人類抗-kir抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了用于調(diào)節(jié)受試者中免疫反應(yīng)的組合物和方法。更特別地，描述了調(diào)節(jié)哺乳動物受試者中NK細(xì)胞活性并允許增強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的人類抗體，以及具有與人類單克隆抗體1-7F9或14F1的那些相似的抗原結(jié)合特性的抗體。還描述了該抗體的片段和衍生物，以及含有該抗體的藥物組合物和它們的用途，尤其用于治療中，以增加受試者中NK細(xì)胞活性或細(xì)胞毒性。
【專利說明】人類抗-K IR抗體
[0001]本申請是申請日為2005年7月I日、申請?zhí)枮?00580022633.1、發(fā)明名稱為“人類抗-KIR抗體”的發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及人類抗體，以及其片段和衍生物，其與存在于NK細(xì)胞表面上的兩種或更多種抑制性KIR受體交叉反應(yīng)和/或阻斷它們，并且增強(qiáng)哺乳動物受試者或生物樣品中NK細(xì)胞細(xì)胞毒性。本發(fā)明還涉及制備該抗體、片段、變體和衍生物的方法；含有該抗體的藥物組合物；以及該分子及組合物的用途，尤其在治療中的用途，以增加受試者中NK細(xì)胞活性或細(xì)胞毒性。
【背景技術(shù)】
[0003]自然殺傷(NK)細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的一個亞群，涉及免疫和宿主免疫監(jiān)視系統(tǒng)。
[0004]NK細(xì)胞是在骨髓中從淋巴祖細(xì)胞發(fā)育的單核細(xì)胞，并且形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)特性典型地包括簇決定子(OTs)⑶16，⑶56，和/或⑶57的表達(dá)；細(xì)胞表面上α / β或gamma / δ TCR復(fù)合物的缺乏；結(jié)合并殺傷未能表達(dá)“自我”主要組織相容性復(fù)合體(MHC)/人白細(xì)胞抗原(HLA)蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞的能力；和殺傷表達(dá)活化NK受體的配體的腫瘤細(xì)胞或其它患病細(xì)胞的能力。NK細(xì)胞的特征在于其結(jié)合并殺傷幾種類型的腫瘤細(xì)胞系而不需要預(yù)先免疫或活化的能力。NK細(xì)胞也能釋放對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的可溶性蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子；而且能經(jīng)受多輪細(xì)胞分裂并產(chǎn)生具有與母細(xì)胞相似生物學(xué)特性的子細(xì)胞。在通過干擾素和/或細(xì)胞因子的活化后，通過需要在NK細(xì)胞和靶細(xì)胞之間直接的、物理接觸的機(jī)理，NK細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和由細(xì)胞內(nèi)病原體感染的細(xì)胞的裂解。靶細(xì)胞的裂解包括細(xì)胞毒性顆粒從NK細(xì)胞釋放到結(jié)合靶標(biāo)的表面上，以及效應(yīng)物蛋白例如穿孔素和粒酶B上，穿孔素和粒酶穿透靶標(biāo)質(zhì)膜并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或程序化細(xì)胞死亡。正常的健康細(xì)胞被保護(hù)免于被NK細(xì)胞裂解。
[0005]基于它們的生物學(xué)特性，在本領(lǐng)域已經(jīng)提議了不同的治療和疫苗策略，它們依靠NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)。然而，NK細(xì)胞活性通過包括刺激和抑制信號二者的復(fù)雜機(jī)制來調(diào)節(jié)。
[0006]簡要地，NK細(xì)胞的裂解活性是通過不同的細(xì)胞表面受體來調(diào)節(jié)的，該受體在與靶細(xì)胞上的配體相互作用后，轉(zhuǎn)導(dǎo)正或負(fù)細(xì)胞內(nèi)信號。通過這些受體傳輸?shù)恼拓?fù)信號之間的平衡，決定靶細(xì)胞是否被NK細(xì)胞裂解(殺傷)。NK細(xì)胞刺激性信號可以通過自然細(xì)胞毒性受體(NCR)例如NKp30、NKp44和NKp46 ；以及NKG2C受體、NKG2D受體、某些活化殺傷免疫球蛋白樣受體(KIRs)和其他活化NK受體進(jìn)行介導(dǎo)(Lanier, Annual Review ofImmunology2005 ；23:225-74)。NK細(xì)胞抑制性信號可以通過受體象Ly49，CD94/NKG2A，以及某些抑制性KIRs (其識別主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子)進(jìn)行介導(dǎo)( KMrre等，Nature 1986 ；319:675-8 ；Ohlen 等，Sciencel989 ；246:666-8)。這些抑制性受體結(jié)合存在于其他細(xì)胞上的MHC I類分子(包括HLA I類)的多態(tài)性決定簇并抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的裂解。
[0007]KIRs，有時也被稱作殺傷抑制性受體，已經(jīng)在人類和非人靈長類中進(jìn)行表征，并且是存在于某些淋巴細(xì)胞亞類，包括NK細(xì)胞和一些T細(xì)胞上的多態(tài)性I型跨膜分子。KIRs與MHCl類分子的α I和2域中的決定簇相互作用，并且如上所述，對NK細(xì)胞，獨(dú)特的KIRs為刺激性或抑制性。
[0008]對KIRs的命名是基于細(xì)胞外域的數(shù)目(KIR2D和KIR3D分別具有兩個和三個細(xì)胞外免疫球蛋白域)和胞質(zhì)尾區(qū)是長(KIR2DL或KIR3DL)或短(KIR2DS或KIR3DS)。在存在于單一個體中的NK群體中，所給的KIR的存在或缺少從一個NK細(xì)胞到另一個是變化的。在人類中，也存在相對高水平的KIR基因多態(tài)性，一些KIR等位基因存在于一些，但不是所有的個體中。在NK細(xì)胞上的KIR基因的表達(dá)是隨機(jī)調(diào)節(jié)的，意思是在所給的個體中，根據(jù)個體的基因型，所給的淋巴細(xì)胞可以表達(dá)一個、兩個或更多個不同的KIRs。單一個體的NK細(xì)胞典型地表達(dá)不同的KIRs組合，為全套NK細(xì)胞提供了對MHC I類分子的不同特異性。
[0009]當(dāng)結(jié)合到合適的配體時，某些KIR基因產(chǎn)物引起淋巴細(xì)胞活性的刺激。活化的KIRs全部有帶電的跨膜殘基的短胞質(zhì)尾區(qū)，其與具有免疫受體基于酪氨酸的活化基序(Motifs)(ITAMs)的銜接分子結(jié)合，ITAMs轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激性信號到NK細(xì)胞。相反，抑制性KIRs具有包含免疫受體基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的長胞質(zhì)尾區(qū)，在他們的MHC I類配體結(jié)合時，就轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制信號到NK細(xì)胞。已知的抑制性KIRs包括KIR2DL和KIR3DL亞家族成員。有兩個免疫球蛋白域的(KIR2DL)識別HLA — C同種異型:KIR2DL2 (原來叫做p58.2)和密切相關(guān)的等位基因產(chǎn)物KIR2DL3都識別“I群"HLA-C同種異型(包括HLA_Cwl、-3、-7和-8)，而 KIR2DL1 (ρ58.I)識別“2 群”HLA-C 同種異型(例如 HLA_Cw2、-4、-5 和-6)。KIR2DL1 的識別是通過在HLA-C等位基因的第80位存在賴氨酸殘基支配的。KIR2DL2和KIR2DL3識別是通過在HLA-C第80位存在天冬酰胺殘基支配的。重要地，絕大多數(shù)的HLA-C等位基因在第80位有天冬酰胺或賴氨酸殘基。因此，KIR2DL1、-2和-3共同地識別基本上所有的在人類中發(fā)現(xiàn)的HLA-C同種異型。一個KIR帶有三個免疫球蛋白域，KIR3DLl(p70)識別與HLA-Bw4等位基因共享的一個表位。最后，KIR3DL2(pl40)，帶有三個免疫球蛋白域分子的同型二聚體，識別HLA-A3和-All。
[0010]雖然多種抑制性KIRs和 /或其它MHC I類特異的抑制性受體(Moretta等，Eur JImmunogenet.1997 ；24(6):455-68 ;Valiante 等，Tmmunol Revl997 ； 155: 155-64 ；Lanier,Annu Rev Immunol 1998 ; 16:359-93)可以通過NK細(xì)胞共表達(dá),在任何所給個體的NK全部組成部分中，有僅僅表達(dá)單個KIR的細(xì)胞，并且因而僅被特異的MHC I類等位基因(或?qū)儆谕篗HC I類同種異型的等位基因)所抑制。人類MHC I類分子通常被稱為人組織相容性抗原(HLA) I類。
[0011]為相對于他們的靶標(biāo)不匹配的KIR配體，也就是，表達(dá)不識別宿主任何HLA分子KIRs的NK細(xì)胞種群或克隆，在白血病患者中在同種異體骨髓移植后已經(jīng)顯示介導(dǎo)強(qiáng)力、挽救生命的抗腫瘤反應(yīng)(Ruggeri等，Science2002, 295 =2097-2100)。人們認(rèn)為潛在的機(jī)理是HLA不匹配的造血移植導(dǎo)致表達(dá)KIR的供體來源的NK細(xì)胞的擴(kuò)張，其在接受體中不識別任何HLA配體，并且因而不通過KIR進(jìn)行抑制。這些同種異體NK克隆發(fā)揮強(qiáng)有力地抗腫瘤活性。在診斷為急性骨髓性白血病(AML)，并用KIR-MHC不匹配的單倍同一性的移植治療的患者中，該反應(yīng)非常強(qiáng)烈。通過藥理學(xué)治療患者再現(xiàn)該作用的一個途徑是施用阻斷KIR/HLA相互作用的試劑以活化患者的內(nèi)源性NK細(xì)胞。
[0012]對KIR2DL1特異的某些單克隆抗體已經(jīng)顯示阻斷KIR2DL1與“2群”HLA-C同種異型，例如HLA-Cw4的相互作用(Moretta等，J Exp Medl993 ；178 =597-604)，并且促進(jìn)了 NK介導(dǎo)的表達(dá)那些HLA-C同種異型的靶細(xì)胞的裂解。針對KIR2DL2/3，阻斷KIR2DL2/3與HLA-Cw3相互作用的單克隆抗體或類似的同種異型已經(jīng)進(jìn)行了描述(Moretta等，J ExpMedl993 ；178 =597-604)。對在臨床環(huán)境中使用，這樣的抗體是不理想的，因?yàn)閮煞N治療性單克隆抗體(mAbs)的開發(fā)和兩種這樣的抗體或選擇一種這樣抗體的施用(在適當(dāng)?shù)脑\斷之后)，將根據(jù)是否任何所給的患者表達(dá)I群或2群HLA-C同種異型，要求其治療所有潛在患者。
[0013]Watzl 等(Tissue Antigens2000 ；56:240-247)產(chǎn)生識別多種同種型 KIRs的交叉反應(yīng)鼠抗體，但那些抗體并不加強(qiáng)NK細(xì)胞的裂解活性。更進(jìn)一步，Spaggiari等(Blood2002 ；99:1706-1714 和 Blood2002；100:4098-4107)應(yīng)用許多針對不同KIRs的鼠單克隆抗體進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。已報道那些抗體之一，NKVSFl (也稱為Pan2D)識別 KIR2DLl(CD158a)、KIR2DL2(CD158b)和 KIR2DS4(ρ50.3)的共同表位。Shin 等(Hybridoma1999 ；18:521-7)也報道了生產(chǎn)兩種單克隆抗體，表示為A210和A803g，能結(jié)合所有的KIR2DL1、KIR2DL3和KIR2DS4。然而，對在阻斷患者NK細(xì)胞的抑制性KIRs中抗體的治療用途，抗體與之交叉反應(yīng)的活化KIR分子越少越好，因?yàn)榛罨荏w的阻斷可能損害NK細(xì)胞的刺激。因而，具有NKVSFl、A210或A803g抗原結(jié)合特征的抗體在臨床環(huán)境中將不是最佳的。另外，在治療人類患者中使用鼠單克隆抗體可能導(dǎo)致宿主對抗該抗體的免疫反應(yīng)，因而損害治療的效力。
