檸檬酸鐵；約2-6mg / kg重組人胰島素；約2-5g / kg無水葡萄糖；約0.1一0.5g / kgL-谷氨酰胺；約I一3g / kg碳酸氫鈉；約0.01一0.05g /kgNaH2P04 -H2O ;約 0.4-0.5g / kgNa2HP04.7Η20 ;及約 1.0-3.0g / kg 酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)物基本上由下列各物質(zhì)組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約8— 12ml / kg或116—126mg / L檸檬酸鐵；約2_6mg / kg重組人胰島素；約2_5g / kg無水葡萄糖；約0.1—0.5g / kgL-谷氨酰胺；約 I—3g / kg 碳酸氫鈉；約 0.01—0.05g / kgNaH2P04.H2O ；約 0.4-0.5g / kgNa2HP04.7H20 ;及約 1.0-3.0g / kg 酵母源水解產(chǎn)物。
[0026]在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基進一步包含約2.50mL / kg的甲氨喋呤。
[0027]本發(fā)明也包括一種用于生產(chǎn)蛋白的方法，其包含在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；并且將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中，這樣可生產(chǎn)蛋白。
[0028]在一個實施方案中，該蛋白為抗體，包括(例如)D2E7(阿達木單抗)。
[0029]本發(fā)明進一步提供包含下列各物質(zhì)的無血清細胞生產(chǎn)培養(yǎng)基:排除下列組份的經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml / kg或122.45mg / L梓檬酸鐵；約4至8mL / kg或10至14mg / kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.5至0.7g / kgL-谷氨酰胺；約I至2g / kg碳酸氫鈉；約I至2g / kgHEPES ;約2至3g / kgNaCl ;約0.5至2g /kgPluronicF-68 ;約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ;約 0.4 至 0.5g/kgNa2HP04.7H20 ;約 8至12g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約60至70g/kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基基本由排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；約8至12ml / kg或122.45mg /L梓檬酸鐵；約4至8mL / kg或10至14mg / kg重組人胰島素；約5至9g / kg無水葡萄糖；約0.5至0.7g / kgL-谷氨酰胺；約I至2g / kg碳酸氫鈉；約I至2g / kgHEPES ;約2 至 3g / kgNaCl ;約 0.5 至 2g / kgPluronicF-68 ;約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ;約0.4至0.5g / kgNa2HP04.7Η20 ;約8至12g / kg酵母源水解產(chǎn)物；及約60至70g / kg植物源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10.0ml /kg或122.45mg / L梓檬酸鐵；約6.0mL / kg或12mg / kg重組人胰島素；約7.0g / kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g / kgL-谷氨酰胺；約1.6g / kg碳酸氫鈉；約1.8g / kgHEPES ；約 2.4 至 2.5g / kgNaCl ;約 1.0g / kgPluronicF-68 ;約 0.03 至 0.04g / kgNaH2P04.Η20 ；約 0.43 至 0.44g / kgNa2HP04.7H20 ;約 10.7g / kg 酵母源水解產(chǎn)物；及約 6.9 至 7.0g /kg植物源水解產(chǎn)物。
[0030]本發(fā)明進一步提供包含下列各物質(zhì)的無血清細胞生產(chǎn)培養(yǎng)基:排除下列組份的經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml / kg或122.45mg / L檸檬酸鐵；約3至5mL / kg或6至8mg / kg重組人胰島素；約5至9g / kg無水葡萄糖；約0.1至2g / kgL-谷氨酰胺；約I至2g / kg碳酸氫鈉；約I至2g / kgHEPES ;約2至3g / kgNaCl ;約0.1至2g /kgPluronicF-68 ;約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ;約 0.4 至 0.5g / kgNa2HP04.7H20 ;約0.4至0.5g / kgL-天冬酰胺一水合物；約2至6g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2至4g / kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基基本由下列各物質(zhì)組成:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml / kg或122.45mg / L梓檬酸鐵；約3至5mL / kg或6至8mg /kg重組人胰島素；約5至9g / kg無水葡萄糖；約0.1至2g / kgL-谷氨酰胺；約I至2g/kg碳酸氫鈉；約 I 至 2g / kgHEPES ;約 2 至 3g / kgNaCl ;約 0.1 至 2g / kgPluronicF-68 ;約0.01 至 0.lg/kgNaH2P04.H2O ;約 0.4 至 0.5g / kgNa2HP04.7Η20 ;約 0.4 至 0.5g / kgL-天冬酰胺一水合物；約2至6g / kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2至4g / kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含:經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10.0ml / kg或122.45mg / kg檸檬酸鐵；約3.8至3.9mL / kg或7.8mg / kg重組人類胰島素；約7.0g / kg無水葡萄糖；約0.8至0.9g / kgL-谷氨酰胺；約1.6g / kg碳酸氫鈉；約1.8g / kgHEPES ;約2.6至 2.7g / kgNaCl ;約 1.0g / kgPluronicF-68 ;約 0.03 至 0.04g/kgNaH2P04.Η20 ;約 0.43至0.44g / kgNa2HP04.7H20 ;約0.45g / kgL-天冬酰胺一水合物；約4.0g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2.6g / kg植物源水解產(chǎn)物。
[0031]本發(fā)明也包括包含下列各物質(zhì)的無血清細胞培養(yǎng)基:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至IOml / kg或120至130mg / L檸檬酸鐵；約3至5mL / kg或7.8mg / kg重組人胰島素；約5至9g / kg無水葡萄糖；約0.8至0.9g / kgL-谷氨酰胺；約0.3至
0.5g / kgL-天冬酰胺一水合物；約I至2g / kg碳酸氫鈉；約I至2g / kgHEPES ;約2至3g / kgNaCl ;約 0.5 至 2g / kgPluronicF-68 ;約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ;約 0.1至1.0g / kgNa2HP04.7H20 ;約2至6g / kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2至4g / kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基基本由下列各物質(zhì)組成:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至IOml / kg或120至130mg / L梓檬酸鐵；約3至5mL / kg或7.8mg /kg重組人胰島素；約5至9g / kg無水葡萄糖；約0.8至0.9g / kgL-谷氨酰胺；約0.3至0.5g / kgL-天冬酰胺一水合物；約I 至2g / kg碳酸氫鈉；約I至2g / kgHEPES ;約2至 3g / kgNaCl ;約 0.5 至 2g/kgPluronicF-68 ;約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ;約 0.1至1.0g / kgNa2HP04.7H20 ;約2至6g / kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2至4g / kg植物源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含:經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約IOml / kg或122mg / L檸檬酸鐵；約3.8至3.9mL / kg或7.8mg / kg重組人胰島素；約7.0g / kg無水葡萄糖；約0.87至0.88g/kgL-谷氨酰胺；約0.45g/kgL_天冬酰胺一水合物；約1.6g /kg 碳酸氧納；約 1.8g/kgHEPES ;約 2.67 至 2.68g / kgNaCl ;約 1.0g / kgPluronicF-68 ；約 0.03 至 0.04g / kgNaH2P04.H2O ;約 0.43 至 0.44g/kgNa2HP04.7H20 ;約 4.0g / kg 酵母源水解產(chǎn)物；及約2.6g/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0032]本發(fā)明包括包含下列各物質(zhì)的無血清細胞培養(yǎng)基:基礎(chǔ)細胞生長培養(yǎng)基；約8至12ml / kg或120至130mg / L檸檬酸鐵；約2至6mg / kg重組人胰島素；約150至250g /kg無水葡萄糖；約0.1至0.5g / kgL-谷氨酰胺；約I至2g / kg碳酸氫鈉；及約5至15g /kg酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基基本由下列各物質(zhì)組成:基礎(chǔ)細胞生長培養(yǎng)基；約8至12ml / kg或120至130mg / L梓檬酸鐵；約2至6mg / kg重組人胰島素；約150至250g / kg無水葡萄糖；約0.1至0.5g / kgL-谷氨酰胺；約I至2g / kg碳酸氫鈉；及約5至15g/kg酵母源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)細胞生長培養(yǎng)基；約IOml / kg或122 .45mg / L檸檬酸鐵；約4mg / kg重組人胰島素；約200g / kg無水葡萄糖；約0.29至0.30g / kgL-谷氨酰胺；約1.6g / kg碳酸氫鈉；及約Ilg / kg酵母源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，蛋白為抗體,包括(例如)完全人抗體、抗IL-12抗體，例如ABT-874。
[0033]本發(fā)明也包括包含下列各物質(zhì)的無血清細胞培養(yǎng)基:基礎(chǔ)細胞生長培養(yǎng)基；約8至12ml / kg或120至130mg / L梓檬酸鐵；約2至6mg / kg重組人胰島素；約I至3g /kg無水葡萄糖；約0.1至lg/kgL-谷氨酰胺；約I至2g/kg碳酸氫鈉；及約I至4g / kg酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基基本由下列各物質(zhì)組成:基礎(chǔ)細胞生長培養(yǎng)基；約8至12ml / kg或120至130mg / L梓檬酸鐵；約2至6mg/kg重組人胰島素；約I至3g / kg無水葡萄糖；約0.1至Ig / kgL-谷氨酰胺；約I至2g/kg碳酸氫鈉；及約I至4g/kg酵母源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)細胞生長培養(yǎng)基；約IOml / kg或122.45mg / L梓檬酸鐵；約4mg / kg重組人胰島素；約1.5g / kg無水葡萄糖；約0.29至0.30g / kgL-谷氨酰胺；約1.6g / kg碳酸氫鈉；及約2g / kg酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的PH值為約7.10至7.30，滲透壓在約300至340m0Sm/kg的范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含至少8g / kg酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，使用細胞培養(yǎng)在哺乳動物細胞(例如CHO細胞)中生產(chǎn)的蛋白為抗體，包括，例如，抗IL-12抗體或抗EPO-R抗體，例如ABT-874 。
[0034]本發(fā)明進一步提供包含下列各物質(zhì)的細胞培養(yǎng)基:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約 8 至 12ml / kg 或 120 至 130mg / L 朽1 檬酸鐵；約 2.5 至 4.5mL / kg 或 7.8mg /kg重組人胰島素；約5至9g / kg無水葡萄糖；約0.5至Ig / kgL-谷氨酰胺；約0.1至Ig / kgL-天冬酰胺一水合物；約I至2g / kg碳酸氫鈉；約I至2g / kgHEPES ;約I至4g / kgNaCl ;約 0.1 至 2g / kgPluronicF-68 ;約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ;約 0.1至Ig / kgNa2HP04.7Η20 ;約2至6g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2至6g/kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，本發(fā)明細胞培養(yǎng)基基本由下列各物質(zhì)組成:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或120至130mg/L梓檬酸鐵；約2.5至4.5mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.5至lg/kgL-谷氨酰胺；約0.1至lg/kgL-天冬酰胺一水合物；約I至2g/kg碳酸氫鈉；約I至2g/kgHEPES ;約I至4g/kgNaCl ;約0.1至 2g/kgPluronicF_68 ;約 0.01 至 0.1gAgNaH2PO4.H2O ;約 0.1 至 IgAgNa2HPO4.7H20 ;約2至6g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2至6g/kg植物源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含:經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.87至0.88g/kgL_谷氨酰胺；約0.45g/kgL-天冬酰胺一水合物；約1.6g/kg碳酸氫鈉；約1.8g/kgHEPES ;約2.67g/kgNaCl ;約 1.0g/kg Pluronic F-68 ;約 0.03 至 0.04g/kgNaH2P04.H2O ;約 0.43 至 0.44g/kgNa2HPO4.7H20 ;約4.0g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約2.6g/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0035]本發(fā)明也包括包含下列各物質(zhì)的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基:經(jīng)修飾以去除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基；碳酸氫鈉、HEPES緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或120至130mg/L梓檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至lg/kgL-谷氨酰胺；約I至2g/kg 碳酸氫鈉；約 I 至 2g/kgHEPES ;約 I 至 3g/kg NaCl ;約 0.5 至 2g/kg Pluronic F-68 ；約 0.01 至 0.lg/kgNaH2P04.H2O ;約 0.1 至 lg/kg Na2HPO4.7H20 ;約 8 至 12g/kg 酵母源水解產(chǎn)物；及約6至8g/kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，本發(fā)明細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基基本由下列各物質(zhì)組成:經(jīng)修飾以去除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、HEPES緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或120至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至lg/kgL-谷氨酰胺；約I至2g/kg碳酸氫鈉；約I至2g/kg HEPES ；約 I 至 3g/kg NaCl ;約 0.5 至 2g/kg Pluronic F-68 ;約 0.01 至 0.lg/kg NaH2PO4.H2O ；約0.1至lg/kgNa2HP04.7H20 ;約8至12g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約6至8g/kg植物源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約 0.58 至 0.59g/kg L-谷氨酰胺；約 1.6g/kg 碳酸氫鈉；約 1.8g/kg HEPES ;約 2.45g/kgNaCl ;約 1.0g/kg Pluronic F-68 ;約 0.03 至 0.04g/kg NaH2PO4.Η20 ;約 0.43 至 0.44g/kgNa2HPO4.7H20 ;約10.7g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產(chǎn)物。 [0036]本發(fā)明另一方面為包含下列各物質(zhì)的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至lg/kg L-谷氨酰胺；約I至2g/kg碳酸氫鈉;約 I 至 2g/kg HEPES ;約 I 至 3g/kg NaCl ;約 0.1 至 2g/kg Pluronic F-68 ;約 0.01至 0.lg/kg NaH2PO4.H2O ;約 0.1 至 lg/kg Na2HPO4.7Η20 ;約 12 至 16g/kg 酵母源水解產(chǎn)物；及約8至10g/kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基基本由下列各物質(zhì)組成:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至lg/kgL-谷氨酰胺；約I至2g/kg碳酸氫鈉；約I至2g/kg HEPES ;約I至3g/kg NaCl ;約0.1至2g/kg Pluronic F-68 ;約 0.01 至 0.lg/kg NaH2PO4.H2O ;約 0.1 至 lg/kg Na2HPO4.7H20 ；約12至16g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約8至10g/kg植物源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，本發(fā)明細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含:經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺;約 1.6g/kg 碳酸氫鈉;約 1.8g/kg HEPES ;約 2.45g/kg NaCl ;約 1.0g/kgPluronic F-68 ;約 0.03 至 0.04g/kg NaH2PO4.Η20 ;約 0.43 至 0.44g/kg Na2HPO4.7H20 ;約14.2至14.3g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約9.2至9.3g/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0037]在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的pH為約6至8。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的pH約7.10至7.20。
[0038]在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的滲透壓約350至450m0sm/kg。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的滲透壓約373至403m0sm/kg。
[0039]本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基可進一步包含甲氨喋呤。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基進一步包含例如約Ι-lOmL/kg甲氨喋呤。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基進一步包含例如約2.50mL/kg甲氨喋呤。[0040]在一個實施方案中，在細胞培養(yǎng)物中表達的蛋白為抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個實施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合片段為抗-TNFa抗體或抗-EPO-R抗體。在另一個實施方案中，抗-TNFa抗體或其抗原結(jié)合片段為完全人類抗TNF a抗體，包括，例如，完全人類抗-TNF a抗體D2E7(阿達木單抗)。在又另一個實施方案中，該抗體或其抗原結(jié)合片段為抗-1L-12或抗-1L-18抗體，包括完全人類抗-1L-12或抗-1L-18抗體。
[0041]本發(fā)明也包括一種用于生產(chǎn)蛋白(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)的方法，其包含在本文所呈現(xiàn)的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼蛋白(例如抗體)的核酸的哺乳動物細胞。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基為細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基。可使用本發(fā)明方法及組合物生產(chǎn)的抗體或其抗原結(jié)合片段的實例包括抗IL-18抗體、抗-TNF a抗體、抗-1L-12抗體及抗EPO受體(EPO-R)抗體。
