一種獲得水稻指定基因突變體的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種獲得水稻指定基因突變體的方法，通過對傳統(tǒng)的CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，分別構(gòu)建了優(yōu)化后的CAS9基因的表達(dá)載體、優(yōu)化后的sgRNA的表達(dá)載體和優(yōu)化后的雙元crRNA:tracrRNA的表達(dá)載體，并將篩選出的水稻特定基因的識別序列克隆到上述載體中，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，最終獲得水稻指定基因的突變體。該方法把CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用到水稻中產(chǎn)生指定基因的突變體，且突變率高，在植物基因工程中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種獲得水稻指定基因突變體的方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種在水稻中獲得指定基因突變體 的方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Oryza sativaL.)是重要的糧食作物，養(yǎng)活了半數(shù)地球人口，研究水稻、提高 水稻產(chǎn)量對保證國家的糧食安全有重要的意義。因而對水稻基因功能的研究和闡明，以及 利用已有的基因功能信息來操縱和改造水稻基因功能，對于改善農(nóng)藝性狀，提高糧食產(chǎn)量 具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。水稻是單子葉植物的模式植物，具有悠久的研究歷史；同時(shí)， 相對其它禾本科植物，基因組較小，是最早完成基因組測序的植物之一。水稻基因組測序完 成之后，極大地促進(jìn)了水稻基因功能的研究。在正向遺傳學(xué)方面，例如利用圖位克隆的技術(shù) 可以確定導(dǎo)致特定突變表型的基因位點(diǎn)。在反向遺傳學(xué)方面，大量已知邊界序列的T-DNA 插入突變體為研究特定基因的功能帶來便利。盡管如此，目前這些方法本身都是基于隨機(jī) 性的原理，研究者不總是能夠獲得特定位點(diǎn)的理想的突變體材料。同時(shí)，絕大多數(shù)對水稻 基因組的操作依然停留在隨機(jī)破壞基因功能的層面上，無法進(jìn)行更加精細(xì)和準(zhǔn)確的序列改 變，比如只在個(gè)別位點(diǎn)對某個(gè)基因的序列進(jìn)行替換，而不是完全破壞該基因的功能；或者利 用同源重組進(jìn)行報(bào)告基因的定點(diǎn)整合。即使有報(bào)道在水稻中通過同時(shí)使用正負(fù)篩選標(biāo)記的 方法得到了定點(diǎn)整合入基因組的植株，也是通過提高轉(zhuǎn)基因植株的篩選量來實(shí)現(xiàn)的，這種 策略的效率很低，不適合廣泛采用。對于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)來說也存在類似的問題，研究者需要 通過一代一代反復(fù)的雜交回交等耗時(shí)費(fèi)力的勞動(dòng)把優(yōu)良的性狀匯聚到新的品種當(dāng)中，因而 迫切需要新的、能夠直接改變基因組序列的方法來提高效率。
[0003] 為了實(shí)現(xiàn)高效的基因組編輯，關(guān)鍵的前提是能夠定點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈的斷裂。目 前較為常用的可以在基因組水平用來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切割的技術(shù)有基于歸巢內(nèi)切酶（homing nuclease)的meganuclease，基于鋒指結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶（Zfn)，以及基于Taleffector的 TALEN技術(shù)。由于歸巢內(nèi)切酶可以識別約20個(gè)堿基，特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于普通限制性內(nèi)切酶，但 是該酶的DNA識別域和切割域位于同一結(jié)構(gòu)域，因而人為改變該酶的DNA識別序列往往同 時(shí)導(dǎo)致切割效率降低，因而meganuclease技術(shù)的設(shè)計(jì)成本很高，目前尚無法推廣?