[0014]因此在本領(lǐng)域中，到目前為止還沒有使用于治療性調(diào)節(jié)抑制性KIRs的實(shí)用和有效的手段成為可利用的手段。
[0015]發(fā)明概述
[0016]本發(fā)明提供了新的和有用的人類抗體，其特異地結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一個，或結(jié)合這些KIRs的全部三個，和/或通過阻斷在一個或多個這種KIRs和HLA-C之間的相互作用，加強(qiáng)NK細(xì)胞裂解活性的人類抗體。也提供了這類抗體的片段和衍生物。本發(fā)明也與新的、有用的抗體、抗體片段和抗體的衍生物有關(guān)，其含有與如在本文描述的人類抗體1-7F9和1-4F1的那些實(shí)質(zhì)上相同的VH和VL序列。本發(fā)明也提供了含有編碼這類抗體的核苷酸序列的核酸、含有這類核酸的載體、含有這類核酸和/或載體的宿主細(xì)胞和生物體，和組合物，例如藥學(xué)上可接受的組合物和試劑盒，其含有這些蛋白質(zhì)、核酸、載體和/或細(xì)胞和典型地含一種或多種附加成分，這些附加成分可以是促進(jìn)組合物的配制、輸送、穩(wěn)定性或其他特征的活性或非活性成分(例如不同的載體)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了不同的新的和有用的制造和使用這類抗體、核酸、載體、細(xì)胞、生物體和/或組合物的方法，例如在KIR介導(dǎo)的生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)中，例如與其在相關(guān)的疾病的治療中。
[0017]在一方面，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一個，但不結(jié)合KIR2DS4的人類或人源化抗體。在一個【具體實(shí)施方式】中，抗體進(jìn)一步不結(jié)合KIR2DS3。在另一個【具體實(shí)施方式】中，人類或人源化抗體阻斷KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一個結(jié)合I類HLA-C分子。在進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，抗體可能阻斷HLA-Cw4分子結(jié)合KIR2DL1，和HLA-Cw3分子結(jié)合KIR2DL2或KIR2DL3中的至少一個。例如，抗體可以阻斷HLA-Cw4分子結(jié)合KIR2DL1胞外部分(SEQ ID NO:23)的M44，F(xiàn)45和D72殘基。在還有另一個【具體實(shí)施方式】中，抗體加強(qiáng)了 NK細(xì)胞針對表達(dá)I類HLA-C分子的人類靶細(xì)胞的裂解活性。
[0018]在另一方面，本發(fā)明提供了在與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一個結(jié)合中，與包含含有SEQ ID NO: 15氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和含有SEQ ID N0:17氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體競爭的人類或人源化抗體。在一個【具體實(shí)施方式】中，在與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一個結(jié)合中，該抗體與包含含有SEQ ID NO:15氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:17氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體競爭。在另一個【具體實(shí)施方式】中，該抗體包含含有SEQ ID NO:15氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在還有另一個【具體實(shí)施方式】中，該抗體含有(a)對應(yīng)于SEQ ID NO:17的31-35殘基的重鏈⑶Rl氨基酸序列；(b)對應(yīng)于SEQ ID NO:17的50-65殘基的重鏈CDR2氨基酸序列；和(c)對應(yīng)于SEQ ID NO:17的99-112殘基的重鏈⑶R3氨基酸序列。例如，該抗體可以包含含有SEQ ID N0:17氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
[0019]在另一方面，本發(fā)明提供了分離的結(jié)合KIR2DL1表位的人類或人源化抗體，該表位實(shí)質(zhì)上含有 L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88
氣基酸殘基。
[0020]在另一方面，本發(fā)明提供了分離的人類或人源化抗體，其具有對KIR2DL1解離常數(shù)(Kd)不大于大約0.45nM和/或?qū)IR2DL3的Kd不大于大約0.025nM。
[0021]本發(fā)明也提供了人類或人源化抗體或抗體片段，或其衍生物，其單獨(dú)或以任意適當(dāng)?shù)慕M合具有任意上述特性。在一個【具體實(shí)施方式】中，抗體為單克隆抗體。在另一個【具體實(shí)施方式】中，抗體為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體。例如，抗體可以為IgG4抗體。
[0022]本發(fā)明也提供了編碼具有任意上述特性的人類或人源化抗體或抗體片段的核酸、含有這種核酸的載體、含有這種載體的細(xì)胞，和生產(chǎn)人類抗KIR抗體的方法，包含在適于表達(dá)抗KIR抗體的條件下培養(yǎng)這種細(xì)胞。
[0023]本發(fā)明也提供了藥物組合物，它含有具有一種或多種上述特性，或通過任意方法生產(chǎn)，以在患者中有效可檢測地加強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的量的人類或人源化抗體或抗體片段，和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。該組合物可以，例如含有吐溫-80、蔗糖或吐溫-80和
蔗糖二者。
[0024]本發(fā)明也提供了在需要它的受試者中加強(qiáng)NK細(xì)胞活性的方法，該方法包括給受試者施用有效量的任意上述的組合物。在一個【具體實(shí)施方式】中，受試者是患有癌癥的患者。例如，患者可以患有選自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非何杰金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤的癌癥。或者，患者可以患有選自結(jié)直腸癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和惡性黑色素瘤的癌癥。在另一個【具體實(shí)施方式】中，受試者是患有感染性疾病的患者。還有另一個【具體實(shí)施方式】中，該方法進(jìn)一步包括施用選自免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥劑、化學(xué)治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、結(jié)合抑制性KIR的第二抗體、抗感染藥、靶向劑和輔助化合物的治療藥。
[0025]應(yīng)該理解，本發(fā)明“提供”的抗體或本發(fā)明“涉及”抗體等等的描述，也含蓄地，指的是在本文描述的創(chuàng)造性方法的實(shí)踐中可能有用的抗體，除非另作說明或明顯地與上下文相矛盾。
[0026]本發(fā)明的這些和其它方面和特征在本文進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027]附圖簡要說明[0028]圖1描述了結(jié)合不同人KIR2DL受體的共同決定簇的鼠單克隆抗體DF200。(A)克隆 CP11、KIR2DL1+、DF200 ； (B)克隆 CP502、KIR2DL3+ ； (C)克隆 CP11、KIR2DL1+、抗 KIR2DL1 ；(D)克隆 CP5。2、KIR2DL3+、抗 KIR2DL2/3。
[0029]圖2描述了鼠單克隆抗體DF200，其中和KIR2DL1介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Cw4表達(dá)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性抑制，顯示在C1R-Cw4靶上用抗KIR mAb的裂解的重建，效應(yīng)物/靶(E/T)t匕率為4/1。
[0030]圖 3 描述了對 KIR2DL1 (mAbs EB6 和 XA-141)或 KIR2DL2/3 (mAbs GL183 和 Y249)特異的鼠單克隆抗體DF200，DF200的Fab片段和常規(guī)鼠抗體，其中和KIR2DL1介導(dǎo)的對Cw4陽性靶細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制，和KIR2DL2/3介導(dǎo)的對Cw3陽性靶細(xì)胞的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制。(A)和(C)KIR2DL1+，靶細(xì)胞 721.221-Cw4+。(B)KIR2DL2+，靶細(xì)胞 72L 221_Cw3+。(D)KIR2DL3+，靶細(xì)胞 721.221_Cw3+。
[0031]圖4描述了通過NK細(xì)胞的細(xì)胞裂解的重建，該NK細(xì)胞在DF200和EB6抗體的卩(&13’)2片段存在時，表達(dá)針對!11^-0￥4陽性靶細(xì)胞的KIR2DL1。(A)靶細(xì)胞721.221_Cw4 ；E/T比=1。(B)革巴細(xì)胞B-EBV細(xì)胞表達(dá)性Cw4, E/T比=2。
[0032]圖5描述了通過交叉反應(yīng)性鼠(DF200和NKVSFl (Pan2D))和人(1-7F9、1-4F1、1-6F5和l-6Fl)mAbs，以及鼠常規(guī)KIR2DL1特異性mAb(EB6)的NK介導(dǎo)的殺傷作用的誘導(dǎo)。這些mAbs通過用HLA-Cw4轉(zhuǎn)染的721.221靶細(xì)胞的表達(dá)KIR2DL1的NK細(xì)胞(YTS-KIR2DL1)誘導(dǎo)(重建)殺傷作用。E/T 比=1。(A) 30 μ g/ml mAb。(B) 10 μ g/ml mAb。
[0033]圖6描述了通過與圖5中相同的抗體誘導(dǎo)NK介導(dǎo)的殺傷作用。mAbs通過表達(dá)內(nèi)源性HLA-Cw4的B-EBV細(xì)胞的表達(dá)KIR2DL1的NK細(xì)胞(YTS-KIR2DL1)誘導(dǎo)(重建)殺傷作用。E/T 比=2。(A) 30 μ g/ml mAb。(B) 10 μ g/ml mAb。