[0042]在一個實施方案中，本發(fā)明進一步包含從本文所述細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離蛋白。
[0043]在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基及方法用于培養(yǎng)哺乳動物細胞，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
[0044]本發(fā)明也包括本文所述任何細胞培養(yǎng)基中的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
[0045]本發(fā)明亦提供用于在哺乳動物細胞培養(yǎng)物(例如CHO細胞)中生產(chǎn)蛋白的改良補料分批方法和相關(guān)細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明一方面為生產(chǎn)蛋白的補料分批方法，其包含在包含細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及通過在一時段內(nèi)向細胞培養(yǎng)物中添加水解產(chǎn)物富集(enrichment)溶液和基礎(chǔ)富集溶液而向哺乳動物細胞饋料，其中水解產(chǎn)物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物；這樣可生產(chǎn)蛋白。
[0046]在一個實施方案中，基礎(chǔ)富集溶液包含濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，基礎(chǔ)富集溶液包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、天冬酰胺和葡萄糖。在另一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PFCHO。
[0047]在一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液包含非衍生自植物或動物的第一水解產(chǎn)物和第二植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，非衍生自植物或動物和植物源的水解產(chǎn)物為酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，植物源水解產(chǎn)物為大豆源水解產(chǎn)物。
[0048]在一個實施方案中，所生產(chǎn)的蛋白為抗體或其抗原結(jié)合部分?？捎糜诒景l(fā)明的分批補料方法的抗體或其抗原結(jié)合部分的實例包括抗-TNF a抗體、抗-1L-12抗體、抗-1L-18抗體及抗EPO受體(EPO-R)抗體。
[0049]本發(fā)明包括產(chǎn)生抗TNFa抗體(包括，例如完全人類抗TNF a抗體，如阿達木單抗)的分批補料方法，其包含在包含細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)包含編碼抗-TNFa抗體的核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；并通過在一時段內(nèi)向細胞培養(yǎng)物中添加水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液而向CHO細胞補料，其中基礎(chǔ)富集溶液包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解產(chǎn)物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物；這樣可生產(chǎn)抗-TNF a抗體。
[0050]本發(fā)明包括生產(chǎn)抗-TNFa抗體的分批補料方法，其包含在包含細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)包含編碼抗-TNF a抗體的核酸的CHO細胞，該細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含至少l_5g/L例如2.0g/L的葡萄糖，其中通過按需要向細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加葡萄糖以維持至少l_5g/L例如2.0g/L的葡萄糖濃度來控制葡萄糖濃度；并且通過在一時段內(nèi)向細胞培養(yǎng)物中添加水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液而向CHO細胞補料，其中基礎(chǔ)富集溶液包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解產(chǎn)物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物；這樣可生產(chǎn)抗-TNFa抗體。
[0051]在一個實施方案中，本發(fā)明包括進一步回收抗-TNF a抗體。
[0052]在又另一個實施方案中，在約32至38°C范圍內(nèi)(例如35°C )的溫度下培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物。
[0053]在一個實施方案中，使細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的溶氧維持在20-65%之間，例如約30%溶氧。
[0054]在一個實施方案中，在整個培養(yǎng)過程中維持細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的滲透壓不超過500m0smo
[0055]在一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液包含非衍生自植物或動物的第一水解產(chǎn)物及第二植物源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，非衍生自植物或動物和植物源水解產(chǎn)物的水解產(chǎn)物為酵母源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，植物源水解產(chǎn)物為大豆源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液基本由下列各物質(zhì)組成:約50至280g/kg，例如250至280g/kg大豆源水解產(chǎn)物及約75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液包含約50至280g/kg，例如250至280g/kg大豆源水解產(chǎn)物及約75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解產(chǎn)物。
[0056]在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PF CH0。
[0057]在一個實施方案中，基`礎(chǔ)富集溶液的pH值約9.0至10.5。
[0058]在另一個實施方案中，分批補料方法的時段在約9至15天之間或為約12天。
[0059]在另一個實施方案中，于該時段中以下各日中至少一日將基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中:第4日、第6日、第9日及第11日。在一個實施方案中，于該時段中第4日、第7日或第4日和第7日將水解產(chǎn)物富集溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。
[0060]在另一個實施方案中，分批補料方法進一步包含根據(jù)pH值線性斜坡(linearramp)調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH值，其中該pH值線性斜坡包含自約6.5_8(例如，7.1至7.2之間)的pH值起始且產(chǎn)生約6.5-7.0(例如6.9)的最終pH值。在一個實施方案中，至少在約24小時的時間段內(nèi)調(diào)節(jié)pH值線性斜坡。在另一個實施方案中，至少在約48小時的時間段內(nèi)調(diào)節(jié)PH值線性斜坡。在另一個實施方案中，在約72小時的時間段內(nèi)調(diào)節(jié)pH值線性斜坡。
[0061]本發(fā)明也包括在分批補料方法中使用本文所述的細胞培養(yǎng)基，例如包含下列各物質(zhì)的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基；碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至10ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約4至8mL/kg或10至14mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至lg/kg L-谷氨酰胺；約I至3g/kg碳酸氫鈉；約I至3g/kg HEPES ;約2至3g/kg NaCl ;約 0.1 至 2g/kgPluronic F-68 ;約 0.01 至 0.lg/kg NaH2PO4.Η20 ;約 0.1 至 0.1g/kgNa2HP04.7H20 ;約8至12g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約6至8g/kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；約10.0ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.0mL/kg或12mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kgL-谷氨酰胺；約 1.6g/kg碳酸氫鈉；約 1.8g/kg HEPES ;約2.45g/kgNaCl ;約 1.0g/kg Pluronic F-68 ;約 0.03 至 0.04g/kg NaH2PO4.Η20 ;約 0.43 至 0.44g/kg Na2HPO4.7Η20 ；約10.7g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0062]本發(fā)明也提供生產(chǎn)抗-1L12抗體(例如完全人類抗-1L12抗體(如ABT-874))的分批補料方法，其包含在包含細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的CHO細胞；通過在一時段內(nèi)向細胞培養(yǎng)物中添加水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液向CHO細胞補料，其中基礎(chǔ)富集溶液包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解產(chǎn)物富集溶液包含至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物；這樣可產(chǎn)生抗-1L12抗體。
[0063]在一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液進一步包含葡萄糖。
[0064]在一個實施方案中，本發(fā)明也包括回收抗-1L12抗體。
[0065]在一個實施方案中，在約32至38°C范圍內(nèi)(例如約33°C )的溫度下培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物。
[0066]在本發(fā)明的一個實施方案中，將細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的溶氧維持在20-65%之間，例如約40%溶氧。
[0067]在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的pH值約6.7至7.2。
[0068]在本發(fā)明的另一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液包含非衍生自植物或動物的水解產(chǎn)物和植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，非衍生自植物或動物的水解產(chǎn)物為酵母源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，植物源水解產(chǎn)物為大豆源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液基本 由下列各物質(zhì)組成:約50至225g/kg,例如150至180g/kg大豆源水解產(chǎn)物、約75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解產(chǎn)物及約I至5g/L，例如2至3g/L葡萄糖。在另一個實施方案中，水解產(chǎn)物富集溶液包含約50至225g/kg，例如150至180g/kg大豆源水解產(chǎn)物、約75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解產(chǎn)物及約I至5g/L，例如2至3g/L葡萄糖。在一個實施方案中，基礎(chǔ)富集溶液包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、天冬酰胺和葡萄糖。
[0069]在另一個實施方案中，基礎(chǔ)富集溶液的pH值約9.7，滲透壓約1400至1500m0sm。在另一個實施方案中，基礎(chǔ)富集溶液中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PF CH0。
[0070]在一個實施方案中，分批補料方法的時段在14-15天之間。
[0071]在一個實施方案中，自該時段的第5日起，每隔一天將基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞
培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。
[0072]在本發(fā)明的一個實施方案中，自該時段的第6日起始，每天將基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。在另一個實施方案中，自該時段的第5日起始，每天將基礎(chǔ)富集溶液及水解產(chǎn)物富集溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。
[0073]本發(fā)明也包括在分批補料方法中使用本文所述的細胞培養(yǎng)基，例如包含下列各物質(zhì)的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基；碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約8至12ml/kg或110至130mg/L檸檬酸鐵；約5至8mL/kg或11至15mg/kg重組人胰島素；約5至9g/kg無水葡萄糖；約0.1至lg/kg L-谷氨酰胺；約I至2g/kg碳酸氫鈉；約I至2g/kg HEPES ;約2至3g/kg NaCl ;約 0.1 至 2g/kg Pluronic F-68 ;約 0.01 至 0.lg/kg NaH2PO4.Η20 ;約 0.1 至 Ig/kgNa2HP04.7H20 ;約6至12g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約6至8g/kg植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含:約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；約 1.6g/kg碳酸氧納；約 1.8g/kg HEPES ;約 2.45g/kg NaCl ;約 1.0g/kgPluronic F-68 ;約
0.03 至 0.04g/kg NaH2PO4.H2O ;約 0.43 至 0.44g/kgNa2HP04.7H20 ;約 10.7g/kg 酵母源水解產(chǎn)物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0074]在一個實施方案中，本發(fā)明以大規(guī)模培養(yǎng)細胞方法為特點。在一個實施方案中，大規(guī)模細胞培養(yǎng)大于約10L。在另一個實施方案中，大規(guī)模細胞培養(yǎng)為約13L。
[0075]本發(fā)明也提供組合補料溶液，因為這些溶液可在一種溶液中提供養(yǎng)分組合所以是有利的。本發(fā)明包括包含下列各物質(zhì)的組合補料溶液:葡萄糖；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物。本發(fā)明也包括基本由下列各物質(zhì)組成的組合補料溶液:葡萄糖；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物。
[0076]在一個實施方案中，補料溶液的pH值約6.0至8.0。
[0077]在一個實施方案中，組合補料溶液包含約100至250g/kg葡萄糖。在一個實施方案中，組合補料溶液包含氨基酸天冬酰胺，例如約1.0至15.0g天冬酰胺；或約3.0至5.0g/kg天冬酰胺。
[0078]在一個實施方案中，組合補料溶液中的至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物為植物源水解產(chǎn)物和既非動物源也非植物源的水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，非動物源或植物源水解產(chǎn)物為酵母源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，植物源水解產(chǎn)物為大豆源水解產(chǎn)物。
[0079]在一個實施方案中，`組合補料溶液包含為PF-CHO或DMEM/F12培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在一個實施方案中，基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基為經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基且排除以下組份:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、谷氨酰胺和葡萄糖。
[0080]在另一個實施方案中，組合補料溶液進一步具有小于約15NTU的濁度。
[0081]本發(fā)明以維持細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的穩(wěn)定葡萄糖含量的方法為特點，其包含添加本文所述的組合補料溶液。
[0082]本發(fā)明的另一方面為制造包含下列各物質(zhì)的組合補料溶液的方法:基礎(chǔ)培養(yǎng)基、葡萄糖及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物，其包含將葡萄糖與基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基組合至溶液中；將a)溶液的pH值調(diào)節(jié)至約9.5至10.5 ;將至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物添加至b)溶液中；并調(diào)節(jié)c)溶液的pH值，這樣組合補料溶液的pH值約6.5至7.5。在一個實施方案中，步驟c)包含添加既非以動物源也非植物源的第一水解產(chǎn)物和第二植物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，非動物源或植物源水解產(chǎn)物為酵母源水解產(chǎn)物。在另一個實施方案中，植物源水解產(chǎn)物為大豆源水解產(chǎn)物。
[0083]本發(fā)明進一步提供增加由哺乳動物細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的蛋白(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)的方法。本發(fā)明提供由哺乳動物細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)至少約1.5g/L抗體的方法，其包含在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及向細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加pH值約6.7至7.2的組合補料溶液，其中該組合補料溶液包含葡萄糖、基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基、除谷氨酰胺以外的氨基酸及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物，這樣可生產(chǎn)至少約1.5g/L抗體。在一個實施方案中，生產(chǎn)至少2g/L抗體。在另一個實施方案中，生產(chǎn)至少4g/L抗體。在另一個實施方案中，生產(chǎn)至少5g/L抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生約6g/L抗體的方法。[0084]在一個實施方案中，組合補料溶液包含約100至250g/kg葡萄糖。
[0085]本發(fā)明也提供用于增加哺乳動物細胞培養(yǎng)物所生產(chǎn)抗體的滴度的方法，其包含在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及向細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加pH值約6.7至7.2的組合補料溶液，其中該組合補料溶液包含葡萄糖、基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基、除谷氨酰胺以外的氨基酸及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物；這樣所產(chǎn)生抗體的滴度比根據(jù)步驟a)且排除步驟b)培養(yǎng)的對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物高至少50%。在一個實施方案中，所生產(chǎn)的抗體滴度比對照物高至少100%。在另一個實施方案中，所生產(chǎn)的抗體滴度比對照物高至少150 %。
[0086]在一個實施方案中，當(dāng)細胞密度達到每毫升至少2.0X IO6個細胞時添加組合補料溶液。在一個實施方案中，當(dāng)細胞密度達到每毫升約3.5 X IO6個細胞時添加組合補料溶液。
[0087]本發(fā)明進一步提供在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)蛋白(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)的方法，其包含在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及使用反饋控制系統(tǒng)來監(jiān)控細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的代謝指示劑水平，藉此將組合補料溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中，其中在該反饋控制系統(tǒng)所測定的時間點將組合補料溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中，這樣以生產(chǎn)抗體。在一個實施方案中，代謝指示劑為葡萄糖或谷氨酰胺。在另一個實施方案中，補料溶液為包含下列各物質(zhì)的組合補料溶液:葡萄糖；基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，抗體為抗-TNFa抗體、抗-1L-12抗體、抗-1L-18抗體及抗-EPO受體(EPO-R)抗體。