；阡\ 指結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶（Zfn)，和基于Taleffector的TALEN技術(shù)都不存在上述的問題，由于DNA 識別域和切割域是分開的，研究者只需要專注于設(shè)計(jì)可以特異結(jié)合指定DNA序列的蛋白序 列。他們的相似之處還在于，都是把識別少數(shù)幾個(gè)堿基或者一個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)域模塊，進(jìn)行 串聯(lián)重復(fù)來實(shí)現(xiàn)對指定DNA序列的特異性識別，這就意味著遇到不同的DNA序列都要重新 構(gòu)建載體，但是將不同模塊的重復(fù)序列進(jìn)行拼接對于傳統(tǒng)的克隆方法是有挑戰(zhàn)的。最近新 發(fā)明的基于 CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedSmallPalindromicRepeats)/ Cas(CRISPRassociatatedsystem)系統(tǒng)的基因組編輯方法顯示了更大的潛力。CRISPR/ Cas系統(tǒng)最近發(fā)現(xiàn)是廣泛存在于原核生物中的一套針對外源DNA分子的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)， 在真細(xì)菌和古菌中負(fù)責(zé)抵御噬菌體入侵，降解轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。該系統(tǒng)能夠在細(xì)胞初次被攻 擊后將入侵的DNA的部分序列有規(guī)律的整合到事先存在的CRISPR重復(fù)序列之間，稱為間 隔子（spacer),待到細(xì)胞再次受到攻擊時(shí)，這段序列被一同轉(zhuǎn)錄為小分子RNA-crRNA (CRISPRRNA)。對于CRISPRII型系統(tǒng)，還存在一個(gè)小分子RNA-tracrRNA與crRNA形成 二聚體，參與crRNA的加工，并與crRNA -同行使功能。同時(shí)與其他類型相比，CRISPR II 型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是最緊湊的：僅需要一個(gè)蛋白酶CAS9,便可以在crRNA: tracrRNA雙元分子的 指導(dǎo)下，由spacer序列入侵的DNA雙鏈中形成R-loop，隨后CAS9的兩個(gè)酶活位點(diǎn)對DNA 進(jìn)行序列特異的切割。為了正確的識別DNA分子，spacer序列下游（5' -3'方向）存在PAM (Protospacer Adjacent Motif)基序5' -NGG-3'，切割位點(diǎn)通常位于PAM上游3-4個(gè)核苷 酸的位置。為了方便表達(dá)載體的構(gòu)建，crRNA: tracrRNA雙元分子被進(jìn)一步融合為嵌合的 sgRNA (single guide RNA)，其5'端20nt是負(fù)責(zé)識別特定基因的區(qū)域。這樣只要同時(shí)在 細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)CAS9蛋白和sgRNA就可以實(shí)現(xiàn)對基因組DNA編輯。這種基于CRISPR/Cas系 統(tǒng)的技術(shù)不同于上述以蛋白質(zhì)為核心的技術(shù)，CRISPR/Cas系統(tǒng)對DNA進(jìn)行特異的切割是由 小分子RNA介導(dǎo)的，針對不同的靶標(biāo)基因，只需要設(shè)計(jì)不同的小分子RNA即可。有研究表明 負(fù)責(zé)識別特定基因的20nt可以分為兩個(gè)部分，5'端8nt由于遠(yuǎn)離將要識別的PAM序列，對 特異性貢獻(xiàn)很小，同時(shí)5' -NAG-3'類型的PAM也可以被一頂程度的識別。因而為了實(shí)現(xiàn)切 割的特異性，識別特定基因的20nt中，臨近PAM的12nt需要盡可能高的特異性，同時(shí)要可 慮如果使用5' -NAG-3'類型的PAM是否在基因組內(nèi)可以找到被識別的基因位點(diǎn)。
[0004] 在多種模式動(dòng)物和模式微生物中已經(jīng)證明，將該系統(tǒng)進(jìn)行改造和優(yōu)化表達(dá)可以實(shí) 現(xiàn)基因組的編輯，目前已經(jīng)發(fā)表的結(jié)果包括人的細(xì)胞系，小鼠，斑馬魚，果蠅，線蟲和酵母， 其中一些實(shí)驗(yàn)里，突變的效率甚至可以達(dá)到100%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種獲得水稻指定基因突變體的方法。把優(yōu)化后的CRISPR/Cas系 統(tǒng)應(yīng)用到水稻中產(chǎn)生指定基因的突變體，優(yōu)化后的CRISPR/Cas系統(tǒng)穩(wěn)定，突變效率高，該 方法在植物基因工程中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 本發(fā)明提供了一種CRISPR/Cas系統(tǒng)，包含優(yōu)化后的CAS9基因和優(yōu)化后的SgRNA， 其中：