[0034]圖7描述了表位圖，其顯示了用對KIR2DL1的抗KIR抗體，通過表面細(xì)胞質(zhì)基因共振(BIAcore?)分析獲得的競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中在結(jié)合KIR2DL1中，重疊環(huán)指的是mAbs之中的重疊。結(jié)果顯示在KIR2DL1上，1-7F9與EB6和1-4F1競爭，但不與NKVSFl (Pan2D)和 DF200 競爭?？贵w 1-4F1 依次與 EB6、DF200、NKVSF1 (Pan2D)和 1-7F9 競爭。在 KIR2DL1 上，抗體 NKVSFl(Pan2D)與 DF200、1-4F1 和 EB6 競爭，但不與 1-7F9 競爭。在 KIR2DL1 上，DF200 與 NKVSFl (Pan2D)、1-4F1 和 EB6 競爭，但不與 1-7F9 競爭。
[0035]圖8描述了表位圖，其顯示了用對KIR2DL3的抗KiR抗體，通過BIAcore?分析獲得的競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中重疊環(huán)指的是在結(jié)合KIR2DL3中的重疊。結(jié)果顯示在KIR2DL3 上，1-4F1 與 NKVSFl (Pan2D)、DF200、gll83 和 1-7F9 競爭。在 KIR2DL3 上，1-7F9 與DF200, gll83，和 1-4F1 競爭，但不與 NKVSFl (Pan2D)競爭。在 KIR2DL3 上，NKVSFl (Pan2D)與DF200U-4F1 和 GL183 競爭，但不與 1-7F9 競爭。在 KIR2DL3 上，DF200 與 NKVSFl (Pan2D)、1-4F1和1-7F9競爭，但不與GL183競爭。
[0036]圖9描述了表位圖，其顯示了用對KIR2DS1的抗KiR抗體，通過BI Acore?分析獲得的競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中重疊環(huán)指的是在結(jié)合KIR2DS1中的重疊。結(jié)果顯示在KIR2DS1 上，抗體 1-4F1 與 NKVSFl (Pan2D)、DF200 和 1-7F9 競爭。在 KIR2DS1 上，抗體 1-7F9與 1-4F1 競爭，但與 DF200 和 NKVSFl (Pan2D)不競爭。在 KIR2DS1 上，NKVSFl 與 DF200 和1-4F1競爭，但不與1-7F9競爭。在KIR2DS1上，DF200與NKVSFl和1-4F1競爭，但不與1-7F9競爭 。[0037]圖10描述了證明mAb結(jié)合獼猴NK細(xì)胞的Pan2D (NKVSFl)mAb滴定。獼猴NK細(xì)胞(第16天的NK團(tuán)塊)用不同量的NKVSFl (Pan2D)mAb孵育，繼之以PE結(jié)合的山羊F(ab’)2片段抗鼠IgG(H+L)抗體。陽性細(xì)胞的百分比用同種型對照(純化的小鼠IgGl)確定。樣品制作一式兩份，平均熒光強(qiáng)度=MFI。
[0038]圖11顯示了可溶性KIR2DL1和KIR2DL1 (R131W)突變體與細(xì)胞的結(jié)合。(A)增加濃度的可溶性KIR2DL1-Fc，和KIR2DL1 (R131W) -hFc突變體與表達(dá)HLA_Cw3或-Cw4的細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)合的KIR-Fc蛋白質(zhì)使用熒光染料結(jié)合的二抗體進(jìn)行檢測，并通過流式細(xì)胞儀顯示。平均熒光顯示于 y 軸。(B)指示的抗KIRmAbs(GL183、EB6、DF200 和Pan2D(NKVSFl))結(jié)合KIR2DL1-FC和2DL1(R131W)突變體蛋白質(zhì)，使用人免疫球蛋白作為對照。該圖顯示DF200和Pan2D (NKVSFl)結(jié)合突變體稍差于野生型KIR2DLl_Fc，提示兩個mAbs受到R131W突變的影響。因此，在KIR2DL1上，對DF200和Pan2D，R131是構(gòu)成表位的殘基之一。
[0039]圖12提供了抗體DF200和Pan2D (NKVSFl)的輕鏈可變區(qū)和輕鏈⑶Rs氨基酸序列的比對。(A)DF200 (SEQ ID NO:1)和 Pan_2D(SEQ ID NO:2)的抗 KIR 可變輕(VL)區(qū)的比對。上述氨基酸序列數(shù)目提示了分別對于在未成熟的(未分泌)免疫球蛋白中翻譯Met (+1)的起始的位置。(B)CDR-Ll序列的比對。前殘基:通常為半胱氨酸(Cys)。之后殘基:色氨M (Trp)0典型地Trp-Tyr-Leu。長度:10-17氨基酸(aa)。(C)CDR_L2序列的比對。之前殘基:通常為Ile-Tyr。長度:7aa。開始ADR-Ll末端后大約16aa。開始:從分泌蛋白開始大約24aa。(D)CDR_L3序列的比對。之前殘基:Cys。之后殘基:Phe-Gly-XXX-Gly。長度:7-1 laa。開始:CDR_L2末端后大約33aa。
[0040]圖13提供了抗體DF200的重鏈可變區(qū)和重鏈CDRs。(A)DF_200VH區(qū)，未成熟蛋白質(zhì)。分泌的、成熟VH開始于2 0位:殘基Q。VH區(qū)末端為殘基S而且此后恒定區(qū)(未顯示)繼續(xù)。(B)CDR-Hl。之前殘基:Cys-XXX-XXX-XXX。之后殘基:Trp。通常為Trp-Val或Trp-1le。長度:10_14aa。開始:從分泌的蛋白質(zhì)開始大約22_26aa。(C)CDR_H2。之前殘基:Leu-Glu-Trp-1Ie-Gly但是其他變體是可能的。之后殘基:Lys或Arg/Leu或Ile或Val 或 Phe 或 Thr 或 Ala/Thr 或 Ser 或 Ile 或 Ala。長度:16_20aa。開始:CDR_H1 末端后大約15aa。(D)CDR-H3。之前殘基:Cys-XXX-XXX(典型地為Cys-Ala-Arg)。之后殘基:Trp-Gly-XXX-Gly。長度:3_25aa。開始:CDR_H2 末端后大約 33。
[0041]圖14描述了人類抗體1-7F9的VH和VL序列的核苷酸和氨基酸序列。(A)HuKIRl-7F9成熟可變輕鏈的翻譯。(B)編碼HuKIRl_7F9成熟可變輕鏈的核苷酸序列。(C)HuKIRl-7F9成熟可變重鏈的翻譯。(D)編碼HuKIRl_7F9成熟重鏈的核苷酸序列。
[0042]圖15 顯示了單克隆抗體 1-7F9、DF200 (VH 序列:SEQ ID NO:19 ；VL 序列:SEQ IDNO:21)和 Pan2D (NKVSF1 ；VH 序列:SEQ ID NO:20 ；VL 序列:SEQ ID NO:22)的 VH 和 VL 的氨基酸序列。⑶Rs是盒狀的。
[0043]圖16描述了流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)，其顯示鼠抗體，Pan2D(NKVSFl)和人類mAbsl_7F9和1-4F1 結(jié)合用 KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3 或 KIR2DS4 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如所提示(純化的抗體:1 μ g/ml)。(A)-(R)NKVSFl (pan2D)、1-7F9 和 1-4F1 全部結(jié)合KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DS1 和 KIR2DS2。它們都不結(jié)合 KIR2DS3。NKVSF1，但不是 1-7F9 或 1-4F1，結(jié)合 KIR2DS4。
[0044]圖17描述了 FACS分析結(jié)果。㈧抗體介導(dǎo)的在細(xì)胞上可溶性KIR-Fc結(jié)合HLA-Cw4的中和作用，通過流式細(xì)胞儀(FACS)進(jìn)行檢測。在用不同濃度的交叉反應(yīng)的mAb DF200 或 KIR2DL2/3-特異的 mAb GL183 預(yù)孵育后，F(xiàn)ACS-測量 KIR2DLl_mFc 結(jié)合LCL721.221-Cw4細(xì)胞。DF200，但不是GL183降低了 KIR2DL1結(jié)合HLA_Cw4。測量以抑制性抗體缺乏時KIR2DLl-hFc-結(jié)合百分比進(jìn)行作圖。(B)在用不同濃度的1-1F4和1-7F9預(yù)孵育后，結(jié)合LCL721.221-Cw4細(xì)胞的KIR2DLl_mFc的FACS-測量。測量以抑制性抗體缺乏時KIR2DLl-mFc-結(jié)合百分比進(jìn)行繪圖。
[0045]圖18描述了 51Cr-釋放細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果。(A)以不同的E:T比率，YTS細(xì)胞(菱形)和YTS-2DL1細(xì)胞(三角)可以有效地殺傷LCL721.221-03細(xì)胞。與此相反，YTS細(xì)胞(正方形)可以有效地殺傷LCL721.221-04細(xì)胞，但是，由于KIR-限制，YTS-2DL1細(xì)胞(十字)不能將其殺傷。(B)在缺乏抗體時，YTS-2DL1細(xì)胞不能殺傷LCL-721.221_Cw4(Ε:T比率12:1)。1-7F9誘導(dǎo)YTS-2DL1細(xì)胞以劑量依賴方式殺傷LCL721.221_Cw4細(xì)胞。
[0046]圖19描述了兩個晶體復(fù)合結(jié)構(gòu)的疊加；KIR2DLl/l-7F9Fab’和KIR2DL1/MHC I類，PDB-編碼 lM9(Fan 等，Nat.1mmunol.2001 ；2:452-460)，使用普通 KIR 分子(標(biāo)記 ‘KIR’)的Ca-原子作為模板。KIR2DLl/l-7F9Fab’顯示為灰色線狀帶型而KIR2DL1/MHC I類為黑色管狀型。l_7F9Fab’標(biāo)記為‘1-7F9’而MHC I類標(biāo)記為‘MHC’。可以看到在在疊加中MHC和Fab’之間的重疊，證明l_7F9Fab’阻礙MHC I類結(jié)合KIR2DL1受體的能力。見實(shí)施例11。
[0047]圖20顯示KIR2DL1上1-7F9的結(jié)合表位，如在KIR2DL1序列中所提示。從1-7F9，在4.0人距離之內(nèi)的氨基酸以灰色和黑色背景突出。通過黑色背景突出的氨基酸參與氫鍵結(jié)合至1-7F9。
[0048]定義
[0049]為了方便，在本文定義幾個術(shù)語。然而，在本文提供的定義術(shù)語的列表不是全部的。其他術(shù)語可以在本發(fā)明說明書中進(jìn)行定義。
[0050]在本發(fā)明的上下文中，“活性的”NK細(xì)胞指的是生物學(xué)活性的NK細(xì)胞，包括具有裂解靶細(xì)胞和增強(qiáng)其他細(xì)胞免疫功能的能力的NK細(xì)胞。例如，“活性的”NK細(xì)胞可以能夠殺傷表達(dá)活化NK受體的配體和/或不能表達(dá)由NK細(xì)胞上的KIR識別的MHC/HLA抗原的細(xì)胞。NK細(xì)胞可以通過不同的本領(lǐng)域已知技術(shù)獲得，例如從血液樣品、細(xì)胞單采法、組織或細(xì)胞采集等中分離。在自然殺傷細(xì)胞方案(Natural Killer Cells Protocols) (Campbell KS和Colonna M編輯^Human Press, pp.219-238 (2000)中可以發(fā)現(xiàn)關(guān)于涉及NK細(xì)胞的試驗(yàn)的有用方案。
[0051]如在本文所使用，“殺傷免疫球蛋白樣受體”、“殺傷抑制性受體”或“KIR”指的是由為KIR基因家族成員的基因或從這種基因制備的cDNA編碼的蛋白質(zhì)或多肽。KIR基因家族的詳細(xì)的評論，包括KIR基因和KIR基因產(chǎn)物命名，和典型KIRs的Genbank登記號，是 M.Carrington 和 P.Norman 的“KIR 基因族”(“The KIR Gene Cluster”)，其可以在NCBI網(wǎng)站稱為“書架(Bookshelf )”中獲得(可通過萬維網(wǎng)(WWW)地址ncb1.nlm.nih.gov/books獲得)。人類KIR基因和cDNAs序列，以及他們的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可以在公共數(shù)據(jù)庫，包括GenBank中取得。人類KIRs的非限制性代表性GenBank入口有下列登記號:KIR2DL1:Genbank 登記號 U24076、NM_014218、AAR16197 或 L41267 ；KIR2DL2 =Genbank 登記號 U24075或 L76669 ；KIR2DL3 =Genbank 登記號 U24074 或 L41268 ；KIR2DL4 =Genbank 登記號 X97229 ；KIR2DS1 =Genbank 登記號 X89892 ；KIR2DS2 =Genbank 登記號 L76667 ；KIR2DS3 =Genbank 登記號 NM_012312 或 L76670(剪接變體)；KIR3DL1:Genbank 登記號 L41269 ;和 KIR2DS4:Genbank登記號AAR26325。KIR可以含有從I到3細(xì)胞外域，并可有長(也就是超過40個氨基酸)或短(也就是少于40個氨基酸)的胞質(zhì)尾區(qū)。在本文如前所述，這些特征決定了KIR的命名。代表性的KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS4分子分別含有下列氨基酸序列:
[0052]KIR2DL1 胞外域:
[0053]HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQXGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH (SEQ ID NO:23)，其中“X”在16位為P或R，并且其中“X”在114位為P或L，代表等位基
因變體。
[0054]KIR2DL2 胞外域:
[0055]HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVIGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH(SEQ ID NO:24)
[0056]KIR2DL3 胞外域:
[0057]HEGVHRKPSLLAHP GPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLH (SEQ ID NO:25).[0058]KIR2DS4 胞外域:
[0059]QEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV(SEQ ID NO:38)
[0060]術(shù)語“KIR2DL2/3”指的是KIR2DL2和KIR2DL3兩個受體或其任一受體。這兩個受體具有很高的同源性，它們是相同基因的等位基因形式，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為功能上是相似的。
[0061]除非另有說明，術(shù)語“MHC”包含所有哺乳動物的MHC分子，而“HLA”分子指的是人類MHC分子。
[0062]在本發(fā)明上下文中，聲明抗體“結(jié)合”決定簇(也就是在抗體上下文中單詞“結(jié)合”:決定簇相互作用)指的是抗體帶有特異性和/或親和力結(jié)合決定簇。例如GL183是結(jié)合KIR2DL2/3的常規(guī)單克隆抗體。EB6是結(jié)合KIR2DL1的常規(guī)單克隆抗體。EB6和GL183兩個可以在商業(yè)上取得(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)。
[0063]“交叉反應(yīng)性”抗-KIR抗體是帶有特異性和/或親合性結(jié)合超過一個KIR分子的抗體。例如，DF200和1-7F9是與KIR2DL1、-2和-3交叉反應(yīng)的單克隆抗體。產(chǎn)生抗體DF200的雜交瘤已經(jīng)在CNCM培養(yǎng)物收集中心保藏，鑒定號"DF200"，注冊號CNCM 1-3224，2004 年 6 月 10 日注冊，Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724Paris Cedexl5,法國。NKVSF1,在本文也稱“Pan2D”，與KIR2DLl、-2和-3和KIR2DS4交叉反應(yīng)。該抗體可從Serotec (CergySainte-Christophe, France)商業(yè)獲得，目錄參考號碼為 MCA2243。[0064]“特異結(jié)合”或“特異性”指抗體或其他物質(zhì)可檢測到的結(jié)合存在于抗原，例如KIR上的表位的能力，而同其他蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)(例如存在于NK細(xì)胞，或其他細(xì)胞類型上的其他蛋白質(zhì))有相對很小的可檢測到的反應(yīng)性。特異性可以通過結(jié)合或競爭性結(jié)合試驗(yàn)，使用例如在本文別處描述的Biacore儀器，相對地進(jìn)行確定。在結(jié)合特異性抗原相對非特異性結(jié)合其他不相關(guān)分子(在這種情況下特異性抗原是KIR)，特異性可以通過例如大約10:1、大約20:1、大約50:1、大約100:1、10000:1或更大比率的親和力/親合力來顯示。對存在于特殊生物，例如人類的NK細(xì)胞上KIR特異的KIR結(jié)合抗體，有時可以顯示對其他物種類似的KIRs結(jié)合(也就是，KIR結(jié)合抗體，或其他KIR結(jié)合性物質(zhì)，可以與不同物種的KIRs交叉反應(yīng))。
[0065]“選擇性”指的是與一個或多個其他生物學(xué)分子、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、組織等對比，蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合特殊區(qū)域、靶標(biāo)或肽。KIR結(jié)合抗體對在特殊生物中(例如與在靈長類中對比，在人類中)產(chǎn)生的KIRJP /或?qū)μ厥忸愋偷腒IR(例如帶有長胞質(zhì)尾區(qū)的KIR)，特別是該抗體與在特殊生物中產(chǎn)生的超過一種類型的KIR交叉反應(yīng)，和/或KIR的特殊部分(例如特殊表位或抗原決定簇區(qū)域)也可以是選擇性的。例如，選擇性可以通過競爭性ELISA或Biacore測試進(jìn)行確定。標(biāo)記選擇性的親和力/親合力中差異可以是任意可檢測到的優(yōu)選(例如，超過1: 1.1，或超過大約1:5的比率，如果可檢測到，將是適合的，包括1:10、1 =IOOU:1000或更多)。除非另有說明，在本文介紹的對“親和力”的任何定量資料指的是二價(與單價對比)結(jié)合的測量。
[0066]“表位”或“結(jié)合部位”是抗原上抗原結(jié)合肽(例如抗體)特異地結(jié)合的范圍或區(qū)域。蛋白質(zhì)表位可以含有直接參與結(jié)合的氨基酸殘基(也稱作表位的優(yōu)勢免疫成分)和其他氨基酸殘基，其不直接參與結(jié)合，例如由特異性抗原結(jié)合肽有效阻斷的氨基酸殘基(換句話說，氨基酸殘基是在特異性抗原結(jié)合肽的“足跡”內(nèi))。根據(jù)本發(fā)明，在本文術(shù)語表位包括KIR的任意特殊區(qū)域中兩種類型的氨基酸結(jié)合部位，該部位特異地結(jié)合抗KIR抗體，或另外的KIR特異性物質(zhì)，除非另作說明(例如，在本發(fā)明的一些上下文中涉及直接結(jié)合特殊氨基酸殘基的抗體)。KIRs可以含有許多不同的表位，其可以包括，不限于，(I)線型肽抗原決定簇，(2)在成熟KIR構(gòu)象中，由一個或多個位置互相接近非毗連氨基酸組成的構(gòu)象抗原決定簇；和(3)翻譯后抗原決定簇，其存于共價連接到KIR的在全部或部分分子結(jié)構(gòu)中，例如碳水化合物基團(tuán)。
[0067]短語第一抗體與第二抗體結(jié)合“實(shí)質(zhì)上”或“至少部分地”相同表位，意思是第一抗體的表位結(jié)合部位含有構(gòu)成第二抗體表位結(jié)合部位的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多抗原上的氨基酸殘基。同樣，如上所述，第一抗體與第二抗體結(jié)合實(shí)質(zhì)上或部分相同的表位，意思是在結(jié)合抗原時第一和第二抗體競爭。因而，術(shù)語與單克隆抗體1-7F9—樣“結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同的表位或決定簇”，意思是抗體與1-7F9“競爭”。通常，與目標(biāo)單克隆抗體結(jié)合“實(shí)質(zhì)上相同表位或決定簇”的抗體(例如DF200、NKVSFl、1-7F9)，意思是抗體與所述目標(biāo)抗體“競爭”結(jié)合一個或多個KIR分子，優(yōu)選地選自由KIR2DL1和KIR2DL2/3組成組的KIR分子。在另一個例子中，與目標(biāo)抗體結(jié)合KIR2DL1分子上的實(shí)質(zhì)上相同表位或決定簇的抗體與目標(biāo)抗體“競爭”結(jié)合KIR2DL1。與目標(biāo)抗體結(jié)合KIR2DL2/3分子上的實(shí)質(zhì)上相同表位或決定簇的抗體與目標(biāo)抗體“競爭”結(jié)合KIR2DL2/3。
[0068]短語與目標(biāo)抗體“結(jié)合基本上相同的表位或決定簇”，意思是抗體與所述目標(biāo)抗體“競爭”與所述目標(biāo)抗體特異地結(jié)合的至少一個，或任意和所有KIR分子。短語與單克隆抗體1-7F9 “結(jié)合基本上相同的表位或決定簇”，意思是抗體與1-7F9 “競爭”與1-7F9特異地結(jié)合的至少一個，優(yōu)選地任意和所有KIR分子。例如，與單克隆抗體1-7F9或NKVSFl結(jié)合基本上相同的表位或決定簇的抗體能分別地與所述1-7F9或NKVSFl “競爭”結(jié)合KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DS1 和 KIR2DS2。
[0069]抗KIR抗體“阻斷” KIR分子和HLA分子結(jié)合的能力意思是，在使用可溶性或細(xì)胞表面結(jié)合的KIR和HLA分子的試驗(yàn)中，抗體能以劑量依賴的方式可檢測地降低KIR分子與HLA分子的結(jié)合，其中在缺乏抗體時，KIR分子可檢測地結(jié)合HLA分子。測定抗KIR抗體是否能夠進(jìn)行這種阻斷的代表性的試驗(yàn)在實(shí)施例8中提供。
[0070]抗KIR抗體“降低KIR抑制活性”、“促進(jìn)NK細(xì)胞活性”、“促進(jìn)NK細(xì)胞細(xì)胞毒性”、“促進(jìn)NK細(xì)胞”、“加強(qiáng)NK細(xì)胞活性”、“加強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒性”或“加強(qiáng)NK細(xì)胞”的能力意思是當(dāng)與抗體接觸時，表達(dá)KIR的NK細(xì)胞能夠裂解靶細(xì)胞，靶細(xì)胞在其表面表達(dá)為所述KIR配體的特殊MHC或HLA I類。例如，術(shù)語“NK細(xì)胞毒性增強(qiáng)”意思為NK細(xì)胞毒性的任何實(shí)質(zhì)性增強(qiáng)，或至少5%、10%,20%,30%或更大的增強(qiáng)，例如，當(dāng)與對照比較時，NK細(xì)胞毒性至少增強(qiáng)大約50% (例如，至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%,或至少大約95%)。這包括，例如，當(dāng)與對照比較時大約55-100%、大約65_100%、大約75-100%、大約80-100%或大約90-100%NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。同樣包括細(xì)胞毒性超過大約100%、超過大約500%、超過大約1000%、超過大約2000%或更高的增加。這可以例如在試驗(yàn)，例如標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性試驗(yàn)中測量，其中在存在NK增強(qiáng)劑(例如抗KIR mAb)比缺乏該增強(qiáng)劑(也就是對照)時，NK細(xì)胞裂解靶細(xì)胞更高的數(shù)量，達(dá)到更高的百分比。