[0088]在一個實施方案中，使用本發(fā)明方法生產(chǎn)至少1.5g/L滴度的抗體。在另一個實施方案中，生產(chǎn)至少2g/L的滴度。
[0089]在本發(fā)明的一個實施方案中，組合補料溶液包含約3.0至12.5g/kg天冬酰胺。
[0090]在本發(fā)明的一個實施方案中，組合補料溶液包含約100至200g/kg葡萄糖。
[0091]在另一個實施方案中，本發(fā)明進一步包含監(jiān)控細胞培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，使得葡萄糖水平維持于約0.25與20.0g/L之間。在一個實施方案中，使用自動取樣裝置監(jiān)控葡萄糖水平。
[0092]在一個實施方案中，使用本文公開的方法和組合物生產(chǎn)的抗體或其抗原結(jié)合部分選自:抗-TNFa抗體、抗-1L-18抗體、抗-EPO-R抗體及抗IL-12抗體。在一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分為完全人類抗體。在一個實施方案中，抗-TNF a抗體為D2E7(阿達木單抗)。在一個實施方案中，抗IL-18抗體為ABT-325。在一個實施方案中，抗IL-12抗體為 ABT-874。
[0093]本發(fā)明也提供測定在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)蛋白的補料曲線的方法，其包含在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及使用反饋控制系統(tǒng)監(jiān)控細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的代謝指示劑，藉此將組合補料溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中，其中將組合補料溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中以達到目標代謝指示劑設(shè)定點；及測定每天添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的組合補料溶液的量，這樣以測定補料曲線。
[0094]在一個實施方案中，代謝指示劑為葡萄糖或谷氨酰胺。
[0095]本發(fā)明也包括在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)蛋白的分批補料方法，其包含根據(jù)使用本發(fā)明方法測定的補料曲線將組合補料溶液添加至哺乳動物細胞培養(yǎng)物中。
[0096]本發(fā)明的另一方面為包括丁酸鈉和/或N-乙酰半胱氨酸的改良細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明以在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)抗體使得抗體滴度為至少300mg/L的方法為特點，該方法包含在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；向細胞培養(yǎng)基中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合，其中添加丁酸鈉至終濃度約0.1mM至IOmM且添加N-半胱氨酸至終濃度約ImM至80mM ;這樣以生產(chǎn)至少300mg/L滴度的抗體。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約100mg/L。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約200mg/L0在一個實施方案中，抗體滴度至少為約250mg/L。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約300mg/L。在一個實施方案中，抗體滴度至少為約400mg/L。
[0097]本發(fā)明也提供在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)抗體，使得抗體滴度至少比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物高10%的方法，該方法包含a)在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及b)向細胞培養(yǎng)基中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合，其中添加丁酸鈉至終濃度約0.1mM至IOmM且添加N-乙酰半胱氨酸終濃度至約ImM至80mM，使得抗體滴度至少比對照物高10%，其中對照哺乳動物細胞培養(yǎng)包含步驟a)且排除步驟
b)。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物改良至少29%。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物改良至少40%。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物改良至少70%。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物高至少90%。
[0098]在一個實施方案中，在哺乳動物細胞培養(yǎng)物的生長期向哺乳動物細胞培養(yǎng)物中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合。
[0099]在一個實施方案中，在培養(yǎng)時間的第4天與第7天之間向哺乳動物細胞培養(yǎng)物中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合。
[0100]在一個實施方案中，在`培養(yǎng)時間的第O天向哺乳動物細胞培養(yǎng)物中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合。
[0101]在另一個實施方案中，丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至10mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至8.0mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的終濃度為約0.1mM至
3.0mM 丁酸鈉。
[0102]在一個實施方案中，N-乙酰半胱氨酸的終濃度為約20mM至60mM。在一個實施方案中，N-乙酰半胱氨酸的終濃度為約10mM。在一個實施方案中，N-乙酰半胱氨酸的終濃度為約8mM。
[0103]本發(fā)明進一步提供與對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物相比使哺乳動物細胞培養(yǎng)物的壽命延長至少35%的方法，該方法包含a)在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞；及b)將約ImM至80mM N-乙酰半胱氨酸添加至細胞培養(yǎng)基中，使得哺乳動物細胞培養(yǎng)物的壽命與對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物相比延長至少35%，其中對照哺乳動物細胞培養(yǎng)包含步驟a)且排除步驟b)。
[0104]在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的壽命與對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物相比延長至少約45%。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的壽命與對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物相比延長至少約55%。[0105]在一個實施方案中，本發(fā)明方法包含將終濃度為約8mM的N-乙酰半胱氨酸添加至
細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。
[0106]在一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分選自抗-TNFa抗體、抗_IL_18抗體(例如ABT-325)及抗IL-12抗體。
[0107]本發(fā)明提供包含A部分、B部分及C部分的無血清細胞培養(yǎng)基，其中A部分基本由排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖部分基本由無機鐵來源組成；且C部分包含重組生長因子、緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、能量來源及至少兩種不同的非動物水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，C部分基本由下列各物質(zhì)組成:重組生長因子；緩沖劑；滲透壓調(diào)節(jié)劑；能量來源；及至少兩種不同的非動物水解產(chǎn)物。
[0108]本發(fā)明也提供包含下列各物質(zhì)的無血清細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基:維生素含量降低且排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約7.0g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；約1.6g/kg碳酸氧納；約 1.8g/kg HEPES ;約 2.45g/kg NaCl ;約 1.0g/kg Pluronic F-68 ;約 0.03 至
0.04g/kg NaH2PO4.H2O ;約 0.43 至 0.44g/kg Na2HPO4.7Η20 ;約 10.7g/kg 酵母源水解產(chǎn)物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0109]本發(fā)明也提供包含下列各物質(zhì)的無血清細胞培養(yǎng)基:維生素含量降低且排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖； 約150g/kg無水葡萄糖；約5.0g/kg L-天冬酰胺一水合物；約
1.6g/kg碳酸氫鈉；約65g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及約4lg/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0110]本發(fā)明進一步提供包含下列各物質(zhì)的無血清細胞培養(yǎng)基:維生素含量降低且排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖；約10ml/kg或122.45mg/L檸檬酸鐵；約6.5mL/kg或13mg/kg重組人胰島素；約200g/kg無水葡萄糖；約0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；約1.6g/kg碳酸氧納；約 1.8g/kg HEPES ;約 2.45g/kg NaCl ;約 1.0 g/kgP luronic F-68 ;約 0.03 至
0.04g/kg NaH2PO4.H2O ;約 0.43 至 0.44g/kgNa2HP04.7H20 ;約 10.7g/kg 酵母源水解產(chǎn)物；及約6.9至7.0g/kg植物源水解產(chǎn)物。
[0111]本發(fā)明也提供改良培養(yǎng)基的以下實施方案。本發(fā)明包括用于培養(yǎng)CHO細胞以表達重組生物制品的改良培養(yǎng)基，其包含A、B和C部分，其中:A部分包含水、氨基酸、維生素及其他輔因子部分包含無機鐵來源；且C部分包含重組生長因子、緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、能量來源、非鐵金屬離子、水解產(chǎn)物及附加試劑。
[0112]在一個實施方案中，C部分包含碳酸氫鈉、HEPES、磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉、氯化鈉、Pluixmic F-68及葡萄糖。在另一個實施方案中，添加1.5g/L碳酸氫鈉。在另一個實施方案中，添加1.8g/L HEPES。在另一個實施方案中，添加0.1-0.5g/L磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉。在另一個實施方案中，添加lg/L至6.5g/L氯化鈉。在另一個實施方案中，添加
1.0g/L Pluronic F-68。在一個實施方案中,添加lg/L至7g/L葡萄糖。在一個實施方案中，維生素選自PABA (對氨基苯甲酸)、生物素、D-Ca泛酸鹽(維生素B5)、葉酸、內(nèi)消旋肌醇、煙酰胺、Pyrodoxine (維生素B6)、核黃素(維生素B2)、硫胺素(維生素BI)和氰鈷胺(Cyanocobalamin)(維生素B12)。在另一個實施方案中,其他輔因子選自脂因子、醇胺、氨基酸和肽。在另一個實施方案中，脂因子選自氯化膽堿及磷脂酰膽堿。在另一個實施方案中，醇胺為乙醇胺。在一個實施方案中，氨基酸選自天冬酰胺、谷氨酰胺及腐胺。
[0113]在一個實施方案中，肽為谷胱甘肽。在一個實施方案中，添加0.4mg/L至1.65mg/L谷胱甘肽。
[0114]在另一個實施方案中，B部分的無機鐵來源為檸檬酸鐵。在一個實施方案中，添加10mL/L或122mg/L檸檬酸鐵。在另一個實施方案中，使檸檬酸鐵保持122mg/L的濃度。在一個實施方案中，重組生長因子為胰島素或重組類似物、IGF-1或胰島素與IGF-1的組合。在一個實施方案中，添加4mg/L至13mg/L胰島素或重組類似物。在另一個實施方案中，添加25ng/L至150ng/L IGF-10在另一個實施方案中，添加50ng/L至100ng/L IGF-10在另一個實施方案中，將25ng/L至150ng/L IGF-1添加至胰島素中。在一個實施方案中，將50ng/L至100ng/L IGF-1添加至胰島素中。
[0115]在另一個實施方案中，滲透壓調(diào)節(jié)劑選自NaCl、KCl、KN03。在一個實施方案中，添加Og/L至10g/L滲透壓調(diào)節(jié)劑。在另一個實施方案中，添加Og/L至6.5g/L滲透壓調(diào)節(jié)劑。
[0116]在另一個實施方案中，能量來源為單糖，例如葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麥芽糖、甘露糖、半乳糖及果糖。在一個實施方案中，添加1.0g/L至7.0g/L葡萄糖。在另一個實施方案中，添加1.5g/L至5.0g/L葡萄糖。
[0117]在另一個實施方案中，以氯化物和硫酸鹽的形式添加非鐵金屬離子。在一個實施方案中，非鐵金屬離子選自鉀、鎂、銅、硒、鋅、鎳、錳、錫、鎘、鑰酸鹽、釩酸鹽及硅酸鹽。在一個實施方案中，緩沖劑選自碳酸鹽、氯化物、硫酸鹽和磷酸鹽。在一個實施方案中，緩沖劑選自 NaHC03、CaCl2, MGSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, C3H3O3Na 和稱作 HEPES 的 N-[2-羥乙基]哌嗪-N' -[2-乙烷磺酸]。
`[0118]在本發(fā)明的一個實施方案中，添加至培養(yǎng)基中的附加試劑之一為甲氨喋呤。在一個實施方案中，甲氨喋呤用于使表達抗-1L-18、抗-1L-12、抗-TNFa (例如完全人類抗-TNFa)或抗EPO-R抗體的CHO細胞的生長。在一個實施方案中，添加IOOmM至5000nM。在一個實施方案中，向培養(yǎng)基中添加500nM甲氨喋呤。在一個實施方案中，添加IOOnM甲氨喋呤。在一個實施方案中，添加5000nM甲氨喋呤。
[0119]在本發(fā)明的另一個實施方案中，附加試劑之一為細胞保護劑，例如甲基纖維素或pluronic多元醇(例如Pluronic F-68)。在一個實施方案中，添加0.5g/L至1.0g/L甲基纖維素。在一個實施方案中，添加0.5g / L至l.0g / L Pluronic F-68。在一個實施方案中，添加 0.7g / L 至 1.2g / L Pluronic F-68。
[0120]在另一個實施方案中，將A部分的pH增加至最大pH值10。在一個實施方案中，在添加水解產(chǎn)物之后將A部分的pH降低至最小值7.0。
[0121]本發(fā)明也提供用于表達完全人類抗-TNF a抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10.0ml / kg 或 122mg / kg 朽1 檬酸鐵；2mL / kg 或 4.0mg / kg 重組人胰島素；3.5g /kg無水葡萄糖；0.292g / kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；0.031g / kg NaH2PO4.H2O ；0.436g / kgNa2HP04.7H20 ；2.0g / kg 水解產(chǎn)物；及 2.50mL / kg 甲氨喋呤。
[0122]本發(fā)明也提供用于表達完全人類抗-TNF-α抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10.0ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；6.0mL / kg或12mg / kg重組人胰島素；7.0g / kg無水葡萄糖；0.584g / kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；1.8g / kg HEPES ；2.45g / kg NaCl ； 1.0g / kg Pluronic F-68 ；0.031g / kg NaH2PO4.H2O ；0.436g / kgNa2HPO4.7H20 ；10.7g / kg 水解產(chǎn)物；6.92g / kg 植物蛋白胨(Phytone peptone);及
2.50mL / kg甲氨喋呤。
[0123]本發(fā)明也包括用于表達完全人類抗-TNF-α抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg 或 122mg / L 朽1 檬酸鐵；3.88mL / kg 或 7.8mg / kg 重組人胰島素；7.0g /kg無水葡萄糖；0.876g / kg L-谷氨酰胺；0.45g / kg L-天冬酰胺一水合物；1.6g /kg 碳酸氧納；1.8g / kgHEPES ;2.67g / kg NaCl ；1.0g / kg Pluronic F-68 ；0.031g /kgNaH2P04.H2O ；0.436g / kg Na2HPO4.7H20 ；10.7g / kg 水解產(chǎn)物；6.92g / kg 植物蛋白胨；及2.50mL / kg甲氨喋呤。
[0124]本發(fā)明進一步提供用于表達完全人類抗-TNF-α抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / L檸檬酸鐵；3.88mL / kg或7.8mg / kg重組人胰島素；7.0g / kg無水葡萄糖；0.876g / kg L-谷氨酰胺；0.45g / kg L-天冬酰胺一水合物；1.6g / kg 碳酸氧納；lg / kgHEPES ;2.67g / kg NaCl ；1.0g / kg Pluronic F-68 ；0.031g / kgNaH2P04.H2O ；0.436g / kg Na2HPO4.7H20 ；4.0g / kg 水解產(chǎn)物；2.6g / kg 植物蛋白胨 '及2.50mL / kg甲氨喋呤。
[0125]本發(fā)明的另一方面為用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:IOml / kg 或 122mg / L 朽1 檬酸鐵；3.88mL / kg 或 7.8mg / kg 重組人胰島素；7.0g/kg 無水葡萄糖；0.876g / kg L-谷氨酰胺；0.45g / kg L-天冬酰胺一水合物；1.6g / kg碳酸氫鈉；1.8g / kg HEPES ；2.675g/kg NaCl ；1.0g/kg Pluronic F-68 ；0.031g/kg NaH2PO4.H2O ；0.436g / kg Na2HPO4.7H20 ;4.0g / kg 酵母源水解產(chǎn)物；2.579g / kg 植物蛋白胨；及
2.50mL / kg甲氨喋呤。
[0126]本發(fā)明提供用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / L檸檬酸鐵；6.5mL / kg或13mg / kg重組人胰島素；7.0g / kg無水葡萄糖；
0.584g / kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg 碳酸氫鈉；1.8g / kg HEPES ；2.45g / kg NaCl ；
1.0g / kg Pluronic F-68 ；0.031g / kg NaH2PO4.H2O ；0.436g / kg Na2HPO4.7Η20 ；10.7g /kg酵母水解產(chǎn)物；及6.92g / kg植物蛋白胨。
[0127]本發(fā)明提供用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:150.0g /kg無水葡萄糖；5.0g / kg L-天冬酰胺一水合物；65.0g / kg酵母水解產(chǎn)物；及41.0g /kg植物蛋白胨。
[0128]本發(fā)明也提供用于表達抗-1L-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml /kg或122mg / kg檸檬酸鐵；6.5mL / kg或13mg / kg重組人胰島素；200.0g / kg無水葡萄糖；0.584g / kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg 碳酸氫鈉；1.8g / kg HEPES ；2.45g / kgNaCl ；1.0ml / kg Pluronic F-68 ；0.031g / kg NaH2PO4.Η20 ；0.436g / kg Na2HPO4.7Η20 ；
10.7g / kg酵母水解產(chǎn)物；及6.92g / kg植物蛋白胨。
[0129]本發(fā)明包括用于表達抗-1L-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；2mL / kg或4mg / kg重組人胰島素；3.5+1.5g / kg無水葡萄糖；0.292g / kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；2g / kg酵母水解產(chǎn)物；及0.25mL /kg甲氨喋呤。[0130]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；2mL / kg或4mg / kg重組人胰島素；3.5+1.5g / kg無水葡萄糖；0.292g / kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；llg / kg酵母水解產(chǎn)物；及0.250mL /kg甲氨喋呤。
[0131]本發(fā)明包括用于表達抗-1L-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml /kg或122mg / kg檸檬酸鐵；2mL / kg或4mg / kg重組人胰島素；200g / I無水葡萄糖；0.292g/kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；8g / kg酵母水解產(chǎn)物；及0.250mL / kg甲
氨喋呤。
