羅布麻eIF-5A基因及其編碼蛋白的制作方法
【專利摘要】羅布麻eIF-5A基因及其編碼蛋白，它涉及羅布麻eIF-5A基因及其編碼蛋白。羅布麻eIF-5A基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明是從抗逆性極強、且具有藥用價值和經(jīng)濟價值的羅布麻中克隆eIF-5A基因；該基因cDNA序列為909bp,開放讀碼框為480bp,編碼159個氨基酸。在鹽堿、干旱、低溫脅迫條件下，AveIF-5A基因表達量在根、莖、葉中均升高。AveIF-5A完整ORF及刪減子AveIF-5A86-156aa均能提高酵母菌抗鹽堿的能力。鹽堿脅迫條件下，AveIF-5A基因在植物中過量表達可以提高植物抗逆性，緩解植物膜脂的過氧化作用。
【專利說明】羅布麻elF-5A基因及其編碼蛋白
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及羅布麻eIF_5A基因及其編碼蛋白。
【背景技術】
[0002]荒漠化是一個全球性的問題，全球荒漠化面積是4000萬km2，且每年還在以5_7萬km2的速度擴展，威脅到全球近三分之一的土地和十多億人的生活。我國是世界荒漠化土地面積較大的國家之一，荒漠化土地面積262.2萬km2,占國土總面積的27.3%,每年因荒漠化造成直接經(jīng)濟損失達到540億元。黑龍江省西部地區(qū)荒漠化現(xiàn)象十分嚴重，面積已達54079.27km2，占全省總土地面積45.48萬km2的11.89%?；哪o工、農(nóng)、牧業(yè)生產(chǎn)和人民生活帶來了嚴重影響。農(nóng)業(yè)生態(tài)、生產(chǎn)環(huán)境惡化，農(nóng)田受到荒漠化的危害，耕地和草地嚴重退化。面對現(xiàn)實，應積極采取有力措施，控制荒漠化產(chǎn)生的條件，依靠科學技術與荒漠化作斗爭，耐旱、耐鹽堿、耐寒和抗風沙植物的有效利用在土地荒漠化防治中發(fā)揮著巨大的作用。
[0003]羅布麻是一種極具開發(fā)價值的多年生草本野生植物，又稱紅麻或茶葉花，是夾竹桃科羅布麻屬，在我國新疆、青海、甘肅、寧夏、內蒙古、山東等省區(qū)均有分布，大多生長在鹽堿沙荒地、沙漠上，耐寒、耐旱、耐鹽、抗風沙，對于荒漠化的治理具有積極意義。羅布麻全身是寶，是一種集鹽堿地綠化價值、纖維價值、藥用價值于一體的野生優(yōu)良水土保持植物，生態(tài)效益和經(jīng)濟效益兼具，可以說是鹽堿、沙漠、干旱地區(qū)最具開發(fā)潛力和價值的植物品種之
一。關于羅布麻的研究多集中于藥用價值的開發(fā)和利用，以及鹽堿、干旱脅迫條件下生理變化，栽培、組織培養(yǎng)再生體系的研究；關于羅布麻分子生物學方面的研究較少，對于羅布麻抗逆相關基因的克隆和功能分析就更少。
[0004]eIF-5A(eukaryotic translation initiation factor, eIF-5A)是真核細胞蛋白翻譯起始因子，在真核細胞內普遍存在，由154個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為
16700,等電點約為5.1,是目前發(fā)現(xiàn)的惟--個含羧腐胺賴氨酸(hypusine)殘基的蛋白
質，其前體無活性，經(jīng)過DHS酶催化、修飾加工后成為有活性的eIF-5A蛋白。關于eIF_5A的研究在人和酵母細胞中的報道較多，有報道稱elF-5A與細胞中的許多生命活動有關，如細胞增殖、蛋白質翻譯、mRNA降解、細胞周期的轉化及細胞衰老與凋亡。eIF-5A在植物中的研究起步較晚，雖然有報道稱將eIF-5A導入擬南芥、香蕉、楊樹中，提高了轉基因植株的生物量和抗逆性，但是該基因的功能和作用機理并不十分清楚，尤其是在逆境環(huán)境下，該基因生物學功能的研究就更少。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供羅布麻eIF_5A基因及其編碼蛋白。
[0006]本發(fā)明的羅布麻eIF_5A基因的核苷酸序列如SEQ ID Nol所示。
[0007]本發(fā)明的羅布麻eIF_5A基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0008]本發(fā)明是從抗逆性極 強、且具有藥用價值和經(jīng)濟價值的植物一羅布麻中克隆eIF-5A基因；該基因在低溫、干旱、鹽堿脅迫條件下的表達情況；將該基因完整ORF及不同功能區(qū)的刪減子序列導入到酵母中，通過對轉基因酵母抗逆性的分析，確定不同功能區(qū)與抗逆性的關系；為進一步驗證eIF-5A基因的功能，構建eIF-5A基因植物表達載體，轉化煙草，通過對轉基因植株分子生物學檢測和抗逆性分析，確定eIF-5A基因過量表達對植物抗逆性的影響，從而對該基因的功能進行鑒定。本發(fā)明中為進一步揭示羅布麻eIF-5A基因在逆境條件下的生物學功能奠定基礎，也為該基因在抗逆基因工程育種中的應用提供理論依據(jù)和基因資源。