`[0071]如在本文使用，術(shù)語“中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制作用”或“中和KIR的抑制活性”意思是當(dāng)用經(jīng)典的細(xì)胞毒性的鉻釋放試驗(yàn)測量時，增加特異性裂解至超過大約20%，優(yōu)選地至少大約30%，至少大約40%，至少大約50%，至少大約100%或更多的以相同的效應(yīng)物:靶細(xì)胞比率，用不能被它們的KIR阻斷的NK細(xì)胞或NK細(xì)胞系獲得的特異性裂解?！爸泻蚄IR介導(dǎo)的抑制作用”同樣意思為在鉻釋放試驗(yàn)，或其他細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，使用表達(dá)一種或幾種抑制性KIRs的NK細(xì)胞克隆或轉(zhuǎn)染子，和表達(dá)被NK細(xì)胞上的一種KIRs所識別的至少一個HLA I類等位基因的靶細(xì)胞，用抗體獲得的特異性裂解超過大約100%、優(yōu)選地至少大約101%、至少大約150%、至少大約200%或更多(例如大約101-150%、大約120-150%、大約120-200%、大約150-200%或大約200-1000%)，或更多的用相同濃度的NKVSFl (可從Serotec商業(yè)上獲得)，使用相同的NK細(xì)胞和靶細(xì)胞，以相同效應(yīng)物:靶細(xì)胞比率獲得的特異性裂解。
[0072]如在本文使用，術(shù)語“人類抗體”打算包括具有等于、基本上等于，或來源于人類種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。這類人類抗體可以包括不是由人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)或點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，如在本文使用，術(shù)語“人類抗體”，不打算包括其中來源于另一哺乳動物物種種系，例如小鼠的CDR序列已經(jīng)移植到人框架序列中的抗體。
[0073]在本發(fā)明的上下文中，除非另作說明，“治療”指的是預(yù)防、減輕、管理、治愈或減少疾病或障礙的一種或多種癥狀或臨床相關(guān)表現(xiàn)，除非同上下文相矛盾。例如其中沒有鑒定疾病或障礙的癥狀或臨床相關(guān)表現(xiàn)的患者的“治療”是預(yù)防性治療，而其中已經(jīng)鑒定疾病或障礙的癥狀或臨床相關(guān)表現(xiàn)的患者的“治療”通常不構(gòu)成預(yù)防性治療。盡管如此，應(yīng)該理解本發(fā)明不同的治療和預(yù)防方法和使用方面在許多方面彼此不同(例如輸送到受試者的化合物劑量、應(yīng)用時機(jī)、應(yīng)用動力等)而且可以各自認(rèn)為是本發(fā)明獨(dú)特的方面。
[0074]在本發(fā)明的上下文中，“癌癥”指的是任何腫瘤疾患，包括，但不限于這類細(xì)胞疾患象肉瘤、癌、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤，其可以包括乳腺、頭頸部、卵巢、膀胱、肺、咽、喉、食管、胃、小腸、肝、胰腺、結(jié)腸、女性生殖道、男性生殖道、前列腺、腎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的癌癥。
[0075]如在本文使用的術(shù)語“生物樣品”包括但不限于來源于人類或非人類哺乳動物的生物流體(例如血清、淋巴和血液)，細(xì)胞樣品或組織樣品(例如骨髓或腫瘤組織)。
[0076]在兩個氨基酸序列的上下文中，術(shù)語“實(shí)質(zhì)上相同”意思是該序列，當(dāng)最佳地比對時，例如通過使用默認(rèn)間隙重量(gap weights)的GAP或BESTFIT程序，共有至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%、至少大約98 %或至少大約99 %的序列同一性。在一個【具體實(shí)施方式】中，位置不相同的殘基，因保守氨基酸取代而不同(在本文在別處進(jìn)一步描述)。序列同一性典型地使用序列分析軟件進(jìn)行測量。蛋白質(zhì)分析軟件，使用分配給不同的取代、缺失和其他修飾，包括保守性氨基酸取代的相似性測量，匹配相似序列。例如可公開取得的GCG軟件包含序列例如"Gap"和"BestFit〃，其能以默認(rèn)的參數(shù)使用以確定密切相關(guān)的多肽，例如來自不同生物的物種的同源性多肽之間，或野生型蛋白質(zhì)和其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。見，例如GCG6.1版。多肽序列也可以使用FASTA，應(yīng)用默認(rèn)或推薦的參數(shù)進(jìn)行比較。GCG6.1版，F(xiàn)ASTA(例如FASTA2和FASTA3)中的程序提供了查詢和檢索序列之間最佳重疊的區(qū)域的比對和序列同一性百分比(Pearson, Methods Enzymo1.1990 ； 183:63-98 ；Pearson, MethodsMol.Biol.2000 ；132:185-219)。當(dāng)將序列與包含大量來自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較時，另一個優(yōu)選的算法是計算機(jī)程序BLAST，特別是blastp，使用默認(rèn)參數(shù)。見，例如，Altschul 等，J.Mol.Biol.1 990 ；215:403-410 ;Altschul 等，Nucleic Acids Res.1997 ；25:3389-402(1997);在本文通過參考將上述每一篇文獻(xiàn)并入本申請。在兩個實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列中，“對應(yīng)的”氨基酸位置是通過在本文提及的任意蛋白質(zhì)分析軟件，使用默認(rèn)參數(shù)比對的那些。
[0077]如在本文使用的“1-7F9樣”或“1-4F1樣”抗體意思是(I)與分別含有1-7F9或1-4F1的VH和VL序列的抗體實(shí)質(zhì)上結(jié)合相同表位的抗體，例如例如分別地為單克隆抗體1-7F9或1-4F1，和/或(2)含有分別與1-7F9或1-4F1的VH和VL序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的VH和VL序列的抗體。
[0078]“保守性”氨基酸取代是其中氨基酸殘基被有具有相似化學(xué)特性(例如，帶電或疏水性)的側(cè)鏈(“R-基團(tuán)”)的另外氨基酸殘基取代的取代。通常，保守性氨基酸取代將不實(shí)質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能特性。在通過保守性取代而導(dǎo)致氨基酸序列相互不同的情況下，序列同一性百分比可以因?yàn)槿〈谋Ｊ靥匦远蛏险{(diào)節(jié)校正。產(chǎn)生這種調(diào)整的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的。見，例如，Pearson, Methods Mol.Biol.1994 ；243:307-31。有相似化學(xué)特性的側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)的例子包括I)脂肪族側(cè)鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側(cè)鏈:絲氨酸和蘇氨酸；3)包含酰胺的側(cè)鏈:天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香側(cè)鏈:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈:賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈:天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫側(cè)鏈:半胱氨酸和蛋氨酸。代表性的保守氨基酸取代基團(tuán)包括:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0079]發(fā)明詳述
[0080]本發(fā)明基于結(jié)合抑制性KIRs的新交叉反應(yīng)性和中和抗體的產(chǎn)生，該抗體允許在人群中的大多數(shù)或所有個體中NK細(xì)胞的有效地活化。
[0081]在本文所描述的是，例如結(jié)合KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的全部并通過阻斷在這些KIRs和HLA-C之間的相互作用，加強(qiáng)NK細(xì)胞裂解活性的抗體。在本文將這類抗體稱為“交叉反應(yīng)和中和抗KIR mAbs”。
[0082]在特別方面，本發(fā)明涉及新的交叉反應(yīng)性、中和性或交叉反應(yīng)性和中和性二者、完全的人類抗KIR抗體，以及含有這種抗體的組合物和使用這種抗體或組合物的方法。這些抗體包括在申請于2004年7月I日的PCT/DK2004/000470中描述的人類抗體1-7F9和1-4F1，在本文通過參考將其全部并入本申請。
[0083]在本文描述的抗體、組合物和方法可以，除了其他方面之外，克服當(dāng)前與KIR的治療性調(diào)節(jié)和治療性NK細(xì)胞活化有關(guān)的局限性，并提供附加的有利特征和益處。例如抗體能夠與多種抑制性KIRs交叉反應(yīng)并降低或中和他們的抑制信號，通過表達(dá)這種抑制性KIR受體的NK細(xì)胞，導(dǎo)致NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。與多種KIR基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的能力可允許有效地使用本發(fā)明的抗體，在大多數(shù)或所有人類受試者中增加NK細(xì)胞活性，而沒有預(yù)先測定受試者的KIR或HLA類型的 負(fù)擔(dān)或花費(fèi)。在【具體實(shí)施方式】中，抗體不結(jié)合KIR2DS4，因此避免了與活化KIR2DS4受體的中和有關(guān)的刺激性潛能的降低。另外地或可選擇地，抗體不結(jié)合 KIR2DS3。
[0084]關(guān)于本發(fā)明的抗體，從這種抗體中，不同的抗體片段和衍生物同樣可以產(chǎn)生并用于在本文描述的相同或相似的目的，并且關(guān)于抗體所述的本發(fā)明的方面同等地應(yīng)用于抗體片段和衍生物，除非另作說明或明顯地與上下文相矛盾。換句話說，除非另外指出，在本文描述的本發(fā)明關(guān)于抗體的特征應(yīng)該，也含蓄地被理解為描述關(guān)于抗體片段或衍生物的相似特征，其中抗體片段或衍生物就特異性來說有相似功能性。然而，應(yīng)該認(rèn)識到“全長”抗體和抗體“片段”，由于它們的生物學(xué)和物理化學(xué)特性可能明顯不同，能被表征為本發(fā)明的區(qū)別性方面。
[0085]本發(fā)明的一些抗體能表征為“人類”，其典型地與對于被施用該抗體的人類受試者對該抗體的免疫反應(yīng)的低危險有關(guān)。在代表性的方面，描述了在實(shí)際上所有人中促進(jìn)人類NK細(xì)胞的活化的分離的抗體。在代表性的【具體實(shí)施方式】中，抗體為人類抗體1-7F9或人1-7F9樣抗體。