[0132]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；3.88mL / kg或7.76mg / L重組人胰島素；7.0g / I無水右旋糖；0.876g / L L-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；1.8g / L HEPES ；2.67g / L NaCl ；1.0g / LPluronic ；0.031g/LNaH2P04.H2O ；0.436g/L Na2HPO4.7Η20 ；4.0g / L 酵母粉(yeastolate)；
2.579g / L 植物蛋白胨；0.05mL / kg 甲氨喋呤；3.5mL / L2N NaOH ;及 2.91g / L2N HCl ；其產(chǎn)生7.10至7.20的終pH值及373至403m0smo / kg的終滲透壓。
[0133]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；13mg / L重組人胰島素；7.0g / I無水右旋糖；0.584g/L L-谷氨酰胺;1.6g / kg碳酸氫鈉；1.8g / LHEPES ；2.45g / L NaCl ; 1.0g / L Pluronic ；0.031g /L NaH2PO4.H2O ；0.436g / L Na2HPO4.7H20 ；10.7g / L 酵母粉；6.92g / L 植物蛋白腺；0.05mL / kg 甲氨喋呤；5.67mL / L2N NaOH ;及 2.5g / L2N HCl ;其產(chǎn)生 7.10 至 7.20 的終pH值和373至403m0smo / kg的終滲透壓。
[0134]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；4mg / kg重組人胰島素；1.5g / kg無水右旋糖；0.292g / kgL-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；2.0g / L酵母粉；及0.25mL / kg甲氨喋呤；其產(chǎn)生7.10至?.30的終pH值和300至340m`0smo / kg的終滲透壓。
[0135]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml /kg或122mg / kg檸檬酸鐵；13mg / kg重組人胰島素；7.0g / kg無水右旋糖；0.584g /kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg 碳酸氫鈉；1.8g / kg HEPES ；2.45g / kg NaCl ；1.0g / kgPluronic F-68 ；0.031g / kg NaH2PO4.H2O ；0.436g / kg Na2HPO4.7Η20 ；10.7g / L酵母粉；及 6.92g / kg 植物蛋白胨；5.67mL / kg NaOH ;及 2.5mL / kg HCl ;其產(chǎn)生 7.10 至 7.20的終pH值和373至403m0smo / kg的終滲透壓。
[0136]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；7.76mg / kg重組人胰島素；7.0g / I無水右旋糖；0.876g /kg L-谷氨酰胺；1.6g / kg 碳酸氫鈉；1.8g / kg HEPES ；2.67g / kg NaCl ；1.0g / kgPluronic F-68 ；0.031g / kg NaH2PO4.H2O ；0.436g / kg Na2HPO4.7H20 ；4.0g/L 酵母粉；及 2.579g / L 植物蛋白胨；0.05mL / L 甲氨喋呤；3.5mL / kg NaOH ;及 2.9ImL / kgHCl ；其產(chǎn)生7.10至7.20的終pH值和373至403m0smo / kg的終滲透壓。
[0137]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；13mg / kg重組人胰島素；7.0g / I無水右旋糖；0.584g / kgL-谷氨酰胺；1.6g / kg碳酸氫鈉；1.8g / kgHEPES ；2.45g / kg NaCl ；1.0g / kg PluronicF-68 ；0.031g / kgNaH2P04.H2O ；0.436g / kg Na2HPO4.7Η20 ；10.7g / L 酵母粉；及 6.92g/L 植物蛋白胨；0.05mL / L 甲氨喋呤；5.67mL / kg NaOH '及 2.5mL / kgHCl ;其產(chǎn)生 7.10至7.20的終pH值和373至403m0smo / kg的終滲透壓。
[0138]本發(fā)明包括用于表達抗IL-18抗體的CHO細胞的改良培養(yǎng)基，其包含:10ml / kg或122mg / kg檸檬酸鐵；13mg / kg重組人胰島素；7.0g / I無水右旋糖；0.584g / kgL-谷氨酰胺；1.6g / kg 碳酸氫鈉；1.8g / kgHEPES ；1.0g / kg Pluronic F-68 ；0.031g /kg NaH2PO4.H2O ；0.436g / kgNa2HP04.7H20 ；14.27g / L 酵母粉；9.23g / L 植物蛋白胨；0.05mL / L 甲氨喋呤；8.95mL / kg NaOH ;及 4.1mL / kg HCl ;其產(chǎn)生 7.10 至 7.20 的終pH值及373至403m0smo / kg的終滲透壓。
[0139]本發(fā)明也提供通過增加終滴度增加CHO細胞系生產(chǎn)IgGl抗體的生產(chǎn)率的方法，其包含:添加丁酸鈉；及添加N-乙酰半胱氨酸。在一個實施方案中，IgGl抗體為抗-1L-18。在一個實施方案中，通過終滴度的增加測量生產(chǎn)率的增加。在一個實施方案中，通過添加0.1mM至IOmM濃度的丁酸鈉達到終滴度的增加。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.1mM至8.0mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.1mM至3.0mM。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.1251111至2.01111。在一個實施方案中，丁酸鈉的濃度為0.125mM。在一個實施方案中，終滴度增加10-80%。在一個實施方案中，終滴度增加20-60%。在一個實施方案中，終滴度增加35-55%。在一個實施方案中，終滴度增加40%。在一個實施方案中，通過添加0.1mM至IOmM濃度的N-乙酰半胱氨酸達到改良的細胞培養(yǎng)物壽命。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)物壽命增加5-50 %。
[0140]本發(fā)明也提供通過增加終滴度增加CHO細胞系生產(chǎn)IgGl抗體的生產(chǎn)率的細胞培養(yǎng)基，其包含:SR-371 ;和丁酸鈉。在一個實施方案中，IgGl抗體為抗-1L-18。在一個實施方案中，通過增加10-80%的終抗-1L-18滴度測量生產(chǎn)率增加。在一個實施方案中，通過增加20-60%的終抗-1L-18滴度測量生產(chǎn)率增加。在一個實施方案中，通過增加35-55%的終抗-1L-18滴度測量生產(chǎn)率增加。在一個實施方案中，通過增加40%的最終抗-1L-18滴度測量生產(chǎn)率增加。在一個實施方案中，所添加的丁酸鈉濃度為0.125mM至8.0mM0在一個實施方案中，所添加丁酸鈉的濃度為0.2mM至3.0mM。在一個實施方案中，所添加丁酸鈉的濃度為0.3mM至2.0mM。在一個實施方案中，所添加丁酸鈉的濃度為0.125mM。在一個實施方案中，所添加N-乙酰半胱氨酸的濃度為OmM至10mM。在一個實施方案中，所添加N-乙酰半胱氨酸的濃度為5mM至10mM。在一個實施方案中，平均終滴度增加5-50%。在一個實施方案中，平均終滴度增加15-35%。在一個實施方案中，平均終滴度增加25-35%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0141]圖1圖解描述了作為接種活細胞密度的函數(shù)的ABT-874生長滴度。第15日的滴度結(jié)果與補料活細胞密度強烈相關(guān)。對以上數(shù)據(jù)的多項式擬合(polynominal fit)表明最佳補料密度約為每毫升3.5 X IO6個細胞。過程參數(shù)為pH=6.9 ；T=35°C ；D0=40%；4X培養(yǎng)基中的接種比率為1:5或1:4 ;在特定密度下以初始體積1%開始補料歷時10天。
【具體實施方式】
[0142]1.定義[0143]盡管本申請案中所使用的術(shù)語為本領(lǐng)域的標準術(shù)語，但本文中提供某些術(shù)語的定義以確保申請專利范圍含義的清晰性和確定性。
[0144]如本文所使用，術(shù)語"抗體"意指包含由四條多肽鏈組成的免疫球蛋白分子，其中兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈以雙硫鍵互聯(lián)。各重鏈由重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域組成，CH1、CH2和CH3。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成?？蓪H及VL區(qū)進一步細分為高變區(qū)(稱作互補決定區(qū)(CDR))，其與稱作骨架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域散布。各VH和VL由三個⑶R和四個FR組成，其按照以下次序自氨基端至羧基端排列:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4?？墒褂帽景l(fā)明方法及組合物生產(chǎn)的抗體實例包括腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(也稱作抗-TNFa抗體)、白介素(IL)-12抗體(也稱作抗-1L-12抗體)、白介素(IL)-18抗體(也稱作抗-1L18抗體)和EPO / R抗體(本文中一稱作抗-EPO / R抗體)?？墒褂帽景l(fā)明生產(chǎn)TNFa抗體更詳細地描述于美國專利第6090382號、第6258562號和第6509015號中，其各自以全文引用的方式并入本文中。 [0145]本發(fā)明也可用于生產(chǎn)抗體片段。如本文所用，術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"或“抗原結(jié)合片段”(或簡單地"抗體部分")指保留了與抗原Hf^nhTNFa)結(jié)合的能力和特異性的抗體的一個或多個片段。已顯示全長抗體片段可執(zhí)行抗體的抗原結(jié)合功能。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"涵蓋的結(jié)合片段的實例包括(1汗&13片段，由￥1^、￥!1、(^及011結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab' ) 2片段，包含在鉸鏈區(qū)由雙硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的 Fv 片段；(V) dAb 片段(Ward 等，(1989)Nature341:544-546)，其由 VH 或 VL 結(jié)構(gòu)域組成；(vi)分離的互補決定區(qū)(OTR);及(vii)雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD)抗體。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域(VL和VH)由分離基因編碼，但可使用重組方法通過合成接頭使它們接合，該合成接頭使其能夠成為單一蛋白鏈，其中VL與VH區(qū)配對以形成單價分子(稱作單鏈 Fv(scFv);參見，例如 Bird 等,(1988) Science242:423-426 ;及 Huston 等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 =5879-5883)。該等單鏈抗體也涵蓋于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中。也涵蓋其他形式的單鏈抗體，例如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL結(jié)構(gòu)域表達于單一多肽鏈上，但使用因過短而不允許兩個結(jié)構(gòu)域在同一個鏈上配對的接頭，藉此迫使該等結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參見例如 Holliger 等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ;Poljak 等，(1994)Structure2:1121-1123)。可通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗體部分的實例更詳細地描述于美國專利第6090382號、第6258562號、第6509015號，其各自以全文引用的方式并入本文。使用本發(fā)明方法及組合物生產(chǎn)的抗體片段或部分也包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0146]如本文所用，術(shù)語"重組人抗體"意欲包括通過重組方式制備、表達、生產(chǎn)或分離的所有人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染至宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體；自重組、組合人類抗體庫(下文進一步描述)分離的抗體；自轉(zhuǎn)移了人類免疫球蛋白基因的動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor等，(1992) Nucl.Acids Res.20:6287);或通過涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制備、表達、生產(chǎn)或分離的抗體。該等重組人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，體外誘變該等重組人類抗體(或當(dāng)使用轉(zhuǎn)移了人類Ig序列的動物時，體內(nèi)體細胞誘變)且因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列為盡管衍生自人類生殖系VH和VL序列且與其相關(guān)，但可能并非天然存在于體內(nèi)人類抗體生殖系譜系中的序列。
[0147]如本文所用，"經(jīng)分離抗體"意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如特異性結(jié)合至hTNFa的經(jīng)分離抗體基本上不含特異性結(jié)合除hTNF a以外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合hTNFa的經(jīng)分離抗體可與其他抗原(例如來自其他物種的TNFa分子)具有交叉反應(yīng)性。此外，經(jīng)分離抗體可基本上不含其他細胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。
[0148]術(shù)語"基礎(chǔ)培養(yǎng)基"指能夠支撐細胞生長的任何培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)標準無機鹽，例如鋅、鐵、鎂、鈣和鉀，以及痕量元素、維生素、能量來源、緩沖劑系統(tǒng)和必需氨基酸?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實例包括但不限于達氏經(jīng)修飾伊氏培養(yǎng)基(Dulbeccc/ s ModifiedEagle ' s Medium) (DMEM)、DME / F12、極限必需培養(yǎng)基(MEM)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基 Eagle (BME)、RPMI1640、F-10、F_12、α -極限必需培養(yǎng)基(a -MEM) ,Glasgow氏極限必需培養(yǎng)基(G-MEM)、PF CHO(SAFC Biosciences)和Iscove氏經(jīng)修飾杜氏培養(yǎng)基。
[0149]如本文所使用，術(shù)語"經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基"指排除、減低或增加至少一種標準成份、組份或養(yǎng)分(即本領(lǐng)域已知的經(jīng)典配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的至少一種成份、組份或養(yǎng)分)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。如"經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基"的上下文中所用的術(shù)語"經(jīng)修飾"也可指基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)個別組份之間比例的變化。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基排除至少一種以下組份:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸鈉(磷酸二氫鈉及/或磷酸氫二鈉)、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和葡萄糖，例如單糖葡萄糖。
[0150]如本文所使用，術(shù)語"細胞培養(yǎng)基"、"培養(yǎng)基"和"培養(yǎng)基配方"指使細胞在多細胞生物體或組織外部的人造體外環(huán)境中維持、生長、繁殖或擴增的營養(yǎng)溶液。可優(yōu)化細胞培養(yǎng)基以用于特定細胞培養(yǎng)用途，該細胞培養(yǎng)基包括，例如，經(jīng)配制以促進細胞生長的細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基或經(jīng)配制以促進重組蛋白生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基。術(shù)語養(yǎng)分、成份和組份可于本文中互換使用，指構(gòu)成細胞培養(yǎng)基的組成成分。
[0151]如本文所使用，術(shù)語"細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基"或"生產(chǎn)培養(yǎng)基"指經(jīng)設(shè)計用于細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)期的細胞培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實施方案中，生產(chǎn)培養(yǎng)基經(jīng)設(shè)計用于生產(chǎn)期中的重組蛋白表達。本文(包括實施例部分的表2-7)提供生產(chǎn)培養(yǎng)基的實例。
[0152]如本文所使用，術(shù)語"分批補料細胞培養(yǎng)"和"分批補料培養(yǎng)"指起初向培養(yǎng)容器中供應(yīng)細胞(優(yōu)選哺乳動物動物)和培養(yǎng)基并在培養(yǎng)期間連續(xù)或以離散增量向培養(yǎng)物中補入附加培養(yǎng)養(yǎng)分，在培養(yǎng)終止前具有或不具有周期細胞和/或產(chǎn)物收集的細胞培養(yǎng)。
[0153]"分批補料方法"指向分批補料細胞培養(yǎng)物中供應(yīng)附加養(yǎng)分的方法。舉例而言，分批補料方法可包含根據(jù)預(yù)定補料程序在給定時段內(nèi)添加補充培養(yǎng)基。
[0154]如本文所使用，術(shù)語"補料"指接種后向培養(yǎng)物中進行的任何物質(zhì)的任何添加。補料可為一或多次添加。
[0155]如本文所使用，術(shù)語"補料溶液"、"補料培養(yǎng)基"和"補入培養(yǎng)基"指含有在接種后某時起始向培養(yǎng)物中添加的一種或多種養(yǎng)分的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，補料溶液為包含下列各物質(zhì)的組合補料:基礎(chǔ)培養(yǎng)基和至少一種水解產(chǎn)物，例如大豆源水解產(chǎn)物、酵母源水解產(chǎn)物或兩種類型水解產(chǎn)物的組合。在本發(fā)明的另一個實施方案中，補料溶液可僅包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或可僅包括水解產(chǎn)物或濃縮水解產(chǎn)物。[0156]如本文所使用，術(shù)語"反饋控制系統(tǒng)"指監(jiān)控給定參數(shù)的方法，藉此添加附加試劑或進行細胞培養(yǎng)物的環(huán)境修飾以滿足所需參數(shù)設(shè)定點。在一個實施方案中，所給定參數(shù)為哺乳動物細胞培養(yǎng)物的葡萄糖含量，藉此使用葡萄糖含量來確定應(yīng)于何時將補料溶液(例如組合補料溶液)添加至細胞培養(yǎng)物中?？墒褂梅答伩刂葡到y(tǒng)維持使哺乳動物細胞培養(yǎng)物中蛋白生產(chǎn)最佳化所需要的營養(yǎng)組份。
[0157]如本文所使用，術(shù)語"補料曲線"指以補料溶液(例如組合補料溶液)補充哺乳動物細胞培養(yǎng)物的時間表。優(yōu)選使用反饋控制系統(tǒng)產(chǎn)生補料曲線。
[0158]可使用"基因工程"方法(例如用重組病毒進行病毒感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或電穿孔)使細胞經(jīng)"基因工程設(shè)計"以在將允許表達多肽的重組核酸序列導(dǎo)入細胞時表達特定多妝或蛋白。參見，例如 Kaufman 等，(1990), Meth.Enzymol.185:487-511 ；CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel 等編輯(Wiley&Sons, New York, 1988,且每季更新)。用于表達相關(guān)蛋白的基因工程細胞和/或細胞系的方法和載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知?；蚬こ碳夹g(shù)包括但不限于表達載體、靶向同源重組和基因活化(參見，例如Chappel，美國專利第5272071號)以及通過基因工程轉(zhuǎn)錄因子進行的轉(zhuǎn)錄活化(參見，例如 Segal 等，1999，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96 (6) =2758-63)。多肽任選在異源控制元件(例如天然狀態(tài)不引導(dǎo)該多肽生產(chǎn)的啟動子)控制下表達。舉例而言，啟動子可為引導(dǎo)哺乳動物多肽表達的強病毒啟動子(例如CMV，SV40)。宿主細胞可或不可正常生產(chǎn)該多肽。舉例而言，宿主細胞可為經(jīng)基因工程設(shè)計以生產(chǎn)人類多肽的CHO細胞，意指已將編碼人類多肽的核酸導(dǎo)入CHO細胞中。
[0159]或者，宿主細胞可為經(jīng)基因工程設(shè)計以生產(chǎn)水平增加的通常僅以極低含量存在的人類多肽(例如通過用強病毒啟動子替代內(nèi)源性啟動子)的人類細胞。
[0160]如本文所使用 ，"生長期"指經(jīng)培養(yǎng)細胞快速分裂并且數(shù)量增加的時段。在生長期中，一般可在培養(yǎng)基中和經(jīng)設(shè)計以使細胞增殖最大化的條件下培養(yǎng)細胞。