[0007] 所述優(yōu)化后的CAS9基因的核昔酸序列如序列表中的SEQ IDNo : 1所不；
[0008] 上述優(yōu)化是針對CAS9蛋白在水稻中的表達(dá)，對來源于釀膿鏈球菌 (Streptococcuspyogenes)的核酸序列，進(jìn)行了密碼子優(yōu)化；
[0009] 所述優(yōu)化后的sgRNA(singleguideRNA)的核苷酸序列如序列表中的SEQID No: 2所示；
[0010] 上述優(yōu)化是針對sgRNA在水稻中的表達(dá)，對來源于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes)的sgRNA核酸序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)化。
[0011]進(jìn)一步地，所述優(yōu)化后的CAS9基因，在5'端融合了核定位信號。
[0012] 進(jìn)一步地，所述優(yōu)化后的sgRNA具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)，所述頸環(huán)結(jié)構(gòu)含有13個(gè)配對核苷 酸，用于結(jié)合CAS9基因，參見附圖2 (1)。
[0013] 進(jìn)一步地，上述CRISPR/Cas系統(tǒng)還包括優(yōu)化后的雙元crRNA: tracrRNA，參見附圖 2⑵。
[0014] 所述優(yōu)化后的雙元crRNA:tracrRNA的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No :3、SEQ ID No :4所示，其中，SEQ ID No :3所示是優(yōu)化后的crRNA的核苷酸序列；SEQ ID No :4所 示是優(yōu)化后的tracrRNA的核苷酸序列；
[0015] 上述優(yōu)化是針對雙元crRNA:tracrRNA在水稻中的表達(dá)，對來源于釀膿鏈球菌 (Streptococcuspyogenes)的雙元crRNA:tracrRNA核酸序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)化。.[0016] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，包含上述核苷酸序列以及與上述核苷酸序列操作性 相連的表達(dá)調(diào)控序列。
[0017] 進(jìn)一步地，所述表達(dá)調(diào)控序列包括組成型高表達(dá)的調(diào)控序列，例如驅(qū)動(dòng)CAS9表達(dá) 的玉米UBIQUITIN基因的啟動(dòng)子，以及驅(qū)動(dòng)guideRNA(sgRNA或雙元crRNA:tracrRNA)表 達(dá)的U3snoRNA基因的啟動(dòng)子。
[0018] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的優(yōu)化后的sgRNA的表達(dá)載體，能夠插入多個(gè)sgRNA及多個(gè) 基因。
[0019] 本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)好的針對水稻全基因組的特定基因的識別序列，并且提供了將 這些序列克隆到優(yōu)化后的sgRNA或雙元crRNA:tracrRNA的表達(dá)載體中，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的方 法。
[0020] 本發(fā)明還提供了利用構(gòu)建好的轉(zhuǎn)化載體獲得指定水稻基因突變體的方法，包括以 下步驟：
[0021] 1)獲得優(yōu)化后的CAS9基因的表達(dá)載體、優(yōu)化后的sgRNA或雙元crRNA:tracrRNA 的表達(dá)載體；
[0022] 2 )篩選特定基因的識別序列并將其分別克隆到優(yōu)化后的sgRNA或雙元 crRNA:tracrRNA的表達(dá)載體中；
[0023] 3)將步驟2)克隆得到的表達(dá)載體中與優(yōu)化后的CAS9基因的表達(dá)載體組裝為終載 體；
[0024] 4)將上述終載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞內(nèi)，獲得水稻指定基因突變體。
[0025] 進(jìn)一步地，篩選特定基因的識別序列包括特異性篩選和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性篩選。