[0086]抗體、其片段或衍生物能與NK細(xì)胞表面的至少兩種抑制性KIR受體交叉反應(yīng)，減少或中和NK細(xì)胞的抑制性信號，并加強(qiáng)NK細(xì)胞的活性。例如抗體、抗體片段或衍生物可以結(jié)合人KIR2DL受體的共同決定簇，所以抗體、抗體片段或衍生物結(jié)合至少KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3受體。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“KIR2DL2/3”指的是KIR2DL2和KIR2DL3受體中任一種和二者。[0087]如在本文描述，抗KIR mAbsl-7F9和1-4F1相對于先前生產(chǎn)的抗KIR抗體有幾個優(yōu)勢。例如1-7F9和1-4F1是完全人類的，因而一旦給受試者施用，減少或最小化任何針對抗體的免疫反應(yīng)。此外，如下面所述，1-7F9和1-4F1 二者對于治療性抗KIR抗體具有合適的同種型(分別為IgG4和IgG2)。在誘導(dǎo)表達(dá)KIR2DL1、_2和/或-3的NK細(xì)胞殺傷時，1-7F9比鼠mAbs EB6、GL183、DF200和NKVSFl (Pan2D)還更加有效得多。例如，如圖5和6所示，1-7F9比EB6、DF200或NKVSFl (Pan2D)誘導(dǎo)更高的由表達(dá)HLA_Cw4的靶細(xì)胞的表達(dá)KIR2DL1的NK細(xì)胞產(chǎn)生的特異性裂解水平。1-7F9與以前已知的抗KIR mAbs比較還具有更高的親和力。例如，1-7F9結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL3，其解離常數(shù)(Kd，s)分別為0，43nM和0.025nM，表示對兩種抗原的親和力比，例如DF200更高(見實(shí)施例3和8)。與鼠抗體NKVSFl (Pan2D)、A210和A208g相反，1-7F9和1-4F1中沒有一個結(jié)合KIR2DS4，使其更好地適于治療目的。如同 NKVSFl (Pan2D)和 DF200，1-7F9 和 1-4F1 也結(jié)合 KIR2DS1 和 KIR2DS2，但認(rèn)為KIR2DS1和KIR2DS2在抗白血病功效中是不重要的。因此根據(jù)本發(fā)明的特殊抗體具有與1-7F9和/或1-4F1相同或相似的抗原特異性。例如與1-7F9含有相同或相似的VH和VL區(qū)的抗體可以具有與1-7F9相同或相似的抗原結(jié)合和/或NK刺激性特性；并且與1-4F1含有相同或相似VH和VL區(qū)的抗體可以具有與1-4F1相同或相似的抗原結(jié)合特性。
[0088]如圖14所示，1-7F9的VL和VH區(qū)的氨基酸序列已經(jīng)確定:
[0089]1-7F9VL 區(qū)(SEQ ID NO: 15):
[0090]EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT
[0091]1-7F9VH 區(qū)(SEQ ID NO: 17):
[0092]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS
[0093]1-4F1VL和VH區(qū)的氨基酸序列分別以SEQ ID NOS:39和41提供，并且編碼1-4F1VL和VH區(qū)的核苷酸序列分別以SEQ ID NOS:40和42提供。在一個【具體實(shí)施方式】中，SEQ ID NO:39 的殘基 3、4、9、24、32、41、47、50、55、71 和 74 分別為 Q、L、S、R、A、G、L、D、E、F和A。在另一個【具體實(shí)施方式】中，SEQ ID NO:39的殘基3、4、9、24、32、41、47、50、55、71和74 分別為 R、M、F、W、Y、A、F、Y、Q々PT。
[0094]如圖15所示，1-7F9⑶Rs的氨基酸序列已經(jīng)鑒定如下:輕鏈⑶Rl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO: 15的殘基24-34 ;輕鏈CDR2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO: 15的殘基50-56 ;輕鏈⑶R3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO: 15的殘基89-97 ;重鏈⑶Rl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO: 17的殘基31-35 ;重鏈CDR2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO: 17的殘基50-65 ;重鏈CDR3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:17的殘基99-112。1_4F1CDRs的氨基酸序列已經(jīng)鑒定如下:輕鏈⑶Rl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:39的殘基24-34 ;輕鏈⑶R2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:39的殘基50-56 ;輕鏈CDR3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:39的殘基89-97 ;重鏈CDRl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:41的殘基31-35 ;重鏈CDR2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:41的殘基50-66 ;重鏈CDR3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:41的殘基99-113。
[0095]完整的1-7F9輕和重鏈氨基酸序列分別以SEQ ID NOS:36和37提供。
[0096]因此，基于該信息，另外的抗體,例如不同的人類抗體亞類、抗體片段、抗體衍生物和其它結(jié)合KIR的肽，可以通過例如重組技術(shù)容易地進(jìn)行生產(chǎn)。例如，在一方面，本發(fā)明提供了具有分別基本上由SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO:17組成的VL和VH序列的抗體，和/或具有分別基本上由SEQ ID N0:39和SEQ ID NO:41組成的VL和VH序列的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了含有基本上由上述描述的1-7F9或1-4F1VH CDR1-3和VL CDR1-3組成的CDR區(qū)的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了含有如下CDR區(qū)的抗體:輕鏈CDRl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:15的大約殘基24-34 ;輕鏈CDR2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:15的大約殘基50-56 ;輕鏈CDR3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:15的大約殘基89-97 ;重鏈CDRl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:17的大約殘基31-35 ;重鏈⑶R2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ IDNO: 17的大約殘基50-65和重鏈CDR3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:17的大約殘基99-112。在另一方面，本發(fā)明提供了含有如下CDR區(qū)的抗體:輕鏈CDRl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ IDNO:39的大約殘基24-34 ;輕鏈CDR2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:39的大約殘基50-56 ；輕鏈⑶R3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ IDNO:39的大約殘基89-97 ;重鏈⑶Rl氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:41的大約殘基31-35 ;重鏈CDR2氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:41的大約殘基50-66和重鏈⑶R3氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO:41的大約殘基99-113。在另一方面，本發(fā)明提供了含有基本上由SEQ ID NO: 15的殘基24-34組成的輕鏈⑶Rl氨基酸序列的抗體；含有由SEQ ID NO:15的殘基50-56組成的輕鏈⑶R2氨基酸序列基本上；含有基本上由SEQ ID NO: 15的殘基89-97組成的輕鏈CDR3氨基酸序列；含有基本上由SEQ ID NO:17的殘基31-35組成的重鏈⑶Rl氨基酸序列；含有基本上由SEQ ID NO:17的殘基50-65組成的重鏈⑶R2氨基酸序列和重鏈⑶R3氨基酸序列基本上由SEQ ID NO:17的殘基99-112組成。在另一方面，本發(fā)明提供了含有如下⑶R區(qū)的抗體:基本上由SEQ ID NO:39的殘基24-34組成的輕鏈CDRl氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:39的殘基50-56組成的輕鏈CDR2氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:39的殘基89-97組成的輕鏈⑶R3氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:41的殘基31-35組成的重鏈CDRl氨基酸序列；基本上由SEQ ID NO:41的殘基50-66組成的重鏈⑶R2氨基酸序列；和基本上由SEQ ID NO:41的殘基99-113組成的重鏈⑶R3氨基酸序列。
[0097]本發(fā)明也包含抗KIR抗體、抗體片段或抗體衍生物或結(jié)合KIR的多肽，其含有至少一個與1-7F9或1-4F1VH或VL序列，或與其中的⑶R-區(qū)實(shí)質(zhì)上相同的變異的氨基酸序列。變異的氨基酸序列可以含有或基`本上由與1-7F9或1-4F1⑶R，VH或VL區(qū)至少大約百分之 50、80、90、95、98 或 99 (例如大約 50_99%、大約 65_99%、大約 75-99% 或大約 85-99%)相同的氨基酸序列組成。變異的氨基酸序列也可以或可選擇地含有1、2或3個CDRs，其含有或由與1-7F9或1-4F1⑶Rs至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%相同的氨基酸序列組成。因而，在一方面，本發(fā)明提供了人類抗體，該抗體含有與SEQ ID N0:15或SEQ IDNO:39的殘基24-34至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%相同的輕鏈⑶Rl氨基酸序列；與SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO:39的殘基50-56至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%相同的輕鏈CDR2氨基酸序列；與SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:39的殘基89-97至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%相同的輕鏈⑶R3氨基酸序列；與SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:41的殘基31-35至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%相同的重鏈CDRl氨基酸序列；與SEQ ID NO:17的殘基50-65或SEQ ID NO:41的殘基50到66至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%相同的重鏈⑶R2氨基酸序列；與SEQ ID NO:17的殘基99-112或SEQ ID NO:41的殘基99到113至少大約80%、至少大約90%或至少大約95%相同的重鏈⑶R3氨基酸序列。1-7F9-或1-4F1-衍生的結(jié)合KIR的氨基酸序列的基本特性(其保留在這種變異的氨基酸序列中)期望地包括1-7F9或1-4F1序列對一個或多個KIRs的特異性和/或親合力，并且還可以或可選擇性地包括1-7F9在阻斷KIR/HLA-C相互作用并加強(qiáng)NK細(xì)胞的裂解活性中的能力。