[0161]術(shù)語"水解產(chǎn)物"包括任何酶消化物，尤其是通過用至少一種能夠使物質(zhì)組份分解為簡單形式(例如分解為包含單糖或雙糖和/或單肽、二肽或三肽的制劑)的酶處理待萃取物質(zhì)(例如植物組份或酵母細胞)而制備的特定類型的萃取物。"水解產(chǎn)物"可進一步被酶消化，例如木瓜酶，和/或由自體分解、熱解和/或胞漿溶解形成。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，水解產(chǎn)物并非由動物來源制備，即非動物源。優(yōu)選的非動物源水解產(chǎn)物實例包括植物源水解產(chǎn)物，例如大豆源水解產(chǎn)物，及既非衍生自植物也非衍生自動物來源的水解產(chǎn)物，例如酵母源水解產(chǎn)物。
[0162]術(shù)語"水解產(chǎn)物富集溶液"和"水解產(chǎn)物富集培養(yǎng)基"指含有水解產(chǎn)物或水解產(chǎn)物組合(即自不同來源萃取的水解產(chǎn)物)作為添加至細胞培養(yǎng)物中的主要成份的培養(yǎng)基。例如，可將水解產(chǎn)物富集溶液添加至細胞培養(yǎng)物中以增強蛋白生產(chǎn)。類似地，術(shù)語"基礎(chǔ)富集溶液"和"基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基"指含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基(或基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合)作為主要成份的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，將水解產(chǎn)物富集溶液或基礎(chǔ)富集溶液或兩種富集溶液的組合添加至細胞培養(yǎng)物中以增加細胞培養(yǎng)物在蛋白生產(chǎn)中的生產(chǎn)率。
[0163]如果在含有附加試劑或改變的蛋白生產(chǎn)工藝參數(shù)的培養(yǎng)物中生產(chǎn)的多肽量超過在不含有附加試劑或改變的蛋白生產(chǎn)工藝參數(shù)的相同培養(yǎng)物中生產(chǎn)的多肽量，則通過添加附加試劑或改變蛋白生產(chǎn)工藝的參數(shù)"增加"了蛋白生產(chǎn)。改變蛋白生產(chǎn)工藝的實例包括但不限于添加培養(yǎng)基添加劑，增加補充培養(yǎng)基的量，變化培養(yǎng)溫度及細胞培養(yǎng)的氧濃度。可使用補充溶液(例如補料溶液)向細胞培養(yǎng)物提供附加試劑。
[0164]術(shù)語"成份"指任何可用于細胞培養(yǎng)基中以維持或促進細胞增殖增長的化合物(無論其為化學(xué)來源或生物來源)。術(shù)語"組份"、"養(yǎng)分"及"成份"可交替使用且均意指該類化合物。用于細胞培養(yǎng)基的典型成份包括氨基酸、鹽、金屬、糖、脂質(zhì)、核酸、激素、維生素、脂肪酸、蛋白及其類似物。促進或維持細胞離體培養(yǎng)的其他成份可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明范疇內(nèi)根據(jù)特定需要加以選擇。
[0165]如本文所使用，術(shù)語"接種"指向培養(yǎng)基中添加細胞以起始培養(yǎng)。
[0166]"生產(chǎn)期"指細胞生產(chǎn)最大量的重組多肽或蛋白的時段。生產(chǎn)期的特征在于細胞分裂少于生長期中的細胞分裂，且也包括使用經(jīng)設(shè)計以使多肽生產(chǎn)最大化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
[0167]"重組多肽"或"重組蛋白"為由基因工程方法生產(chǎn)的多肽或蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，通過在細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)表達該類蛋白的細胞獲得重組蛋白。
[0168]"過渡期"意指"生長期"與"生產(chǎn)期"之間的細胞培養(yǎng)時段。在過渡期中，可將培養(yǎng)基和環(huán)境條件由經(jīng)設(shè)計以使增殖最大化的培養(yǎng)基和條件轉(zhuǎn)變?yōu)榻?jīng)設(shè)計以使多肽生產(chǎn)最大化的培養(yǎng)基和條件。
[0169]本發(fā)明提供通過哺乳動物(例如中國倉鼠卵巢(CHO))細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)蛋白(優(yōu)選重組蛋白，例如抗體)的新穎組合物和方法。本文所述的細胞培養(yǎng)基及方法已用于重組蛋白生產(chǎn)，尤其是重組(完全人類、人源化或嵌合)單克隆抗體的生產(chǎn)。培養(yǎng)基和方法已經(jīng)多種抗體產(chǎn)品修飾以并入可增加哺乳動物(例如CH0)細胞的生長和生產(chǎn)率的各種改良和進步。下文詳細提供本發(fā)明的改良組合物和方法的各方面。
`[0170]I1.所關(guān)注蛋白
[0171]一般而言，本發(fā)明方法和組合物適用于生產(chǎn)重組蛋白。重組蛋白為通過基因工程方法生產(chǎn)的蛋白。根據(jù)本發(fā)明方法和組合物生產(chǎn)的尤其優(yōu)選蛋白為以蛋白為主的治療劑，也稱作生物制品。優(yōu)選地，該蛋白作為細胞外產(chǎn)物分泌。
[0172]可使用本發(fā)明方法和組合物生產(chǎn)的蛋白包括但不限于抗體或其片段?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的許多技術(shù)來操做編碼免疫球蛋白分子的DNA以產(chǎn)生能夠編碼重組蛋白(例如單鏈抗體、親和力增強的抗體或其他以抗體為主的多肽)的DNA(參見，例如Larrick等，1989, Biotechnology?:934-938 ；Reichmann 等，1988, Nature332:323-327 ；Roberts 等，1987, Nature328:731-734 ；Verhoeyen 等，1988, Science239: 1534-1536 ；Chaudhary 等，1989，Nature339:394-397,均以參考形式并于本文)。生產(chǎn)完全人類抗體(例如使用轉(zhuǎn)殖基因動物制備，且任選在活體外進一步修飾者)以及人源化抗體的重組細胞也可用于本發(fā)明。術(shù)語人源化抗體也涵蓋單鏈抗體。參見，例如Cabilly等，美國專利第4816567號；Cabilly等，歐洲專利第0125023 BI號；Boss等，美國專利第4816397號；Boss等，歐洲專利第 0120694 BI 號；Neuberger, M.S.等，W086 / 01533 ；Neuberger, M.S.等，歐洲專利第0194276 BI 號；Winter，美國專利第 5225539 號；Winter，歐洲專利第 0239400B1 號；Queen等，歐洲專利第0451216B1號；及Padlan，E.A.等，EP O 519 596 Al，均以參考形式并于本文。舉例而言，本發(fā)明可用于生產(chǎn)免疫特異性辨識特異細胞靶標的人類和/或人源化抗體，該類特異細胞IE標例如任一上述蛋白、人類EGF受體、her-2 / neu抗原、CEA抗原、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、⑶5、⑶I la、⑶18、NGF、⑶20、⑶45、⑶52、Ep-cam、其他癌細胞表面分子、TNFa、TGF-bl、VEGF、其他細胞因子、α4β7整合素(integrin)、IgE、病毒蛋白(例如巨細胞病毒)。可使用本發(fā)明組合物和方法生產(chǎn)的抗體的實例包括但不限于抗-TNF α抗體、抗-1L-12抗體、抗-1L-18抗體和抗-EPO受體(EPO-R)抗體。在一個實施方案中，抗-TNF α抗體為完全人類抗-TNF α抗體，例如阿達木單抗/ D2E7(參見美國專利第6090382號,其以參考的方式并于本文；Humira?; Abbott Laboratories)。在一個實施方案中，抗-1L-12抗體為完全人類抗-1L-12抗體,例如ABT-874(Abbott Laboratories ；參見美國專利第6914128號，其以參考方式并于本文)。在一個實施方案中，抗-1L-18抗體為完全人類-1L-18抗體(例如ABT-325)，例如也可參見US20050147610A1中描述的抗體。在一個實施方案中，抗-EPO / R(亦稱作ABT-007)抗體為完全人類抗體，如以引用的方式并入本文的美國專利公開案第US20060018902A1號中所描述者。
[0173]可使用本發(fā)明方法和組合物生產(chǎn)的蛋白類型的另一實例包括融合蛋白。融合蛋白為融合至異源蛋白或肽的蛋白或結(jié)構(gòu)域或蛋白(例如可溶性胞外結(jié)構(gòu)域)。該類融合蛋白的實例包括以含有免疫球蛋白分子部分的融合物表達的蛋白；以含有拉鏈部分的融合蛋白表達的蛋白；及新穎多功能蛋白，例如細胞因子和生長因子融合蛋白(即GM-CSF及IL-3、MGF及IL-3)。W093 / 08207及W096 / 40918描述了被稱作CD40L的分子各種可溶性寡聚物形式的制備，分別包括免疫球蛋白融合蛋白和拉鏈融合蛋白；其中所論述的技術(shù)可應(yīng)用于其他蛋白。另一種融合蛋白為重組TNFR:Fc,也稱作依那西普(entanercept)。依那西普(或Enbrel?; Amgen / Wyeth)為p75TNF α受體胞外部分的兩個分子的二聚體，各分子由融合至人類IgGl的232氨基酸Fe部分的235氨基酸TNFR衍生的多肽組成。實際上，任何分子均可表現(xiàn)為融合蛋白，包括但不限于細胞受體分子的胞外結(jié)構(gòu)域、酶、激素、細胞激素、免疫球蛋白分子部分、拉鏈結(jié)構(gòu)域和表位。
[0174]II1.本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基
[0175]本發(fā)明提供用于生產(chǎn)或表達重組蛋白(例如抗體)的哺乳動物細胞培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基。本文所述各種細胞培養(yǎng)基可獨立或共同地用于改良細胞培養(yǎng)，包括增加蛋白生產(chǎn)和延長細胞壽命。
`[0176]在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基為無血清的，意指培養(yǎng)基不含血清(例如胎牛血清(FBS)、馬血清、山羊血清或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它衍生自動物的血清)。
[0177]在第一方面，本發(fā)明提供包括全部或部分經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基的哺乳動物細胞培養(yǎng)基。經(jīng)修飾基本細胞培養(yǎng)基可衍生自本領(lǐng)域已知的標準基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)幕A(chǔ)培養(yǎng)基包括但不限于杜氏經(jīng)修飾伊氏培養(yǎng)基(DMEM)、DME / F12、極限必需培養(yǎng)基(MEM)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基 Eagle(BME)、RPMI1640, F-10、F-12、α -極限必需培養(yǎng)基(α -ΜΕΜ)、Glasgow氏極限必需培養(yǎng)基(G-MEM)、PF CHO及Iscove氏經(jīng)修飾杜氏培養(yǎng)基?？捎糜诒景l(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的其他實例包括BME基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco-1nvitrogen ;也可參見Eagle, H(1965)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.89, 36);杜氏經(jīng)修飾 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM，粉末)(Gibco-1nvitrogen (#31600);也可參見 Dulbecco and Freeman (1959) Virology8, 396 ；Smith 等(1960)Virologyl2,185.Tissue Culture Standards Commitee, In Vitro6:2,93) ;CMRL1066 培養(yǎng)基(Gibco-1nvitrogen (#11530);也可參見 Parker R.C.等(1957)Special Publications, N.Y.Academy of Sciences,5,303)。
[0178]可修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基以移除存在于標準基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的特定非營養(yǎng)組份，例如各種無機和有機緩沖劑、表面活性劑和氯化鈉。如本文所述，從基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基移除該類組份可使剩余營養(yǎng)組份的濃度增加并改良總細胞生長和蛋白表達。此外，根據(jù)細胞培養(yǎng)條件的要求可將省略的組份添加回含有經(jīng)修飾基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)基中。如下所述，已發(fā)現(xiàn)從基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基分離特定成份(即添加經(jīng)修飾基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基作為細胞培養(yǎng)基中的成份)，且隨后將成份添加回細胞培養(yǎng)基中作為分離成份會提供對細胞培養(yǎng)物生長和蛋白生產(chǎn)有利的特性。
[0179]本發(fā)明的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基排除任何(或所有)以下成份:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖。這些成份常見于市售基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基中。
[0180]可通過市售培養(yǎng)基服務(wù)(例如SAFC Pharma?)完成組份(例如碳酸氫鈉、緩沖齊?、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和/或單糖葡萄糖)的排除。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解在一個實施方案中可使用市售細胞培養(yǎng)基服務(wù)(即定制培養(yǎng)基服務(wù))獲得經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基。定制培養(yǎng)基服務(wù)的實例可由以下公司提供:例如，SAFC(原JRHBioscience) >Invitrogen-- Atlanta Biologicals?及 Lonza。
[0181]或者，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)制造基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基的標準方法制備本發(fā)明經(jīng)修飾基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基，其中省略了本文所述的特定成份(參見例如Freshney (2005)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique ；BD Bionutrients TechnicalManual, (2006),第三版；Jenkins 編輯(1999), Animal Cell Biotechnology, Methods andProtocols, Humana Press ；Doyle and Griffiths 編輯，(1997)Essential Techniques:Mammalian Cell Culture, John Wiley and Sons ；Butler 編輯(1991)MammalianCell Biotechnology:A Practical ApproachOxford University Press ；Darling 及Morgan (1994) Animal Cells:Culture and Media, John Wiley and Sons ;Freshney 編輯(1992), Animal Cell Culture:A Practical Approach (第 2 版)，Oxford UniversityPress ；Pollard 及 Walker(1997), Basic Cell Culture Protocols (第 2 版)，HumanaPress, (Part of the Methods in Molecular Biology series,第 75 卷)，其各以參考形式并于本文)。
[0182]在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基含有經(jīng)修飾的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基；鐵來源(優(yōu)選為無機的，例如檸檬酸鐵)；重組生長因子；緩沖劑；表面活性劑；滲透壓調(diào)節(jié)劑；能量來源；及至少兩種不同的非動物水解產(chǎn)物。此外，經(jīng)修飾的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基任選可含有氨基酸、維生素或氨基酸與維生素的組合。
[0183]如本文所使用，術(shù)語"鐵"意指用以補充培養(yǎng)基的衍生自非動物的鐵來源。細胞培養(yǎng)基中的鐵來源優(yōu)選為無機的。鐵來源優(yōu)選為無機的且包括(例如)鐵鹽和亞鐵鹽，例如檸檬酸鐵或硫酸亞鐵。優(yōu)選螯合鹽，例如檸檬酸鐵和檸檬酸鐵銨。然而，也可使用并非自動物來源分離的其他鐵來源，例如提供等量鐵的化學(xué)鐵螯合劑或重組蛋白鐵載劑?？墒褂玫蔫F螯合化合物包括但不限于鐵螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(β-胺基乙醚)-Ν，Ν，Ν'，Ν'-四乙酸(EGTA)、甲磺酸去鐵胺、二巰基丙醇、二乙撐三胺五乙酸(DPTA)和反-1，2-二胺基環(huán)己烷-Ν，Ν，Ν'，Ν'-四乙酸(⑶TA)以及檸檬酸鐵螯合劑和硫酸亞鐵螯合劑。尤其優(yōu)選的鐵來源為檸檬酸鐵，其優(yōu)選以0.1-1mM濃度存在于終體積細胞培養(yǎng)基中。在另一個實施方案中，檸檬酸鐵的濃度為100-150mg / L，例如122mg / L。上述mM(例如 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8、0.9 和 1.0)和 mg / L (例如 100、110、120、130、140和150)的中間數(shù)也可為本發(fā)明的一部分。
[0184]可包括于細胞培養(yǎng)基中的生長因子的非限制性實例為胰島素或其重組類似物、IGF-1及胰島素與IGF-1的組合。尤其優(yōu)選的重組生長因子為胰島素或其重組類似物，其優(yōu)選以約4mg / L至13mg / L的濃度存在于終體積細胞培養(yǎng)基中。上述胰島素濃度的中間數(shù)也可為本發(fā)明的一部分，例如 4,4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5,12,12.5 和 13。
[0185]細胞培養(yǎng)基也可包括緩沖劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，緩沖劑自經(jīng)修飾的基本細胞培養(yǎng)基中排除而作為分離組份添加至細胞培養(yǎng)基中(也向其中添加經(jīng)修飾的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基)。用于細胞培養(yǎng)基中的緩沖劑為本領(lǐng)域已知。細胞培養(yǎng)基中可包括的緩沖劑的非限制性實例為磷酸鹽緩沖劑、HEPES和碳酸氫鈉。在一個實施方案中，碳酸氫鈉作為緩沖劑添加至細胞培養(yǎng)基中，終濃度約0.l-3g / L。在一個實施方案中，碳酸氫鈉作為緩沖劑添加至細胞培養(yǎng)基中，終濃度約1.6g / L0在一個實施方案中，HEPES作為緩沖劑添加至細胞培養(yǎng)基中，終濃度0.l-3g / L0在另一個實施方案中，HEPES作為緩沖劑添加至細胞培養(yǎng)基中，終濃度1.8g / L0在一個實施方案中，將磷酸鹽緩沖劑(例如磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉)添加至細胞培養(yǎng)基中，其終濃度介于0.01與0.5g / L之間。上述濃度的中間數(shù)也為本發(fā)明的一部分，例如碳酸氫鈉或HEPES的濃度為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、
1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、2.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、
2.9 和 3.0 或磷酸鹽緩沖 劑的濃度為 0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.36、0.38、0.4、0.42、
0.44,0.46,0.48 和 0.5g / L。
[0186]包括緩沖劑以幫助將細胞培養(yǎng)基維持在期望的pH。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的pH在6.0至8.0、6.5至7.5、及7.1至7.2之范圍內(nèi)。這些pH值中間數(shù)(例如6.1、6.2、6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9 及 8.0)以
及本文所述的所有其他數(shù)值也為本發(fā)明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的范圍也包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0187]細胞培養(yǎng)基也可包括滲透壓調(diào)節(jié)劑，例如NaCl。在一個實施方案中，將NaCl添加至細胞培養(yǎng)基中，終濃度在約1.0至6.5g / L之間。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的滲透壓在260至450m0smo / kg的范圍內(nèi)。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基的滲透壓在320至45OmOsmo / kg的范圍內(nèi)。所述NaCl濃度和mOsmo / kg值的中間數(shù)(例如1、1.5、2、2.5、3、