[0026] 進(jìn)一步地，篩選特定基因的識別序列包括以下步驟：
[0027] i)選擇以5' -NGG-3'結(jié)尾的23nt序列，包含spacer的20nt和PAM的3nt，將包 含連續(xù)五個(gè)T的序列排除；
[0028] ii)將3'端的15個(gè)堿基，包含spacer的12nt和PAM的3nt，進(jìn)行BLAST或者 B0WTIE的比對，排除不特異的序列；
[0029]iii)將選好的20ntspacer序列與sgRNA序列融合，用RNAfold服務(wù)器進(jìn)行RNA二 級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。
[0030] 進(jìn)一步地，步驟i )中，所述N是A或T或C或G。
[0031] 本發(fā)明還提供了上述獲得指定水稻基因突變體的方法在編輯水稻基因組中的應(yīng) 用。
[0032]本發(fā)明的有益效果在于：
[0033]a)本發(fā)明提供的CRISPR/Cas系統(tǒng)中，載體分為兩部分，CAS9部分和guide RNA(sgRNA或雙元crRNA:tracrRNA)部分。通過LR反應(yīng)可以把這兩部分合為一個(gè)單獨(dú)的載 體，其中在guideRNA的載體上，可以選擇放置多個(gè)sgRNA或者在一個(gè)雙元crRNA:tracrRNA 中放置多個(gè)spacer，都可以達(dá)到同時(shí)針對多個(gè)基因的目的；
[0034] b)本發(fā)明提供的sgRNA與CAS9結(jié)合的部位（即頸環(huán)結(jié)構(gòu))更長，含有13個(gè)配對核 苷酸，RNA二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，效率更高；
[0035] c)本發(fā)明中使用的識別序列（spacer)，都是經(jīng)過RNA二級結(jié)構(gòu)折疊分析過的，從 而能夠保證頸環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及識別序列的高特異性；
[0036] d)本發(fā)明提供的方法，突變效率高，可以達(dá)到50%，在植物基因工程中有廣泛的應(yīng) 用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1 (1)顯示了本發(fā)明優(yōu)化后的CAS9的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。
[0038] 圖1 (2)顯示了本發(fā)明優(yōu)化后的sgRNA的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。
[0039] 圖1 (3)顯示了本發(fā)明優(yōu)化后的雙元crRNA:tracrRNA的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。
[0040] 圖2 (1)顯示了包含針對LAZY1基因的spacer的sgRNA的二級結(jié)構(gòu)示意圖。
[0041] 圖2 (2)顯不了包含針對CA01基因的spacer的雙兀crRNA:tracrRNA的二級結(jié) 構(gòu)示意圖。
[0042] 圖3 (1)顯示了本發(fā)明實(shí)施例帶有LAZY1基因的識別序列（spacer)的sgRNA和 雙元crRNA:tracrRNA折疊的二級結(jié)構(gòu)圖。虛線框表明了頸環(huán)結(jié)構(gòu)中可以形成A-U/G-C配 對的位置。
[0043] 圖3 (2)顯示了本發(fā)明實(shí)施例帶有CA01基因的識別序列（spacer)的sgRNA和雙 元crRNA:tracrRNA折疊的二級結(jié)構(gòu)圖。虛線框表明了頸環(huán)結(jié)構(gòu)中可以形成A-U/G-C配對 的位置。
[0044] 圖4 (1)顯示了本發(fā)明實(shí)施例LAZY1基因的識別位點(diǎn)相對于LAZY1基因的位置以 及實(shí)施例5中獲得的LAZY1基因突變體的突變位點(diǎn)，其中，PAM的序列由下劃線表示，spacer 序列為突出顯示部分；突變的位置(缺失和替換）為方框所示。
[0045] 圖4 (2)顯示了CA01基因的識別位點(diǎn)相對于CA01基因的位置以及實(shí)施例5中獲 得的CA01基因突變體的突變位點(diǎn)，其中，PAM的序列由下劃線表示，spacer序列為突出顯示 部分；突變的位置(缺失和替換）為方框所示。
[0046] 圖4(3)顯示了本發(fā)明實(shí)施例5中獲得的LAZY1基因突變體的突變位點(diǎn)，其中，PAM 的序列由下劃線表示，spacer序列為突出顯示部分。