[0098]在另一方面，本發(fā)明提供了抗KIR抗體、抗體片段、或抗體衍生物、或結(jié)合KIR的多肽，其包含結(jié)合KIR的氨基酸序列，該氨基酸序列通過一個或多個的殘基插入、缺失和/或取代，在一個或多個氨基酸殘基(例如至少2、3、5，至少大約10、至少大約15、至少大約20、至少大約25、至少大約30、至少大約35、至少大約40、至少大約50或更多個的氨基酸殘基)與1-7F9或1-4F1結(jié)合KIR的序列不同。在一個【具體實(shí)施方式】中，這種變異的結(jié)合KIR的序列給予了變異序列更大的親和力；更大或不同的特異性；更小的免疫原性(根據(jù)對該序列的宿主反應(yīng))；在體內(nèi)更大的穩(wěn)定性；和/或相對于含有天然1-7F9或1-4F1序列的基本相同氨基酸序列的其它有益特性。在本文別處進(jìn)一步描述了適當(dāng)?shù)男蛄凶儺??？筀IR抗體、抗體片段、或抗體衍生物、或結(jié)合KIR的多肽的結(jié)合KIR的部分也可以含有任意適當(dāng)數(shù)量的非氨基酸成分或取代基，例如非氨基酸有機(jī)部分，其促進(jìn)KIR結(jié)合和/或提供其它有利的物理化學(xué)或免疫學(xué)特性。
[0099]本發(fā)明的一些抗體還可以或選擇性地通過其對一個或多個KIRs的結(jié)合親和力表征。例如如在實(shí)施例3和8中所示，根據(jù)二價結(jié)合，DF200對KIR2DL1的Kd為大約IlnM ;和對 KIR2DL3 的 Kd 為大約 2.0nM,和 1-7F9 對 KIR2DL1 的 Kd 為大約 0.43nM,對 KIR2DL3 的 Kd為大約0.025nM。因此，在一方面，本發(fā)明提供了在與KIR2DL1 二價結(jié)合中，Kd不大于大約20nM、不大于大約llnM、不大于大約5nM、不大于大約InM、不大于大約0.5nM或不大于大約0.43nM的人類或非人類(例如鼠、嵌合的或人源化的)抗體。另外地或可選擇地，本發(fā)明的人類或非人類(例如鼠、嵌合 的或人源化的)抗體對KIR2DL3的Kd可能不大于大約20nM、不大于大約2nM、不大于大約InM、不大于大約0.1nM、或不大于大約0.05nM或不大于大約0.025nM。在特殊方面，該抗體對KIR2DL1和KIR2DL3的二價結(jié)合的Kd值與1-7F9大約相同。如在實(shí)施例13所示，根據(jù)單價結(jié)合，1-7F9和1-4F1對KIR2DL3的Kd值分別為大約3.5和7nM。因此，在一方面，本發(fā)明提供了人類或非人類(例如鼠、嵌合的或人源化的)抗體，其單價結(jié)合KIR2DL3的Kd不大于大約20nM、不大于大約ΙΟηΜ、不大于大約7nM或不大于大約 3.5nM。
[0100]在適當(dāng)條件(例如，關(guān)于溫度、pH等，其將典型地反應(yīng)人類正常或NK細(xì)胞相關(guān)疾病狀態(tài)下，并且在含有所述序列或組合的合適的蛋白質(zhì)的上下文中的生理狀態(tài))下，抗KIR抗體、抗體片段、或抗體衍生物、或結(jié)合KIR的多肽選擇地和/或特異地(典型地特異地)結(jié)合至少一種KIR，并且更特殊地結(jié)合至少一種KIR的抗原決定簇區(qū)或表位。例如，在一方面，本發(fā)明涉及可以用(除了其它事情之外)與1-7F9U-4F1或1-7F9-或1-4F1樣抗體競爭的能力表征的抗體，和涉及該抗體的不同方法。本發(fā)明的其它抗體(和/或在實(shí)踐在本文描述創(chuàng)造性方法中有用的抗體)還可以或可選擇地在具有與抗體DF200、抗體NKVSF1、抗體EB6和抗體GL183中的一個或多個競爭的能力方面進(jìn)行表征。
[0101]通過特異地抑制MHC和/或HLA分子結(jié)合至少兩種抑制性KIR受體并促進(jìn)NK細(xì)胞活性，本發(fā)明的交叉反應(yīng)性和中和性抗KIR抗體、抗體片段或衍生物降低或中和KIR的抑制活性，這意思是指這類抗體、片段或衍生物允許在其表面表達(dá)抑制性KIR受體的NK細(xì)胞能裂解細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)與所述特殊的抑制性KIR受體相應(yīng)的HLA配體(例如特殊的HLA抗原)。在一方面，本發(fā)明提供了特異性抑制HLA-C分子與KIR2DL1和KIR2DL2/3受體結(jié)合的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制KIR2DL1和/或KIR2DL2/3結(jié)合HLA-C的抗體。還有另一方面，本發(fā)明提供了在體內(nèi)和/或體外促進(jìn)NK細(xì)胞活性的抗體。
[0102]KIR2DL1或KID2DL2/3的至少一個存在于至少90 %或更多的人口中，并且本發(fā)明更優(yōu)選的抗體能加強(qiáng)表達(dá)這些KIR任一或二者的NK細(xì)胞活性。因此，本發(fā)明的組合物可以在大多數(shù)的人類個體中，典型地在大約90%或更多的人類個體中，用于有效地活化或加強(qiáng)NK細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的單一抗體組合物可以用于治療大多數(shù)人類受試者，并且很少需要確定KIR-或HLA-等位基因組或使用兩個或更多個抗KIR mAbs的混合物。
[0103]在一方面，抗體特異地結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2/3兩個人類受體，并且逆轉(zhuǎn)由這些KIRs介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性抑制。抗體同樣可以為人類而且與單克隆抗體1-7F9和/或1-4F1競爭。術(shù)語“競爭”當(dāng)指的是特殊的成對抗體(例如選自DF200、NKVSFl (Pan2D)、1-7F9、EB6和GL183的一個或更多抗體)時，意思是在結(jié)合試驗(yàn)中，使用重組KIR分子或細(xì)胞表面表達(dá)的KIR分子，第一抗體可檢測地與第二抗體(或其它分子)競爭。例如，在一方面，不管那個抗體用作第一抗體，當(dāng)對某抗體對的抑制百分比超過大約20%、超過大約30%、超過大約40%、超過大約50%時，該抗體競爭?？蛇x擇地，如果對某抗體對的抑制作用百分比平均為至少大約29%、至少大約30%、至少大約40%或至少大約50%，該抗體競爭。第一抗體對第二抗體結(jié)合KIR2D蛋白質(zhì)的抑制百分比可以按照100*(1-(檢測到的結(jié)合第二抗體)/(檢測到的第一抗體的結(jié)合))計算。相同的應(yīng)用于抗體片段和抗體衍生物。除非另有說明，與1-7F9、1-4F1或1-7F9-或1-4F1樣抗體“競爭”的抗體可以與1_7F9、1_4F1或1-7F9-或1-4F1樣抗體競爭結(jié)合人類KIR2DL1、人類KIR2DL2/3或人類KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者。例如，抗體DF200與1-7F9和1-4F1競爭結(jié)合到KIR2DL3。
[0104]任選地，與1-7F9或1-4F1競爭的抗體分別地不是1-7F9或1-4F1自身(也就是本發(fā)明提供了不是1-7F9和1-4F1的抗體，其特征為，尤其是在結(jié)合這些KIRs中的一個或兩個中與1-7F9和/或1-4F1競 爭的能力)。
[0105]在另一方面，該抗體結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2/3兩個人類受體，降低或中和或逆轉(zhuǎn)這些KIRs介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制，并且與1-7F9競爭結(jié)合KIR2DL1人類受體，KIR2DL2/3人類受體，或KIR2DL1和KIR2DL2/3兩個人類受體。任選地，所述抗體為嵌合的、人類的或人源化抗體。
[0106]在另一方面，抗體結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2/3兩個人類受體，降低或中和或逆轉(zhuǎn)這些KIRs介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制，并且與EB6競爭結(jié)合KIR2DL1人類受體，或與GL183和/或DF200競爭結(jié)合KIR2DL2/3人類受體，或既與EB6競爭結(jié)合KIR2DL1人類受體而且又與GL183和/或DF200競爭結(jié)合KIR2DL2/3人類受體。在一個【具體實(shí)施方式】中，抗體不是NKVSFl (Pan2D)，不是A210，不是A803g和/或不是DF200?？贵w可以是例如鼠的、嵌合的、人類的或人源化抗體。
[0107]在另一方面，抗體含有至少實(shí)質(zhì)上與1-7F9或1-4F1的VH和/或VL區(qū)相同的VH，VL，或VH和VL兩個區(qū)。抗體可以具有任意亞類，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在特殊方面，抗體為人類IgG4抗體。在另外特殊方面，抗體為人類IgG2抗體。抗體可以為嵌合的、人類的或人源化的抗體。
[0108]在另一方面，抗體為人類的，與1-7F9或1-4F1競爭，并且如單克隆抗體1-7F9或1-4F1，對至少部分相同或相同KIR分子上的表位或“表位部位”識別、結(jié)合或具有免疫特異性。優(yōu)選地，所述KIR分子為人類KIR2DL1或KIR2DL2/3受體。
[0109]在另一方面，抗體結(jié)合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3兩個人類受體中的共同決定簇，并且降低、中和或逆轉(zhuǎn)這些KIRs介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制作用。如單克隆抗體1-7F9，抗體可更加特異地結(jié)合至少部分相同、實(shí)質(zhì)上相同，或相同的KIR上的表位。
[0110]在特殊方面，抗體為顯示一個或更多上述特征的單克隆抗體。
[0111]在另一方面，在本文描述的抗體的功能性片段和衍生物可以進(jìn)行制備，其有實(shí)質(zhì)相似的抗原結(jié)合、特異性和/或活性，包括不限于Fab片段、Fab’ 2片段、免疫粘附素、雙抗體、camelized 抗體、Janusins、小體、CDRs 和 ScFv 片段。
[0112]除非另有說明，抗體或其二價片段或衍生物是單特異性的，也就是抗體，片段，或衍生物的兩個“臂”結(jié)合相同抗原。
[0113]在還有另外的方面，可以制備含有本發(fā)明抗體、綴合或共價結(jié)合毒素、放射性核素、可檢測到的部分(例如氟石)或固體載體的抗體衍生物。
[0114]本發(fā)明也包含含有上述公開的抗體，其片段，或其任一衍生物的藥物組合物。因此，本發(fā)明也涉及在本文公開的抗體在生產(chǎn)藥物方法中的用途。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，藥物或藥物組合物用來治療癌癥或其它增殖性障礙、感染或用于移植。