3.5、4、4.5、5、5.5、6 和 6.5 的 NaCl 濃度和 260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450 的 mOsmo / kg 范圍)以及本文所述所有其他數(shù)值也為本發(fā)明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的范圍也包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0188]本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基中也可添加能量來源。優(yōu)選地，能量來源為單糖?？捎糜诩毎囵B(yǎng)基中的單糖實例包括葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一個實施方案中，將葡萄糖添加至細胞培養(yǎng)基中，最終濃度約3.5-7.0g / L0在一個實施方案中，將葡萄糖添加至細胞培養(yǎng)基中，終濃度不大于7.0g / L0在一個實施方案中，將葡萄糖添加至細胞培養(yǎng)基中，終濃度約7.0g / L0上述葡萄糖濃度的中間數(shù)(例如3.5、3.6、3.7,3.8,3.9,4.0,4.2,4.4,4.6,4.8,5.2,5.8、6、6.2,6.4,6.6,6.8 和 7)以及本文所述所有其他數(shù)值也為本發(fā)明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的范圍也包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0189]本發(fā)明細胞培養(yǎng)基的一個重要成份為添加的水解產(chǎn)物。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基可包括源自單一來源(例如酵母或大豆)的水解產(chǎn)物，或可包括水解產(chǎn)物的組合(例如酵母與和豆源水解產(chǎn)物)。優(yōu)選地，用于本發(fā)明細胞培養(yǎng)基的水解產(chǎn)物為非動物源的。非動物源水解產(chǎn)物的實例包括植物源水解產(chǎn)物和非植物源水解產(chǎn)物，例如酵母源水解產(chǎn)物、Tryprone、酪蛋白水解產(chǎn)物、酵母萃取物、或經(jīng)木瓜酶消化的大豆蛋白胨。用于本發(fā)明培養(yǎng)基的水解產(chǎn)物可商業(yè)購買，包括例如來自例如Quest International, Norwich, N.Y.,OrganoTechnie, S.A.France, Deutsche Hefewerke GmbH, Germany,或DMV Intl.Delhi,N.Y.來源的 HyP印 1510.RTM.、Hy-Soy.RTM.、Hy_Yeast412.RTM.和 Hi_Yeast444.RTM.。酵母萃取物和大豆水解產(chǎn)物的來源公開于W098 / 15614、W000 / 03000、W001 / 23527和美國專利第5741705號中。也可用于本發(fā)明的酵母源水解產(chǎn)物的實例包括TC酵母粉(BDDiagnostic)和酵母粉UF(SAFC Biosciences)，而植物源水解產(chǎn)物的實例包括大豆水解產(chǎn)物 UF(SAFC Biosciences)和大豆水解產(chǎn)物(HyClone Media)。
[0190]在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基進一步包括谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的適當(dāng)來源可為各種商業(yè)來源，例如Gibco (目錄號25030-081)。
[0191]本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基(包括下文實例部分描述的細胞培養(yǎng)基)可任選包括甲氨喋呤。在用于培養(yǎng)CHO細胞的細胞培養(yǎng)基中，甲氨喋呤用量的實例包括約IOOnM至5000nM甲氨喋呤。上述甲氨喋呤摩爾濃度的中間數(shù)(例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800和500nM)以及其他中間數(shù)也為本發(fā)明的一部分。使用任何上述值的組合作為上限和/或下限值的范圍也包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0192]在大規(guī)模生物反應(yīng)器中，CHO細胞特別易受容器內(nèi)氣體噴射和葉輪混合所產(chǎn)生的剪切力的影響。因此，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基也可任選包括細胞保護劑。如本文所使用，術(shù)語"細胞保護劑"意指保護真核細胞免受損害的物質(zhì)。例如，該損害可由剪切力或生物反應(yīng)容器中的氣泡噴射效應(yīng)引起。為使細胞損害的發(fā)生降至最低，培養(yǎng)基最好含有細胞保護劑，例如甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙烯醇或pluronic多元醇。其中，優(yōu)選Pluronic.RTM.(多元醇，BASF Wyandotte Corp.)多元醇F68，因為其不像聚乙烯醇，其為無毒物質(zhì)且不像聚乙二醇，其并不干擾下游純化。
[0193]本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基也可包括非鐵金屬離子。非鐵金屬離子的實例包括但不限于氯化物和硫酸鹽、鉀、鎂、銅、硒、鋅、鎳、錳、錫、鎘、鑰酸鹽、釩酸鹽和硅酸鹽。
[0194]本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基也可包括維生素和酶輔因子。該類維生素和酶輔因子的實例包括但不限于PABA(對氨基苯甲酸)、維生素K(生物素)、維生素B5(D-泛酸鈣)、葉酸、內(nèi)消旋肌醇、煙酰胺(菸酸酰胺)、維生素B6(鹽酸吡多辛(PyrdoxineHCl))(及鹽酸吡哆醛(Pyrodoxal HCl))、維生素B2 (核黃素)、維生素BI (硫胺素)和維生素B12(氰鈷胺素(cyanocobalamin))?；蛘?可向培養(yǎng)基中添加維生素C (L-抗壞血酸)。也可添加氯化膽堿，通常認為其為維生素但也可作為脂質(zhì)因子。
[0195]此外，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基也可包括脂質(zhì)樣因子。脂質(zhì)因子的實例包括氯化膽堿和磷脂酰膽堿。也可包括脂質(zhì)生產(chǎn)助劑，例如醇胺(例如乙醇胺)。
[0196]在本發(fā)明的方法和組合物中，優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。應(yīng)用于培養(yǎng)基的術(shù)語"無血清"包括不含有血清(例如胎牛血清)的任何哺乳動物細胞培養(yǎng)基。
[0197]本發(fā)明范疇內(nèi)也包括本文所述的任何改良細胞培養(yǎng)基中的哺乳動物細胞，例如CHO細胞。
[0198]在本發(fā)明的一方面提供為生產(chǎn)特定抗體而優(yōu)化的細胞培養(yǎng)基配方。優(yōu)選配方的實例包括用于表達下列抗體的CHO細胞生長或蛋白生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)基:抗-TNFa抗體、抗-1L-12抗體、抗-1L-18抗體和抗-EPO受體(EPO-R)抗體。
[0199]本發(fā)明中包括表達抗-TNF α抗體(包括完全人類抗-TNF α抗體)的哺乳動物細胞(例如CHO細胞)的細胞培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實施方案中，完全人類抗-TNF α抗體為阿達木單抗(也稱作D2E7及Humira?: Abbott Laboratories)。阿達木單抗(包括核酸和氨基酸序列)的特征描述于美國專利第6090382中，其以參考形式并于本文?？赏ㄟ^在細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼蛋白(例如阿達木單抗)的核酸的哺乳動物細胞(例如CHO細胞)，將細胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中且將蛋白從細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離生產(chǎn)阿達木單抗。
[0200]在一個實施方案中，本發(fā)明提供為包含編碼阿達木單抗的核酸的CHO細胞而優(yōu)化的細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基。為表達阿達木單抗的CHO細胞而優(yōu)化的無血清細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基的配方包括:基礎(chǔ)培養(yǎng)基；檸檬酸鐵(例如約8-12ml / kg，約10.0ml / kg或122mg /L);重組人胰島素(例如約2-6mg / kg,約4.0mg / kg);無水葡萄糖(例如約2_5mg /kg,約3.5g/kg) ;L-谷氨酰胺(例如約0.29g / kg);碳酸氫鈉(例如約1.6g / kg)；NaH2PO4.H2O (例如約 0.03 g/kg) ；Na2HP04.7H20(例如約 0.43 至 0.44g / kg);及酵母源水解產(chǎn)物(例如約2.0g / kg)。為表達阿達木單抗的CHO細胞而優(yōu)化的無血清細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基的另一實例包括以下成份:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10.0ml / kg 或 122.45mg / kg);重組人胰島素(例如約 3.8 至 3.9mL / kg 或 7.8mg /kg);無水葡萄糖(例如約7.0g/kg) ;L-谷氨酰胺(例如約0.8至0.9g / kg);碳酸氫鈉(例如約 1.6g / kg) ;HEPES (例如約 1.8g / kg) ;NaCl (例如約 2.6 至 2.7g / kg) ；PluronicF-68(例如約 1.0g / kg) ；NaH2PO4.H2O(例如約 0.03 至 0.04g / kg) ；Na2HPO4.7H20(例如約0.43至0.44g / kg) ;L-天冬酰胺一水合物(例如約0.45g / kg);酵母源水解產(chǎn)物(例如約4.0g/kg);及植物源水解產(chǎn)物(例如約2.6g / kg)。表達阿達木單抗的細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基可進一步包括甲氨喋呤，例如約2.50mL / kg。
[0201]在一個實施方案中，本發(fā)明提供為表達抗體(包括，例如，人類抗-TNFa抗體(例如阿達木單抗)或紅細胞生成素受體(ΕΡ0 / R)抗體)的CHO細胞而優(yōu)化的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基?？?EP0/R抗體的實例描述于美國專利公開案第20040071694號中，其以參考形式并于本文。為表達抗體(例如阿達木單抗或抗-EPO / R抗體)的CHO細胞而優(yōu)化的無血清細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基配方包括:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約10.0ml / kg或122.45mg / L);重組人胰島素(例如約6.0mL / kg或12mg / kg);無水葡萄糖(例如約7.0g / kg) ;L-谷氨酰胺(例如約0.58至0.59g/kg);碳酸氫鈉(例如約 1.6g / kg) ;HEPES (例如約 1.8g / kg) ;NaCl (例如約 2.4 至 2.5g / kg) ；PluronicF-68 (例如約 1.0g / kg) ；NaH2PO4.H2O (例如約 0.03 至 0.04g / kg) ；Na2HPO4.7Η20(例如約0.43至0.44g / kg);酵母源水解產(chǎn)物(例如約10.7g / kg);及植物源水解產(chǎn)物(例如約6.9至7.0g/kg)。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基具有介于約7.1至7.2范圍內(nèi)的pH值及介于373至403m0Sm / kg范圍內(nèi)的滲透壓。
[0202]本發(fā)明的另一方面涉及使由CHO細胞生產(chǎn)的抗-白介素-12(IL_12)抗體(例如完全人類IL-12抗體)的生產(chǎn)最優(yōu)化的細胞培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實施方案中，完全人類抗-1L12抗體為ABT-874。ABT-874(包括核酸和氨基酸序列)的特點描述于美國專利第6914128號中，其以參考文獻的形式并于本文。
[0203]在一個實施方案中，為表達ABT-874的CHO細胞生長而優(yōu)化的無血清細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基包括下列各物質(zhì):排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約IOml / kg或122.45mg / L);重組人胰島素(例如約3.8至3.9mL / kg或7.8mg / kg);無水葡萄糖(例如約7.0g / kg) ;L-谷氨酰胺(例如約0.87至0.88g / kg) ;L_天冬酰胺一水合物(例如約0.45g / kg);碳酸氫鈉(例如約1.6g / kg) ;HEPES (例如約1.8g/kg) ;NaCl (例如約 2.67 至 2.68g / kg);約 Pluronic F-68 (例如 1.0g / kg) ；NaH2PO4.Η20 (例如約 0.03至0.04g / kg) ；Na2HPO4.7H20(例如約0.43至0.44g / kg);酵母源水解產(chǎn)物(例如約
4.0g / kg);及植物源水解產(chǎn)物(例如約2.6g/kg)。
[0204]在一個實施方案中，用于表達ABT-874的無血清細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包括下列各物:維生素含量降低且排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)`劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約IOml / kg或122.45mg / L);重組人胰島素(例如約6.5mL / kg或13mg / kg);無水葡萄糖(例如約7.0g / kg) ；L-谷氨酰胺(例如約0.58至0.59g/kg);碳酸氫鈉(例如約1.6g / kg)；HEPES (例如約 1.8g/kg) ;NaCl (例如約 2.45g / kg) ；Pluronic F_68(例如約 1.0g / kg)；NaH2PO4.H2O (例如約 0.03 至 0.04g/kg) ；Na2HPO4.7H20(例如約 0.43 至 0.44g / kg);酵母源水解產(chǎn)物(例如約10.7g / kg);及植物源水解產(chǎn)物(例如約6.9至7.0g / kg)。
[0205]在一個實施方案中，本發(fā)明提供表達抗體(例如抗-1L12及抗-EPO / R抗體)的CHO細胞的無血清細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基，其包含下列各物質(zhì):基礎(chǔ)培養(yǎng)基；檸檬酸鐵(例如約IOml / kg或122.45mg / L);重組人胰島素(例如約4mg / kg);無水葡萄糖(例如約
1.5g/kg) ；L-谷氨酰胺(例如約0.29至0.30g / kg);碳酸氫鈉(例如約1.6g/kg);及酵母源水解產(chǎn)物(例如至少約2g / kg)。在一個實施方案中，表達抗體(例如抗-1L-12及抗-EP0/R抗體)的CHO細胞的細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基具有約7.10至7.30的pH值及約300至340m0smo / kg的滲透壓。細胞培養(yǎng)基也可含有酵母源水解產(chǎn)物(例如至少約8g / kg)。
[0206]本發(fā)明的另一方面涉及為由CHO細胞生產(chǎn)抗白介素18 (IL-18)抗體(例如完全人類IL-18抗體)的生產(chǎn)而優(yōu)化的細胞培養(yǎng)基。可使用本發(fā)明方法和組合物生產(chǎn)的完全人類IL-18抗體的實例描述于PCT公開案WOOl / 058956中，其以參考形式并于本文。
[0207]在一個實施方案中，為CHO細胞中IL-18抗體生產(chǎn)而優(yōu)化的細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基包括下列成份:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑的單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約IOml / kg或122.45mg / L);重組人胰島素(例如約3.8至3.9mL / kg或7.8mg / kg);無水葡萄糖(例如約7.0g / kg) ；L-谷氨酰胺(例如約0.87至0.88g / kg) ；L-天冬酰胺一水合物(例如約0.45g/kg);碳酸氫鈉(例如約1.6g / kg) ;HEPES (例如約1.8g/kg) ;NaCl (例如約2.67g / kg) ；Pluronic ?_68(例如約1.(^ / kg) ;NaH2P04.H2O (例如約 0.03 至 0.04g /kg) ；Na2HPO4.7H20(例如約0.43至0.44g / kg);酵母源水解產(chǎn)物(例如約4.0g / kg)；及植物源水解產(chǎn)物(例如約2.6g / kg)。用于表達完全人類IL-18抗體的細胞生長的細胞培養(yǎng)基可具有7.10至7.20的pH值及373至403m0smo / kg的滲透壓。上述數(shù)值(例如所述胰島素、PH或滲透壓值)的中間數(shù)也為本發(fā)明的一部分。
[0208]為CHO細胞中IL-18抗體生產(chǎn)而優(yōu)化的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基實例包括下列成份:經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其經(jīng)修飾以去除下列組份:碳酸氫鈉、HEPES緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約IOml / kg或122.45mg / L);重組人胰島素(例如約6.0mL / kg或12mg / kg);無水葡萄糖(例如約7.0g / kg) ；L-谷氨酰胺(例如約0.58至0.59g/kg);碳酸氫鈉(例如約1.6g / kg)；HEPES(例如約 1.8g / kg) ;NaCl (例如約 2.45g / kg) ；Pluronic F_68(例如約 1.0g /kg) ；NaH2PO4.Η20 (例如約 0.03 至 0.04g/kg) ；Na2HPO4.7Η20(例如約 0.43 至 0.44g / kg)；酵母源水解產(chǎn)物(例如約10.7g / kg);及植物源水解產(chǎn)物(例如約6.9至7.0g / kg)。用于生產(chǎn)完全人類抗-1L-18抗體的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的另一實例包括:排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；檸檬酸鐵(例如約IOml / kg或122.45mg / L);重組人胰島素(例如約6.5mL / kg或13mg / kg);無水葡萄糖(例如約7.0g / kg) ；L-谷氨酰胺(例如約0.58至0.59g / kg);碳酸氫鈉(例如約1.6g / kg) ;HEPES (例如約1.8g / kg) ;NaCl (例如約
2.45g/kg) ；Pluronic F-68 (例如約 1.0g/kg) ；NaH2PO4.H2O(例如約 0.03 至 0.04g/kg)；Na2HPO4.7H20(例如約0.43至0.44g/kg);酵母源水解產(chǎn)物(例如約14.2至14.3g/kg)；及植物源水解產(chǎn)物(例如約9.2至9.3g/kg)。生產(chǎn)完全人類IL-18抗體的CHO細胞的細胞培養(yǎng)基可具有7.10至7.20的pH值及373至403m0smo/kg的滲透壓。上述數(shù)值(例如所述胰島素、PH或滲透壓值)的中`間數(shù)也為本發(fā)明的一部分。
[0209]除實施例部分所述的示例性培養(yǎng)基以外，下文也描述了與改良抗體生產(chǎn)分批補料方法和補充培養(yǎng)基相關(guān)的本發(fā)明范疇內(nèi)的培養(yǎng)基的其它實例。
[0210]本發(fā)明培養(yǎng)基可用于通過使培養(yǎng)基或其組份與所有或部分細胞群接觸來實現(xiàn)適當(dāng)細胞培養(yǎng)?？赏ㄟ^混合、添加、組合、接種或攪拌一或多種細胞與一或多種化合物、溶液、培養(yǎng)基等而使培養(yǎng)基與細胞接觸。亦可通過(例如)"補料"以替代或補充下文更詳細描述的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基而使培養(yǎng)基與細胞一次性、以增量形式或以逐步方式接觸。
[0211]IV.用于改良蛋白生產(chǎn)的方法和組合物
[0212]本發(fā)明方法或組合物涉及哺乳動物細胞培養(yǎng)。在一個實施方案中，所使用的哺乳動物細胞為CHO細胞。
[0213]已描述將DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞中的既定方法。Kaufman, R.J., Large ScaleMammalian Cell Culture, 1990,第15-69頁。使用市售試劑(例如陽離子脂質(zhì)試劑Lipofectamine?、lipofectamine?-2000 或 lipofectamine?-plus (可購自 Invitrogen))的附加方案可用以轉(zhuǎn)染細胞。Feigner等人(1987).，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:7413-7417。此外，用涂潰了核酸的顆粒進行電穿孔或轟擊可用以使用程序轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，例如下列文獻中的程序:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)和 Fitzpatrick-McElligott(1992)，Biotechnology(NY)10(9):1036-40。可使用本領(lǐng)域已知方法(例如對細胞毒性藥物的抗性)進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的選擇。Kaufman 等人((1990), Meth.Enzymologyl85:487-511)描述了若干選擇機制，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)抗性。DHFR選擇的適當(dāng)宿主菌株可為缺失DHFR的CHO菌株DX-BlI。Urlaub 及 Chasin (1980)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216_4220。可將表達 DHFR cDNA 的質(zhì)粒導(dǎo)入菌株DX-Bll中且只有含有質(zhì)粒的細胞可于適當(dāng)選擇培養(yǎng)基中生長?？刹⑷氡磉_載體中的可選擇標記的其他實例包括賦予抗生素(例如G418及勻霉素B)抗性的cDNA?？苫趯@些化合物的抗性選擇含有載體的細胞。