[0047] 圖4 (4)顯示了本發(fā)明實(shí)施例5中獲得的LAZY1基因突變體的突變位點(diǎn)，其中， PPAM的序列由下劃線表示，spacer序列為突出顯示部分。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 實(shí)施例1、在水稻細(xì)胞核中高水平表達(dá)CAS9的載體和在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)小分子RNA 的載體的構(gòu)建。
[0049] Streptococcus pyogenes的CAS9基因序列首先在5'端融合了核定位信號，然 后整個(gè)編碼區(qū)針對水稻的基因表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化（SEQ ID No: 1)。然后用吉布森拼接 的方法把來自玉米的組成型啟動(dòng)子Ubi，CAS9,和35S終止子串聯(lián)在一起克隆到轉(zhuǎn)化載體 pH2GW7 (購自比利時(shí)根特大學(xué)http://gateway, psb. ugent. be/)中，同時(shí)替換了該載體自 帶的35S啟動(dòng)子。測序正確的載體命名為pH-Ubi-CAS9-7,如圖1 (1)所示。
[0050] Streptococcus pyogenes的sgRNA基因序列最大限度的模擬了雙兀 crRNA:tracrRNA的二級結(jié)構(gòu)，如圖3 (1)、圖3 (2)所示。將粳稻U3snRNA啟動(dòng)子序列后添 加兩個(gè)Bsal或者兩個(gè)BsmBI酶切位點(diǎn)以及8個(gè)連續(xù)的核苷酸T，作為終止子，通過Topo克隆 得到 Entry 載體。將兩個(gè) sgRNA (SEQ ID No:2)或者雙元 crRNA:tracrRNA (SEQ ID No:3、 SEQ ID No :4)分別克隆到Bsal和BsmBI內(nèi)部，如圖4 (1)、圖4 (2)所示，最后得到的載體 命名為 p〇S-sgRNA (SEQ ID No:18)和 pOS-cr-tracr (SEQ ID No:19、SEQ ID No:20)，分 別如圖1 (2)、圖1 (3)所示。在pOS-sgRNA和pOS-crRNA中依然保留了兩個(gè)Bsal或者兩 個(gè)BsmBI酶切位點(diǎn)用于克隆實(shí)施例2篩選的特定基因的識別序列。
[0051] 實(shí)施例2、篩選特定基因的識別序列（spacer)。
[0052] 毎個(gè)某閔的轉(zhuǎn)錄本序列從MSU/TIGR水稻某閔纟目數(shù)據(jù)庫中獲得（httD://rice. plantbiology.msu.edu/)。第一步選擇以 5'-NGG-3'結(jié)尾的 23nt 序列（spacer 的 20nt 和 PAM的3nt)，這里N是A/T/C/G任何一種。將包含連續(xù)五個(gè)T的序列排除。第二步，將3'端 的15個(gè)堿基，包含spacer的12nt和PAM的3nt，進(jìn)行BLAST或者B0WTIE的比對，排除不特 異的序列。重復(fù)第二步可以進(jìn)一步排除5'-NAG-3'PAM的非特異活性。包含全部水稻基因 的特異識別序列可以到ftp. cbi. pku. edu. cn/pub/supplementary_file/下載。根據(jù)這個(gè) 列表，我們挑出了針對CA01和LAZY1基因的特異識別序列。第三步，將選好的20nt spacer 序列與sgRNA序列融合，用RNAfold服務(wù)器進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。我們對二級結(jié)構(gòu)采 用的標(biāo)準(zhǔn)有兩點(diǎn)，一是穩(wěn)定的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，二是盡量不配對的spacer區(qū)。
[0053] 具體地，在spacer與sgRNA的其它序列沒有很強(qiáng)結(jié)合的情況下，一方面不會(huì)影響 sgRNA其它序列的正常折疊，保證sgRNA與CAS9結(jié)合的部位(頸環(huán)結(jié)構(gòu)）很穩(wěn)定，另一方面 防止了 spacer與sgRNA的其它序列結(jié)合而不能順利插入祀DNA雙鏈中。
[0054] 不特異序列的排除也是提高最終突變效率的一個(gè)重要因素。
[0055] 實(shí)施例3、針對CA01和LAZY1基因的特異識別序列的克隆。
[0056] 在選好的spacer的5'端加上5' -GGCA-3'，在選好的spacer的互補(bǔ)鏈5'端加上 5' -AAAC-3'，以針對CA01和LAZY1基因的特異識別序列為例：

【權(quán)利要求】