[0009]本發(fā)明從羅布麻中克隆獲得eIF_5A基因cDNA序列為909bp，開放讀碼框為480bp,編碼159個氨基酸。在鹽堿、干旱、低溫脅迫條件下，AveIF-5A基因表達量在根、莖、葉中均升高。AveIF-5A完整ORF及刪減子AveIF-5A86-156aa均能提高酵母菌抗鹽堿的能力。鹽堿脅迫條件下，AveIF-5A基因在植物中過量表達可以提高植物抗逆性，緩解植物膜脂的過氧化作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明中羅布麻葉片總RNA的的電泳圖，其中I和2均為羅布麻葉片RNA電泳結果；
[0011]圖2為本發(fā)明中AvelF-5A簡并引物PCR結果的電泳圖，其中M為DL2000，1為簡并引物PCR產(chǎn)物；
[0012]圖3為本發(fā)明·中AvelF-5A5 ’ RACE擴增產(chǎn)物的電泳圖，其中M為DL2000，I為5 ’ RACE擴增產(chǎn)物；
[0013]圖4為本發(fā)明中AveIF-5A3’RACE擴增產(chǎn)物的電泳圖，其中M為DL2000，I為sp5/anchorprimerPCR 產(chǎn)物，2 為 sp4/anchorprimerPCR 產(chǎn)物；
[0014]圖5為本發(fā)明中AveIF_5A保守功能區(qū)域圖；
[0015]圖6為本發(fā)明中NaHCO3脅迫下羅布麻eIF_5A基因在根莖葉中的表達的柱狀圖，其中 為葉， 莖，□為根；
[0016]圖7為本發(fā)明中干旱脅迫下羅布麻eIF_5A基因在根莖葉中的表達的柱狀圖，其中 為葉， 莖，□為根;
[0017]圖8為本發(fā)明中低溫脅迫下羅布麻eIF_5A基因在根莖葉中的表達的柱狀圖，其中圖為葉， 莖，□為根;
[0018]圖9為本發(fā)明中AveIF_5A完整ORF及刪減子示意圖；
[0019]圖10為本發(fā)明中重組菌在NaHCO3脅迫下的存活率的柱狀圖；
[0020]圖11為本發(fā)明中轉eIF_5A基因煙草PCR檢測的電泳圖，其中M為DL2000，1-16為待檢植株，17為空白對照，18為陽性對照；
[0021]圖12為本發(fā)明中NaHCO3脅迫對煙草POD活性的影響的柱狀圖，其中□為未脅迫，□為脅迫;
[0022]圖13為本發(fā)明中NaHCO3脅迫對煙草SOD活性的影響的柱狀圖，其中□為未脅迫， 為脅迫；
[0023]圖14為本發(fā)明中NaHCO3脅迫對煙草MDA含量的影響的柱狀圖，其中□為未脅迫，為脅迫。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0025]【具體實施方式】一:本實施方式羅布麻eIF_5A基因的核苷酸序列如SEQ ID Nol所
示
[0026]本實施方式中羅布麻eIF_5A基因的cDNA序列為909bp，開放讀碼框為480bp，編碼159個氨基酸。
[0027]【具體實施方式】二:本實施方式羅布麻eIF_5A基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0028]1、羅布麻eIF_5A基因的獲得方法如下:
[0029]羅布麻eIF_5A基因克隆:利用SDS法提取野生羅布麻葉片的總RNA，以Oligod(T) 18為引物，參照大連寶生物Reverse TranscriptaseM-MLV(RNaseH-)方法反轉錄為cDNA;在NCBI上檢索獲得美洲黑楊(FJ032302)、紫苜蓿(AF416338)、馬鈴薯(AB004823)、葡萄(XM_002273229)、月季(DQ345329)、巴西橡膠(AF516357)、木薯(AF266464)的 eIF_5A基因序列，進行序列比對后在同源保守區(qū)設計簡并引物AveIF-5AJ-F和AveIF-5AJ-R，進行PCR后測序，獲得eIF-5A基因部分序列，設計5，/3，RACE引物SPU SP2、SP3、SP4和SP5。按照Roche5’ /3’ RACE Kit, 2nd Generation試劑盒的方法克隆羅布麻eIF_5A基因5’ /3’端
[0030]上述引物序列見表1:
[0031]
【權利要求】
1.羅布麻eIF-5A基因，其特征在于羅布麻eIF-5A基因的核苷酸序列如SEQID No:1所示。
2.羅布麻eIF-5A基因的編碼蛋白，其特征在于羅布麻eIF_5A基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所 示。
【文檔編號】C12N15/29GK103436540SQ201310414921
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】王雷, 黃國慶, 李瑤, 吳瓊, 曹滌非, 王東凱, 陳立娟 申請人:黑龍江省科學院高技術研究院