[0214]已顯示可改良哺乳動物表達載體的異源基因表達的附加控制序列包括下列元件:衍生自CHO細胞的表達加強序列元件(EASE) (Morris等，Animal Cell Technology,第529-534頁(1997);美國專利第6312951 BI號、第6027915號和第6309841 BI號)及來自腺病毒2的三聯(lián)前導(dǎo)序列(TPL)和VA基因RNA (Gingeras等(1982)，J.Biol.Chem.257:13475-13491)。病毒來源的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列使得雙順反子mRNA有效翻譯(Oh和 Sarnow(1993), Current Opinion in Genetics and Developments:295-300 ；Ramesh等人(1996)，Nucleic Acids Research24:2697-2700)。異源 cDNA 以雙順反子 mRNA 部分(后面為篩選標記的基因(例如DHFR))表達的部分已顯示可改良宿主的轉(zhuǎn)染能力和異種cDNA 白勺表達(Kaufman 等人(1990), Methods in Enzymo1.185:487-511)。米用雙順反子mRNA 的示例性表達載體為 Mosser 等，Biotechniques22:150-161 (1997)描述的 pTR-DC/GFP 及 Morris 等，Animal Cell Technology,第 529-534 頁(1997)描述的 p2A5I 。
[0215]Mosley等人已描述了一種可用的高表達載體pCAVNOT ((1989)，Cel 159:335-348)。可如 Okayama 及 Berg 所公開經(jīng)((1983), Mol.Cell.Biol.3:280)構(gòu)建用于哺乳動物宿主細胞中的其他表達載體。適用在C127鼠類乳腺上皮細胞中哺乳動物cDNA的穩(wěn)定高水平表達的系統(tǒng)可大體上如Cosman等人所述構(gòu)建((1986), Mol.1mmunol.23:935)。Cosman 等人描述的可用高表達載體 PMLSV N1/N4((1984), Nature312:768)已保藏為ATCC39890。其它可用的哺乳動物表達載體描述于EP專利第-A-O 367 566號和W001/27299A1。載體可衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒。可添加異源信號序列替代天然信號序列，該類異源信號序列例如以下序列之一:美國專利第4965195號中描述的IL-7信號序列；Cosman等人描述的IL-2受體信號序列(Nature312:768(1984)) ；EP專利第O 367 566號描述的IL-4信號肽序列；美國專利第4968607號中描述的IL-1受體型信號肽；&EP專利第O 460846號中描述的II型IL-1受體信號肽。
[0216]可在真核細胞中重組生產(chǎn)多肽且優(yōu)選由適合于細胞培養(yǎng)物中生長的宿主細胞分泌。用于本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選為哺乳動物細胞。該類細胞也可經(jīng)基因工程改造表達所關(guān)注基因，可為適合于細胞培養(yǎng)物中生長的哺乳動物生產(chǎn)細胞和/或可為同源細胞株。常用于工業(yè)中的該類細胞的實例為VER0、BHK、HeLa, CVl (包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤細胞株(例如NS0、NS1)、PC12、WI38細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，該類細胞廣泛地用于生產(chǎn)數(shù)種復(fù)合重組多肽,例如細胞激素、凝血因子和抗體(Brasel等(1996)，Blood88:2004-2012 ；Kaufman 等(1988)，J.Biol Chem263:6352-6362 ；McKinnon 等(1991)，J MolEndocrinol6:231-239 ；ffood 等(1990)，J.1mmunol.145:3011-3016)。缺乏二氫葉酸還原酶(DHFR)的突變細胞株(Urlaub 等(1980) ,Proc Natl Acad Sci USA77:4216_4220，其以參考形式并于本文)DXBl I和DG-44為合乎需要的CHO宿主細胞株，因為有效DHFR可選擇和可擴增基因表達系統(tǒng)使得該類細胞中高水平表達重組多肽(Kaufman R.J.(1990)，MethEnzymol 185:537_566，其以參考形式并于本文)。此外，這些細胞易于作為粘附或混懸培養(yǎng)物操縱且顯示相對優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性。CHO細胞和其中表達的重組多肽已被廣泛地特性研究且已經(jīng)管理機構(gòu)許可用于臨床商業(yè)制造。也可使用生產(chǎn)抗體的雜交瘤細胞株實踐本發(fā)明方法。制造雜交瘤的方法為本領(lǐng)域熟知。參見例如Berzofsky等,Paul編輯,FundamentalImmunology,第 2 版，第 315-356 頁，347-350, Raven Press Ltd.,New York (1989) ? 衍生自上述細胞系的細胞株也適用于實踐本發(fā)明。
[0217]用編碼重組蛋白的多聚核苷酸序列轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)牟溉閯游锼拗骷毎?例如CHO細胞)后，鑒定并分離顯示穩(wěn)定表達重組蛋白的細胞?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域的已知方法，通過將適當(dāng)DNA載體轉(zhuǎn)染至二氫葉酸還原酶缺乏(DHFR-)的中國倉鼠卵巢細胞(CHO AM-1/D，美國專利第6210924號)中，隨后分離且檢測顯示最高重組蛋白表達的個別純系而完成重組蛋白的穩(wěn)定表達?；谛∫?guī)模旋轉(zhuǎn)器和較大規(guī)模生物反應(yīng)器中的生長和生產(chǎn)，選擇特定細胞株作為生產(chǎn)重組蛋白的細胞株。
[0218]可通過本領(lǐng)域熟知的方法(例如，通過在不含血清的條件下于96和/或24孔板中進行多輪限制性稀釋)，使用本發(fā)明細胞培養(yǎng)基克隆生產(chǎn)最高含量重組蛋白的細胞?；诟鞣N懸浮容器中的生產(chǎn)和生長特征來選擇克隆?？蛇M行酶免疫測定法(EIA)選擇生產(chǎn)最高水平重組蛋白的克隆。可通過使克隆在介于100ml至高達3L范圍內(nèi)的各種振蕩器或旋轉(zhuǎn)燒瓶及生物反應(yīng)器中的生長來測量生長特征(包括倍增時間和密度)。選擇最佳克隆(例如可在培養(yǎng)物中達到最高 密度的最快倍增時間的克隆)且選擇其作為用于重組蛋白生產(chǎn)的細胞系。在一個實施方案中 ，重組蛋白生產(chǎn)用于商業(yè)目的且使用大規(guī)模生物反應(yīng)器進行。
[0219]通常，在組織培養(yǎng)板(例如IOcm培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板等)或其他粘附培養(yǎng)(例如微載體珠)和懸浮培養(yǎng)(例如滾瓶中)，在無菌、溫度受控和大氣條件下進行細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)物可在搖瓶、小規(guī)模生物反應(yīng)器和/或大規(guī)模生物反應(yīng)器中生長。生物反應(yīng)器為用以培養(yǎng)細胞的裝置，在生物反應(yīng)器中可監(jiān)測、調(diào)節(jié)并控制環(huán)境條件，例如溫度、空氣、攪拌和/或PH值。本發(fā)明方法(包括分批補料方法)和組合物可用于大規(guī)模哺乳動物細胞培養(yǎng)，例如10L、11L、12L、13L、14L等。在一個實施方案中，本發(fā)明的大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法和組合物適用于CHO細胞培養(yǎng)和抗體生產(chǎn)。
[0220]根據(jù)本發(fā)明，在促進所關(guān)注多肽(可為抗體或重組多肽)生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)哺乳動物宿主細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇使用本文所述的一或多種經(jīng)研發(fā)以使特定培養(yǎng)宿主細胞中的細胞生長、細胞活力和/或重組多肽生產(chǎn)最大化的細胞培養(yǎng)基。或者，本發(fā)明方法和組合物可與市售細胞培養(yǎng)基組合使用。
[0221]哺乳動物細胞的適當(dāng)培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域已知(參見例如Animal cell culture:APractical Approach,D.Rickwood編，Oxford university press,New York(1992))且可與的本發(fā)明的改良方法組合?？梢詰腋顟B(tài)或附著至固體基質(zhì)上培養(yǎng)哺乳動物細胞。此外，也可(例如)在具有或不具有微載體的流體化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶、搖瓶或攪拌槽生物反應(yīng)器中培養(yǎng)哺乳動物細胞且以分批、分批補料、連續(xù)、半連續(xù)或灌注模式進行。
[0222]根據(jù)本發(fā)明的方法可用以改良單一階段和多階段培養(yǎng)過程中的重組多肽生產(chǎn)。在單一階段過程中，將細胞接種至培養(yǎng)環(huán)境中且在單一生產(chǎn)期間采用所公開的方法。在多階段過程中，在兩個或兩個以上不同階段中培養(yǎng)細胞。舉例而言，首先可在生長期，在使細胞增殖和活力最大化的環(huán)境條件下培養(yǎng)細胞，接著在使多肽生產(chǎn)最大化的條件下將其轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)期。生長期和生產(chǎn)期可在一或多個過渡期之后或被一或多個過渡期所分離。在多階段過程中，至少可在生產(chǎn)期中采用本發(fā)明方法。
[0223]為達成理解而非限制目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解蛋白生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)和培養(yǎng)周期可包括三種通用類型:即，連續(xù)培養(yǎng)、分批培養(yǎng)和分批補料培養(yǎng)。在連續(xù)培養(yǎng)中，例如，在培養(yǎng)期間向細胞提供新鮮培養(yǎng)基補充物(即補入培養(yǎng)基)，同時每日移除舊培養(yǎng)基且(例如)每日或連續(xù)收集產(chǎn)物。在連續(xù)培養(yǎng)中，可每日添加并可連續(xù)(即點滴或灌注)添加補入培養(yǎng)基。對于連續(xù)培養(yǎng)而言，可如需要將細胞保持于培養(yǎng)物，只要細胞保持存活并且維持環(huán)境和培養(yǎng)條件即可。
[0224]在分批培養(yǎng)中，最初在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞且在培養(yǎng)周期中或在培養(yǎng)周期結(jié)束前不移除、替代也不補充該培養(yǎng)基，即不用新鮮培養(yǎng)基向細胞"補料"。在培養(yǎng)周期結(jié)束時，收集所需產(chǎn)物。
[0225]對于分批補料培養(yǎng)而言，通過在培養(yǎng)周期中每日(或連續(xù)地)一或多次用營養(yǎng)溶液補充培養(yǎng)基，即在培養(yǎng)期間用補入培養(yǎng)基對細胞"補料"，延長培養(yǎng)周期時間。分批補料培養(yǎng)可包括如下所述的各種補料方案和次數(shù)，例如每日、每隔一日、每兩日等、每日一次以上或每日少于一次等。此外，可用補入培養(yǎng)基對分批補料培養(yǎng)物連續(xù)補料。接著，在培養(yǎng)/生產(chǎn)周期結(jié)束時收集所需產(chǎn)物。本發(fā)明優(yōu)選涵蓋分批補料細胞培養(yǎng)物，其中使用可增加蛋白生產(chǎn)并可延長蛋白生產(chǎn)期的優(yōu)化補料溶液進行補料。
`[0226]改良分批補料培養(yǎng)物:水解產(chǎn)物和基礎(chǔ)富集溶液
[0227]本發(fā)明的一方面為使用改良分批補料方法和補充基礎(chǔ)溶液及水解產(chǎn)物溶液組合增加蛋白生產(chǎn)的方法和組合物。改良分批補料方法部分基于添加兩種富集溶液(即水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液)，該類富集溶液在蛋白生產(chǎn)時段中添加至細胞培養(yǎng)基中。用于本發(fā)明的分批補料方法的水解產(chǎn)物富集溶液包含并非衍生自植物或動物的第一水解產(chǎn)物和第二植物源水解產(chǎn)物。并非衍生自植物或動物且并為植物源水解產(chǎn)物的水解產(chǎn)物的實例為酵母源水解產(chǎn)物。可用于水解產(chǎn)物富集溶液中的植物源水解產(chǎn)物的實例為大豆源水解產(chǎn)物?；A(chǔ)富集溶液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如PF CH0、天冬酰胺和葡萄糖，且水解產(chǎn)物富集溶液包括至少兩個不同的非動物源水解產(chǎn)物。在一定時段中以一定時間間隔(例如在11-15天的時段中以每日時間間隔)將水解產(chǎn)物和基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞培養(yǎng)物中，且可于同一日或不同日添加。
[0228]本發(fā)明表征了一種生產(chǎn)抗-TNFa抗體(例如阿達木單抗/D2E7)的分批補料方法，其包含在介于32至38°C范圍內(nèi)的培養(yǎng)溫度下在細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)包含編碼抗-TNFa抗體的核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一個實施方案中，培養(yǎng)溫度為35°C。向CHO細胞補入水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液以處理(例如解決或校正)營養(yǎng)缺乏以使生產(chǎn)率最大化。將水解產(chǎn)物和基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞培養(yǎng)物中。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含介于20與65%之間的溶氧，例如約30%溶氧。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基含有蛋白生產(chǎn)所需的葡萄糖含量，例如至少約l_5g/L葡萄糖。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含約1.5-2.5g/L葡萄糖。在另一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含約2g/L葡萄糖。在整個蛋白生產(chǎn)培養(yǎng)過程中，可通過按需要向細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加葡萄糖以維持所給定濃度(例如至少約2.0g/L葡萄糖)來控制葡萄糖濃度。在一個實施方案中，用于抗-TNFa抗體的分批補料方法的水解產(chǎn)物富集溶液基本由下列各物組成:約50-280g/L大豆源水解產(chǎn)物(包括其間的范圍和數(shù)值，例如，100-225，50-225,225-275和265g/L)和約75_300g/L酵母源水解產(chǎn)物(包括其間的范圍和數(shù)值，例如，100-250，150-200，145-175 和 165g/L)。[0229]為用于在CHO細胞中生產(chǎn)抗-TNF α抗體(例如阿達木單抗/D2E7)的分批補料方法而優(yōu)化的基礎(chǔ)富集溶液具有約9.0至10.5的pH值(包括其間的范圍和數(shù)值，例如，9.1、9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10,10.1,10.2,10.3,10.4,10.5)。添加水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液的時段在9至15天之間，例如12天。在一個實施方案中，在該時段以下各日的至少一日將基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞培養(yǎng)基中:第4日、第6日、第9日和第11日，且在該時段的第4日、第7日或第4日和第7日將水解產(chǎn)物富集溶液添加至細胞培養(yǎng)基中。
[0230]在另一備選實施例中，用于生產(chǎn)抗-TNFa抗體(例如阿達木單抗/D2E7)的分批補料方法可包括根據(jù)PH值線性斜坡(包含自約6.5-8 (例如，7.1至7.2)的pH值起始且產(chǎn)生最終約6.9的pH值)調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)基的pH值。在一個實施方案中，在至少約24小時、48小時或72小時的時段內(nèi)調(diào)節(jié)pH值線性斜坡。
[0231]本發(fā)明也涉及生產(chǎn)抗-1L12抗體(例如ABT-874)的分批補料方法，其包含在介于32至38°C (例如33°C )范圍內(nèi)的培養(yǎng)溫度下在細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)包含編碼抗-1L12抗體的核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。用于IL-12抗體生產(chǎn)的水解產(chǎn)物富集溶液也可含有葡萄糖。在一個實施方案中，在約6.9的pH值下培養(yǎng)CHO細胞。向CHO細胞補入水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液以維持營養(yǎng)缺乏，以使生產(chǎn)率最大化。將水解產(chǎn)物和基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞培養(yǎng)物中。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基包含介于20與65%之間的溶氧，例如約40%溶氧。在一個實施方案中，用于抗-1L12抗體的分批補料方法的水解產(chǎn)物富集溶液基本由下列各物組成:約50-280g/L大豆源水解產(chǎn)物(包括其間的范圍和數(shù)值，例如，100-225、50-225、255-275和165g/L)、約75_300g/L酵母源水解產(chǎn)物(包括其間的范圍和數(shù)值，例如，100-250、150-200、145-175和165g/L)和約2.4g/L葡萄糖。為用于在CHO細胞中表達抗-1L12抗體(例如ABT-874)的分批補料方法而優(yōu)化的基礎(chǔ)富集溶液具有約9.7的pH值及約1480m0sm的滲透壓。添加水解產(chǎn)物富集溶液和基礎(chǔ)富集溶液的時段在14至15天之間，例如12天。在一個實施方案中，在該時段的第5日起每隔一天將基礎(chǔ)富集溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中，且在該時段的第6日起每天將水解產(chǎn)物富集溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。或者，可在該時段的第5日起始每天將基礎(chǔ)富集溶液和水解產(chǎn)物富集溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。
[0232]穩(wěn)定、高濃度補料溶液
[0233]本發(fā)明一方面涉及與用于改良蛋白生產(chǎn)率的改良、穩(wěn)定高濃度補料溶液相關(guān)的方法和組合物。改良補料溶液可用于在抗體生產(chǎn)中補充細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基。補料溶液包括葡萄糖(例如100至250g/kg);基礎(chǔ)培養(yǎng)基；除谷氨酰胺以外的氨基酸，例如天冬酰胺(例如1.0至15.0g/kg ；3-12.5g/kghuo3-5g/kg);以及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物。此外，補料溶液具有約6.0至7.5的pH值。兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物可包括植物源水解產(chǎn)物，例如大豆源水解產(chǎn)物，和并非動物源或植物源的水解產(chǎn)物，例如酵母源水解產(chǎn)物。本領(lǐng)域中已知的任何基礎(chǔ)培養(yǎng)基均可用于改良補料溶液，包括但不限于PF CHO或DMEM/F12培養(yǎng)基。也可使用經(jīng)修飾的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在一個實施方案中，基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基排除以下組份:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、谷氨酰胺和葡萄糖。改良補料溶液為穩(wěn)定的，具有小于約15NTU的濁度。本發(fā)明也包括通過添加補料溶液維持細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基的穩(wěn)定葡萄糖含量。上述范圍值的中間數(shù)也為本發(fā)明的一部分，例如，3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8、4、4.2,4.4,4.6,4.8 和 5g/kg 天冬酰胺。 [0234]本發(fā)明也包括一種用于制造包含葡萄糖和至少兩種不同非動物源水解產(chǎn)物的補料溶液的方法。制造補料溶液的方法包括將葡萄糖與基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基組合為組合溶液并將組合溶液的PH值調(diào)節(jié)至約9.5至10.5。接著，將至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物添加至溶液中并再次調(diào)節(jié)PH值，使得所得補料溶液具有約6.5至7.5的pH值。上述范圍值的中間數(shù)也為本發(fā)明的一部分，例如，6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5 的 pH。
[0235]本發(fā)明的補料溶液可用以完成自哺乳動物細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)高含量重組蛋白，例如生產(chǎn)抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由哺乳動物細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)至少約4g/L抗體的方法，其包含在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞。接著，將pH值約6.7至7.0的補料溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。補料溶液包括葡萄糖(例如約100至200g/kg);基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物。在一個實施方案中，該方法可生產(chǎn)至少約4g/L抗體，至少約5g/L抗體；至少約6g/L抗體。上述范圍值的中間數(shù)也為本發(fā)明的一部分，例如，1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、
2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.55g/L 抗體。