1. 一種CRISPR/Cas系統(tǒng)，包含優(yōu)化后的CAS9基因和優(yōu)化后的sgRNA，其中： 所述優(yōu)化后的CAS9基因的核昔酸序列如序列表中的SEQ ID No :1所不； 所述優(yōu)化后的sgRNA的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No :2所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其特征在于，所述優(yōu)化后的sgRNA具有頸環(huán) 結(jié)構(gòu)，所述頸環(huán)結(jié)構(gòu)含有13個(gè)配對核苷酸，用于結(jié)合CAS9基因。
3. 如權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其特征在于，還包括優(yōu)化后的雙元 crRNA:tracrRNA 〇
4. 如權(quán)利要求3所述的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其特征在于，所述優(yōu)化后的雙元 crRNA: tracrRNA的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No :3、SEQ ID No :4所示，其中，SEQ ID No :3所示是優(yōu)化后的crRNA的核苷酸序列；SEQ ID No :4所示是優(yōu)化后的tracrRNA的 核苷酸序列。
5. 表達(dá)載體，由權(quán)利要求1-4任一所述的CRISPR/Cas系統(tǒng)中的核苷酸序列以及與上述 核苷酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列構(gòu)成。
6. 如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)調(diào)控序列包括組成型高表達(dá) 的調(diào)控序列。
7. 如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體，包括優(yōu)化后的CAS9 基因的表達(dá)載體、優(yōu)化后的sgRNA的表達(dá)載體和優(yōu)化后的雙元crRNA: tracrRNA的表達(dá) 載體，其中優(yōu)化后的sgRNA的表達(dá)載體序列如序列表SEQ ID No :18所示，優(yōu)化后的雙元 crRNA:tracrRNA 的表達(dá)載體如序列表 SEQ ID No :19、SEQ ID No :20 所示。
8. -種獲得指定水稻基因突變體的方法，包括以下步驟： 1) 獲得權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體； 2) 篩選特定基因的識別序列并將其分別克隆到優(yōu)化后的sgRNA或雙元 crRNA:tracrRNA的表達(dá)載體中； 3) 將步驟2)克隆得到的表達(dá)載體中與優(yōu)化后的CAS9基因的表達(dá)載體組裝為終載體； 4) 將上述終載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞內(nèi)，獲得水稻指定基因突變體。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述篩選特定基因的識別序列包括識別序 列的特異性篩選和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性篩選。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，篩選特定基因的識別序列包括以下步驟： i) 選擇以5' -NGG-3'結(jié)尾的23nt序列，包含spacer的20nt和PAM的3nt，將包含連 續(xù)五個(gè)T的序列排除； ii) 將3'端的15個(gè)堿基，包含spacer的12nt和PAM的3nt，進(jìn)行BLAST或者B0WTIE 的比對，排除不特異的序列； iii) 將選好的20nt spacer序列與sgRNA序列融合，用RNAfold服務(wù)器進(jìn)行RNA二級 結(jié)構(gòu)的預(yù)測。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，步驟i )中，所述N是A或T或C或G。
12. 權(quán)利要求8-11任一所述的方法在編輯水稻基因組中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/31GK104450745SQ201310415047
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】瞿禮嘉, 苗靳, 郭冬姝, 張金喆, 黃清配, 秦跟基, 顧紅雅, 康定明 申請人:北京大學(xué)