[0236]通過使用pH值約6.7至7.0并包括下列組份的補料溶液:葡萄糖；基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基；約除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物，可增加自哺乳動物細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體滴度。在一個實施方案中，將補料溶液添加至包含編碼抗體的核酸的哺乳動物細胞的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中，致使比不添加補料溶液培養(yǎng)的對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物增加至少50%。在一個實施方案中，添加補料溶液會生產(chǎn)比對照物增加至少100%的滴度。在一個實施方案中，添加補料溶液會產(chǎn)生比對照物增加至少150%的滴度?？蓪⒀a充補料溶液在特定細胞濃度下添加至細胞培養(yǎng)物中，例如當(dāng)細胞密度達到每毫升2.0X IO6個細胞或當(dāng)細胞密度達到每毫升約3.5 X IO6個細胞時。以上范圍的中間數(shù)以及本文中所引用的所有其他數(shù)均為本發(fā)明的一部分。使用上述值的任何組合作為上限和/或下限的數(shù)值范圍包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0237]由于本發(fā)明的分批補料方法用以處理(例如解決或校正)生產(chǎn)蛋白(例如抗體)的特定細胞培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求，因此監(jiān)控特定成份是有利的。可監(jiān)控的成份包括任何代謝指示劑，即細胞代謝指示劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的分批補料方法包含監(jiān)控細胞培養(yǎng)基中的葡萄糖水平，包括監(jiān)控葡萄糖水平以使其維持于0.25_20g/L之間。在一個實施方案中，葡萄糖水平維持在0.5至5.5g/L之間，或4.0-5.5g/L。通過監(jiān)控葡萄糖水平，可間接監(jiān)控細胞代謝。如以下實例3中所述，可將葡萄糖用作代謝指示劑。在一個實施方案中，可基于葡萄糖水平以營養(yǎng)組份(例如水解產(chǎn)物)補充細胞培養(yǎng)物。監(jiān)控葡萄糖含量的方法為本領(lǐng)域已知并可包括使用自動取樣裝置進行監(jiān)控?？墒褂玫拇x指示劑的另一實例為谷氨酰胺。以上范圍的中間數(shù)以及本文中所引用的所有其他數(shù)均為本發(fā)明的一部分。使用上述值的任何組合作為上限和/或下限的數(shù)值范圍包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0238]反饋控制系統(tǒng)可用以監(jiān)控細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的代謝指示劑水平。在一個實施方案中，為了滿足所需參數(shù)設(shè)定點(例如預(yù)定葡萄糖水平)，如反饋控制系統(tǒng)所測定將組合補料溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。
[0239]反饋控制系統(tǒng)也可用以測定給定哺乳動物細胞培養(yǎng)物和所關(guān)注蛋白生產(chǎn)的補入曲線。在一個實施方案中，確定用于在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)蛋白的補入曲線的方法包含:在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼蛋白的核酸的哺乳動物細胞；使用反饋控制系統(tǒng)監(jiān)控細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的代謝指示劑，藉此將補料溶液(例如組合補料溶液)添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中。將補料溶液添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中以達到目標代謝指示劑設(shè)定點，例如葡萄糖水平。根據(jù)細胞培養(yǎng)結(jié)論，測定每天添加至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的補料溶液的量并提供應(yīng)于何時將補料溶液添加至細胞培養(yǎng)物中的補入曲線。一旦確立補入曲線，則不再需要監(jiān)控生產(chǎn)所關(guān)注蛋白的給定哺乳動物細胞培養(yǎng)物的代謝指示劑。
[0240]N-乙酰半胱氨酸和丁酸鈉方法及組合物
[0241]如上所述，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)方法可有利達到增加抗體滴度。用于達到在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的蛋白生產(chǎn)率的本發(fā)明另一方面為通過向細胞培養(yǎng)基中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過向細胞培養(yǎng)基中添加丁酸鈉(例如0.1mM至IOmM)、N_乙酰半胱氨酸(例如ImM至80mM)或其組合而生產(chǎn)抗體的方法。在一個實施方案中，抗體滴度至少約100mg/L ;至少約150mg/L ;或至少約200mg/L ;至少約250mg/L ;至少約 300mg/L ;至少約 350mg/L ;或至少約 400mg/L。
[0242]本發(fā)明也涉及通過向細胞培養(yǎng)基中添加丁酸鈉(例如終濃度0.1mM至IOmM)、N-乙酰半胱氨酸(例如終濃度ImM至80m`M)或其組合(對照物相應(yīng)地缺乏丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合)而在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)抗體，從而使得抗體滴度比對照哺乳動細胞培養(yǎng)物改良至少10%的方法。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的抗體滴度比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物改良至少29% ;比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物改良至少40% 匕對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物改良至少70%;或比對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物高至少90%?？稍诓溉閯游锛毎囵B(yǎng)物的生長期中向哺乳動物細胞培養(yǎng)物中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合。在一個實施方案中，在培養(yǎng)時間的第4日與第7日之間向哺乳動物細胞培養(yǎng)物中添加丁酸鈉、N-乙酰半胱氨酸或其組合。在一個實施方案中，以介于5mM至80mM的終濃度(例如20-60mM或約IOmM)單獨添加N-乙酰半胱氨酸或與丁酸鈉組合。
[0243]本發(fā)明也涉及通過向細胞培養(yǎng)基中添加約0.1mM至IOmM N-乙酰半胱氨酸(對照物缺少此添加)使得哺乳動物細胞培養(yǎng)物的壽命與對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物相比延長至少約45%的方法。在一個實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的壽命與對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物相比延長至少約35% ;或與對照哺乳動物細胞培養(yǎng)物相比延長至少約55%。
[0244]應(yīng)注意，本文所描述的細胞培養(yǎng)基和改良培養(yǎng)方法可獨立或彼此組合使用。
[0245]在使用本發(fā)明方法和組合物進行培養(yǎng)后，接著可回收或收集所得表達蛋白。此外，可使用已知方法將自該培養(yǎng)物或組份(例如自培養(yǎng)基或細胞萃取物或體液)純化或部分純化蛋白。分級分離程序包括但不限于過濾、離心、沉淀、相分離、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用層析(HIC，使用例如苯基醚、丁醚或丙醚的樹脂)、HPLC或上述步驟的一些組合。
[0246]舉例而言，多肽純化可包括含有將結(jié)合至多肽的試劑的親柱；在該類親和樹脂(例如刀豆球蛋白A瓊脂糖、HEPARIN-T0Y0PEARL(層析介質(zhì))或Cibacrom blue3GASEPHAROSE(瓊脂糖顆粒))上進行的一個或多個柱層析步驟；包括洗脫的一個或多個步驟；和/或免疫親和層析?？梢源龠M純化的形式表達多肽。舉例而言，其可表達為融合多肽，例如麥芽糖結(jié)合多肽(MBP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX)的融合多肽。表達且純化該類融合多肽的試劑盒可分別購自New England BioLab (Beverly, Mass.)、Pharmacia (Piscataway, N.J.)和In Vitrogen0可用表位標記多肽且隨后使用針對該表位的特定抗體純化。一種該表位FLAG (表位標記)購自Kodak (New Haven, Conn.)。也可能將包含多肽結(jié)合多肽(例如結(jié)合至重組蛋白的單克隆抗體)的親和柱用于親和力純化所表達多肽。其他類型的親和純化步驟可為蛋白A或蛋白G柱，其中親和試劑結(jié)合至含有Fe結(jié)構(gòu)域的蛋白?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)將多肽自親和柱移除，例如在高鹽洗脫緩沖劑中并接著在低鹽緩沖劑中透析以供使用或根據(jù)所使用的親和基質(zhì)改變PH值或其他組份；或可使用親和部分的天然底物競爭性移除。在一個實施方案中，根據(jù)US申請案第11/732918號(以參考形式并于本文)所述方法純化使用本發(fā)明方法和組合物生產(chǎn)的抗體。
[0247]所需的最終純度取決于多肽的預(yù)期用途。本發(fā)明方法和組合物適用于所關(guān)注蛋白的治療用途。因此，當(dāng)預(yù)期在活體內(nèi)給予多肽時，需要相對較高的純度。在該情況下，將多肽純化，使得在通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析時不能檢測到對應(yīng)于其他多肽的多肽條帶。相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，由于差異糖基化、差異翻譯后加工及其類似技術(shù)，通過SDS-PAGE可觀測到多個對應(yīng)于多肽的條帶。最優(yōu)選地，將本發(fā)明多肽純化至大體均質(zhì)，如通過SDS-PAGE進行分析時的單一多肽條帶所指示?？赏ㄟ^銀染、考馬斯藍染色或(如果多肽經(jīng)放射性標記)通過放射自顯影目測多肽條帶。
[0248]本發(fā)明也任選涵蓋進一步配制蛋白。術(shù)語"配制"意指蛋白可經(jīng)緩沖液交換、殺菌、大體積包裝和/或包裝以用于最后使用者。該類組合物可包含與其他組份(例如生理學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑)組合的有效量蛋白。術(shù)語"生理學(xué)上可接受"意指不干擾活性成份的生物活性有效性的無毒材料。
[0249]應(yīng)注意，關(guān)于本文所引用的數(shù)值，以上范圍的中間數(shù)以及本文所引用的所有其他數(shù)值為本發(fā)明的一部分。使用上述數(shù)值的任何組合作為上限和/或下限的數(shù)值范圍包括于本發(fā)明范疇內(nèi)。
[0250]實施例
[0251]以下實施例舉例說明用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的改良方法和組合物，包括用于在哺乳動物細胞中表達生物制品的改良方法和組合物。下文揭示用以培養(yǎng)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞以表達各種重組生物制品的改良生化成分確定的培養(yǎng)基。此外，也舉例說明在以各種形式和規(guī)模運作的生物反應(yīng)器中，含有相同組份但具有不同組份平衡且經(jīng)富集以使更多細胞生長和產(chǎn)物表達增加的大規(guī)模培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。
[0252]實施例1:培養(yǎng)哺乳動物細胞的改良培養(yǎng)基
[0253]通常，哺乳動物(例如中國倉鼠卵巢(CHO))細胞培養(yǎng)基基于市售培養(yǎng)基配方，例如DMEM、Ham氏F12或這些類型培養(yǎng)基的組合。為了在哺乳動物細胞中生產(chǎn)蛋白，細胞培養(yǎng)基必須充分富集以支持細胞生長和生物制品產(chǎn)品表達的增加。以下實施例描述用于培養(yǎng)哺乳動物細胞(即中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)以表達包括抗體的各種重組生物制品的改良生化成分確定的培養(yǎng)基。
[0254]缺乏二氫葉酸還原酶[dhfr(-)]的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞適合在不存在血清或任何其他衍生自動物來源的材料下以懸浮狀態(tài)生長。細胞在不存在次黃嘌呤和胸苷下，在從商業(yè)來源JRH PF-CHO(目錄號67147)獲得的成分確定細胞培養(yǎng)基中生長。盡管細胞系并不缺乏谷氨酰胺合酶，但仍向培養(yǎng)基中添加額外的谷氨酰胺。
[0255]使用本領(lǐng)域熟知的分子生物技術(shù)生成表達生物制品(例如給定標靶的抗體)的CHO細胞系。簡而言之，使用本領(lǐng)域熟知的方法將能夠表達所關(guān)注抗體并能夠表達dhfr酶基因的表達載體導(dǎo)入CHO細胞中。通過在次黃嘌呤和胸苷存在下篩選細胞獲得所關(guān)注的經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞。在濃度不斷增加的甲氨喋呤中進一步培養(yǎng)所篩選的轉(zhuǎn)化子以擴增經(jīng)轉(zhuǎn)染基因并增加所表達蛋白的產(chǎn)率。下文描述用以培養(yǎng)CHO細胞的改良細胞培養(yǎng)基。
[0256]實施例1.1:中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
[0257]一般而言，用于培養(yǎng)CHO細胞的培養(yǎng)基配方由命名為A部分、B部分及C部分的三個部分組成。A部分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并包含水、氨基酸、維生素、無機金屬鹽、微量元素、乙醇胺、腐胺、表面活性劑、丙酮酸鈉、谷胱甘肽和2-巰基乙醇。B部分包含無機鐵來源；且(:部分包含重組生長因子、緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、能量來源、各種非鐵金屬離子、表面活性劑和水解產(chǎn)物。培養(yǎng)基組份大部分為無機的或來自重組來源并且經(jīng)高度純化。培養(yǎng)基不含有來自動物來源的蛋白、脂質(zhì)和碳水化合物。復(fù)合水解產(chǎn)物從經(jīng)高度加工的酵母和植物來源獲得。
[0258]培養(yǎng)基的A部分包括不含蛋白的CHO (PF CH0)培養(yǎng)基(JRH-SAFC Biosciences ；JRH目錄號67147-也稱作原始`A部分)。因此，A部分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括水、氨基酸和維生素。選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基(PF CH0)將其修飾并再調(diào)配以支持細胞生長和所表達蛋白生產(chǎn)率的進一步增加。修飾PF CHO以去除特定組份，包括碳酸氫鈉、HEPES緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖(經(jīng)修飾PF CHO在本文中稱作經(jīng)修飾A部分(也稱作JRH目錄號67411))。也進行這些修飾以促進大規(guī)模生物反應(yīng)器中細胞培養(yǎng)過程條件的改良。
[0259]B部分組份(JRH)由獨立添加的濃縮檸檬酸鐵溶液組成。B部分組份的濃度在所有CHO細胞培養(yǎng)方案中均保持恒定。
[0260]C部分組份包括生長因子(例如胰島素)、氨基酸谷氨酰胺、TC酵母粉和大豆水解產(chǎn)物植物蛋白胨、保持選擇壓力必需的甲氨喋呤及在制備期間用于在培養(yǎng)基水合后調(diào)節(jié)PH值的堿NaOH和酸HCl。
[0261]改良細胞培養(yǎng)基配方由如下制成。首先，最初使CHO細胞在從JRH獲得的PF-CHO培養(yǎng)基(SAFC-JRH目錄號67147)中生長。如下所述，將PF-CHO培養(yǎng)基(目錄號67147)進一步修飾以與CHO細胞株一起使用。該經(jīng)修飾培養(yǎng)基由JRH以新目錄號67411命名。修飾的目標是使細胞培養(yǎng)基的A部分濃度增加，以致滲透壓和pH值不受影響。制造商(JRH)也聲明原始A部分(目錄號67147)不具有碳酸氫鈉、谷氨酰胺并不含蛋白質(zhì)(不添加胰島素或其他蛋白或肽生長因子)。當(dāng)證明有效時，將這些省略的組份獨立添加至67147和6741IA部分配方中，特別用于CHO細胞系。這些成為下文如C部分更詳細描述的組份中的一些。
[0262]表1:原始細胞培養(yǎng)基配方(A部分67147)和經(jīng)修飾細胞培養(yǎng)基配方(經(jīng)修飾的A部分67411)的比較
[0263]
【權(quán)利要求】
1.包含A部分、B部分和C部分的無血清細胞培養(yǎng)基，其中: a)A部分基本由排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖； b)B部分基本由無機鐵來源組成；及 c)C部分包含重組生長因子；緩沖劑；滲透壓調(diào)節(jié)劑；能量來源；及至少兩種不同的非動物源水解產(chǎn)物。
2.一種用于生產(chǎn)蛋白的方法，其包含在權(quán)利要求1的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細胞。
3.一種無血清細胞培養(yǎng)基,其包含: a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基； b)約8-12ml / kg 或 116_126mg / L 朽1 檬酸鐵； c)約2-6mg/ kg重組人胰島素； d)約2-5g/ kg無水葡萄糖； e)約0.1-0.5g/kg L-谷氨酰胺； f)約l-3g/ kg碳酸氫鈉；
g)約0.01-0.05g / kg `NaH2PO4.H2O ；
h)約0.4-0.5g/kg Na2HPO4.7H20 ;及 i)約1.0-3.0g/kg酵母源水解產(chǎn)物。
4.一種用于產(chǎn)生蛋白的方法，其包含: a)在權(quán)利要求3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼該蛋白的核酸的哺乳動物細胞；及 b)將(a)的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中， 以生產(chǎn)所述蛋白。
5.—種無血清細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基，其包含: a)排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；
b)約8 至 12ml / kg 或 122.45mg / L 朽1 檬酸鐵； c)約4至8mL/ kg或10至14mg / kg重組人胰島素； d)約5至9g/ kg無水葡萄糖； e)約0.5至0.7g/kgL-谷氨酰胺； f)約I至2g/ kg碳酸氫鈉；
g)約I 至 2g / kgHEPES ；
h)約2 至 3g / kgNaCl ；
i)約0.5 至 2g / kgPluronicF-68 ；
j)約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ；
k)約 0.4 至 0.5g/kgNa2HP04.7H20 ； I)約8至12g / kg酵母源水解產(chǎn)物；及 m)約60至70g / kg植物源水解產(chǎn)物。
6.一種無血清細胞培養(yǎng)基,其包含: a)排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖； b)約8 至 12ml / kg 或 122.45mg / L 朽1 檬酸鐵； c)約3至5mL/ kg或6至8mg / kg重組人胰島素； d)約5至9g/ kg無水葡萄糖； e)約0.1至2g / kgL-谷氨酰胺； f)約I至2g/ kg碳酸氫鈉；
g)約I 至 2g / kgHEPES ；
h)約2 至 3g / kgNaCl ；
i)約0.1 至 2g / kgPluronicF-68 ；
j)約 0.01 M0.1g / kgNaH2P04.H2O ；
k)約 0.4 至 0.5g / kgNa2HP04.7H20 ； I)約0.4至0.5g / kgL-天冬酰胺一水合物； m)約2至6g / kg酵母源水解產(chǎn)物；及 η)約2至4g / kg植物源水解產(chǎn)物。
7.一種用于生產(chǎn)蛋白的方法，其包含在權(quán)利要求6的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼該抗體的核酸的哺乳動物細胞。
8.一種無血清細胞培養(yǎng)基,其包含: a)排除下列組份的經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基:碳酸氫鈉、緩沖劑、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑及單糖葡萄糖； b)約8至IOml/ kg或120至130mg / L檸檬酸鐵； c)約3至5mL/ kg或7.8mg / kg重組人胰島素； d)約5至9g/ kg無水葡萄糖； e)約0.8至0.9g / kgL-谷氨酰胺； f)約0.3至0.5g/kgL-天冬酰胺一水合物； g)約I至2g/ kg碳酸氫鈉；
h)約I 至 2g / kgHEPES ；
i)約2 至 3g / kgNaCl ；
j)約 0.5 至 2g / kgPluronicF-68 ；
k)約 0.01 至 0.1g / kgNaH2P04.H2O ；
I)約 0.1 至 1.0g/kgNa2HP04.7H20 ；
m)約2至6g/kg酵母源水解產(chǎn)物；及
η)約2至4g / kg植物源水解產(chǎn)物。
9.一種無血清細胞培養(yǎng)基,其包含: a)基礎(chǔ)細胞生長培養(yǎng)基； b)約8至12ml/ kg或120至130mg / L檸檬酸鐵； c)約2至6mg/ kg重組人胰島素； d)約150至250g/ kg無水葡萄糖； e)約0.1至0.5g / kgL-谷氨酰胺； f)約I至2g/ kg碳酸氫鈉；及g)約5至15g / kg酵母源水解產(chǎn)物。
10.一種用于產(chǎn)生蛋白的方法，其包含在權(quán)利要求8-9中任一項的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述蛋白的核酸的 哺乳動物細胞。
【文檔編號】C12P21/00GK103555651SQ201310414770
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2007年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2006年9月13日
【發(fā)明者】I.A.布拉, J.C.馬杜克, J.C.范, C.史丘茲, N.A.洛依, D.F.布魯頓, J.麥因泰爾, 張幼翔, T.希沃斯特 申請人:Abbvie 公司