[0115]在一方面，本發(fā) 明涉及含有抗體的組合物(例如為藥物施用配制的組合物，制備這種組合物的試劑盒，分析試劑盒或介質(zhì)，純化介質(zhì)等)，其中所述抗體結(jié)合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物，并能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞的抑制細(xì)胞毒性，該NK細(xì)胞表達(dá)至少所述兩種不同人類抑制性KIR受體中的一種，其中抗體合并入脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體也可以含有附加物質(zhì)，例如例如，傳輸基因用于基因治療的核酸分子；傳輸反義RNA，RNAi,或siRNA來抑制NK細(xì)胞中基因的核酸分子；或用來NK細(xì)胞靶向殺傷的毒素或藥物。
[0116]在本文也描述了在體外、離體或在體內(nèi)調(diào)節(jié)人類NK細(xì)胞活性的方法，它包括用有效量的本發(fā)明抗體、這種抗體的片段、其任一的衍生物，或包含其任意至少一種的藥物組合物接觸人類NK細(xì)胞。優(yōu)選的方法包括施用有效量的本發(fā)明藥物組合物并指向增加人類NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，最優(yōu)選離體或在體內(nèi)，在患有癌癥、感染性疾病或免疫疾病的受試者中。例如，施用可以通過給有癌癥或感染性疾病(例如病毒病)的患者靜脈內(nèi)輸注在適當(dāng)緩沖劑中的抗體來實(shí)現(xiàn)。
[0117]本發(fā)明也提供了組合物，該組合物含有結(jié)合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的抗體，其中抗體能中和在表達(dá)該兩種不同的人類抑制性KIR受體中的至少一種的NK細(xì)胞中KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制作用，該抗體以可以以有效可檢測地加強(qiáng)患者或含有NK細(xì)胞的生物樣品中的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的量存在；和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選地，該抗體結(jié)合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇。含有本發(fā)明抗體的組合物可以任選地進(jìn)一步含有第二種治療藥(誘導(dǎo)、促進(jìn)和/或增強(qiáng)宿主中的療效的藥劑，該宿主與為之而施用抗體的病癥或障礙相關(guān)-例如與癌癥、移植、感染性疾病、病毒感染等相關(guān)的病癥)。在一方面，可以與本發(fā)明的抗體以這種聯(lián)合組合物共同施用的第二治療藥可以選自，例如免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥劑、化學(xué)治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、對非KIR抗原特異的第二抗體，任選地結(jié)合并抑制并中和抑制性KIR，或減少來自抑制性KIR的信號的第二抗體，抗感染劑、靶向劑或輔助化合物。有利的免疫調(diào)節(jié)劑可以選自IL-1a、IL_li3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF- β、GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF- a、TNF- β、LAF、TCGF, BCGF, TRF、BAF、BDG、ΜΡ、LIF、OSM、TMF、PDGF, IFN-a、IFN-β或IFN-Y?；瘜W(xué)治療劑的例子包括烷化劑、抗代謝物、細(xì)胞毒性抗生素、阿霉素、放線菌素D、絲裂霉素、洋紅霉素、道諾霉素、阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇、泰索帝、長春新堿、長春堿、長春烯堿、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、三胺硫磷、甲氨蝶呤、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂霉素C、順鉬(CDDP)、氨喋呤、考布他汀、其它長春花屬生物堿類(alkyloids)和其衍生物或前藥。激素藥劑的例子包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、他莫昔芬、托瑞米芬、氟利坦、尼魯米特、環(huán)丙孕酮酯比卡魯胺阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、甲羥(medroxy)法倔唑、氯地孕酮、甲地孕酮、其它LHRH激動劑、其它抗雌激素類、其它抗雄激素、其它芳香酶抑制劑和其它結(jié)合孕激素類。優(yōu)選地，結(jié)合和抑制抑制性KIR受體的第二抗體是結(jié)合抑制性KIR受體的表位的抗體或其衍生物或片段，該表位不同于與存在于至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物上的共同抗原決定簇結(jié)合的抗體結(jié)合的表位。在另一方面，第二抗體可以指向與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶標(biāo)，該疾病狀態(tài)通過施用本發(fā)明的抗體至少可部分地治療(例如與癌癥相關(guān)的抗原，病毒感染相關(guān)抗原等)。
[0118]本發(fā)明進(jìn)一步提供了在需要其的患者中可檢測地加強(qiáng)NK細(xì)胞活性的方法，它包括給患者施用根據(jù)本發(fā)明的組合物的步驟。需要NK細(xì)胞活性增強(qiáng)的患者可以為診斷為患有疾病或障礙的任何患者，在該疾病或障礙中這種增強(qiáng)可以促進(jìn)、增強(qiáng)和/或誘導(dǎo)療效(或促進(jìn)、增強(qiáng)和/或誘導(dǎo)這樣一種效果，至少在相當(dāng)比例的患有所述疾病或障礙和與所述患者實(shí)質(zhì)上相似特征的患者中一如可以通過例如臨床試驗(yàn)確定)。需要這種治療的患者可以患有，例如癌癥、另外的增殖性障礙、感染性疾病或免疫障礙。優(yōu)選地，該方法包括給患者施用適當(dāng)?shù)母郊又委熕幍母郊硬襟E，該附加的治療藥選自免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥劑、化學(xué)治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、對不同于KIR的抗原特異的第二抗體，任選地結(jié)合并抑制并中和抑制性KIR受體，或減少來自抑制性KIR的信號的第二抗體、抗感染劑、靶向劑或輔助化合物，其中所述附加治療藥作為與所述抗體一起的單一劑量形式或作為分離的劑量形式給所述患者施用?？贵w(或抗體片 段/衍生物)的劑量和附加治療藥的劑量共同地足夠可檢測地誘導(dǎo)、促進(jìn)和/或增強(qiáng)患者的治療反應(yīng)，其包含NK細(xì)胞活性的增強(qiáng)。當(dāng)分別地施用時，抗體、片段或衍生物和附加治療藥是在對患者引起可檢測到的聯(lián)合治療益處的情況下合乎需要地施用。
[0119]本發(fā)明進(jìn)一步包括能在非人類靈長類，優(yōu)選猴中特異地結(jié)合NK細(xì)胞和/或KIR受體的抗體。也包括用來評價為候選藥物的本發(fā)明抗體的毒性、劑量和/或活性或功效的方法。在一方面，本發(fā)明包括通過對具有NK細(xì)胞的非人類靈長類動物接受者施用本發(fā)明的抗體，并評價該藥劑對動物或優(yōu)選地對靶組織的任何有毒的或有害的或不良效果，來確定對動物或靶組織有毒的抗體劑量的方法。在另一方面，本發(fā)明是通過對具有NK細(xì)胞的非人類靈長類動物接受者施用本發(fā)明的抗體，并評價該藥劑對動物或優(yōu)選地對靶組織任何有毒的或有害的或不良效果，來鑒別對動物或靶組織有毒的抗體的方法。在另一方面，本發(fā)明是用來鑒別有效治療感染、疾病或腫瘤的抗體的方法，其是通過給非人類靈長類感染、疾病或癌癥模型施用本發(fā)明的抗體，并鑒別改善感染、疾病或癌癥，或其癥狀的抗體進(jìn)行的。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明所述抗體是(a)與人類NK細(xì)胞表面上至少兩種抑制性人類KIR受體交叉反應(yīng)的抗體，和(b)與非人類靈長類的NK細(xì)胞或KIR受體交叉反應(yīng)的抗體。
[0120]本發(fā)明進(jìn)一步包括在生物樣品或活生物中，檢測在其細(xì)胞表面上具有抑制性KIR的NK細(xì)胞存在的方法，所述方法包括如下步驟:
[0121]a)用本發(fā)明的抗體接觸所述生物樣品或活體，其中所述抗體綴合或共價結(jié)合可檢測的部分；并且
[0122]b)在所述生物樣品或活生物中檢測所述抗體的存在；
[0123]本發(fā)明也提供了從樣品中純化在其細(xì)胞表面上具有抑制性KIR的NK細(xì)胞的方法，它包括如下步驟:
[0124]a)在允許所述在其細(xì)胞表面上具有抑制性KIR的NK細(xì)胞結(jié)合所述抗體的條件下，用本發(fā)明的抗體接觸所述樣品，其中所述抗體綴合或共價結(jié)合到固體載體(例如，珠，基質(zhì)等)；并且
[0125]b)從所述綴合或共價結(jié)合到固體載體的所述抗體中，洗脫所述結(jié)合的NK細(xì)胞。
[0126]已發(fā)現(xiàn)，抗體NKVSFl (Pan2D)也結(jié)合來自獼猴的NK細(xì)胞，見圖10。
[0127]因此本發(fā)明提供抗體，以及其片段和衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物與人類NK細(xì)胞表面上的至少兩種抑制性人類KIR受體交叉反應(yīng)，并且此外它還結(jié)合來自獼猴的NK細(xì)胞。在這方面的一個實(shí)施方式中，抗體不是抗體NKVSF1、不是A210和/或不是A802g。本發(fā)明也提供了測試抗體、以及其片段和衍生物毒性的方法，其中所述抗體、片段或衍生物與在人類NK細(xì)胞表面上的至少兩種抑制性人類KIR受體交叉反應(yīng)，其中該方法包含檢測獼猴中的抗體。
[0128]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明`提供了抗體、抗體片段或其任一的衍生物，其包含抗體1-7F9或1-4F1的輕鏈可變區(qū)或一個或更多的輕鏈可變區(qū)⑶Rs。還有另一方面，本發(fā)明提供了抗體、抗體片段或其任一的衍生物，其包含與1-7F9或1-4F1的全部或基本全部輕鏈可變區(qū)序列高度相似的序列。
[0129]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了抗體、抗體片段或其任一的衍生物，其包含抗體1-7F9或1-4F1的重鏈可變區(qū)或一個或更多的重鏈可變區(qū)⑶Rs。還有另一方面，本發(fā)明提供了抗體、抗體片段或其任一的衍生物，其包含與1-7F9或1-4F1的全部或基本全部重鏈可變區(qū)序列高度相似的序列。
[0130]抗體
[0131]本發(fā)明提供了新的抗體和其片段或衍生物，其結(jié)合在人類抑制性KIR受體中保受的的共同決定簇，優(yōu)選地包括存在于至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物上，但是不在KIR2DS4上的決定簇，并且其引起表達(dá)至少那些KIR受體之一的NK細(xì)胞的增強(qiáng)。本發(fā)明首次公開了，可以生產(chǎn)這種交叉反應(yīng)和中和抗體，并有效地用于NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)，其代表意想不到的結(jié)果并打開了一條通往新的和有效的基于NK的治療，特別是在人類受試者中的治療的大道。
[0132]在本發(fā)明的上下文中，“共同決定簇”表示由人類抑制性KIR受體的多種基因產(chǎn)物共享的決定簇或表位。優(yōu)選地，共同決定簇由KIR2DL受體群的至少兩個成員共享。更優(yōu)選地，決定簇由至少KIR2DL1和KIR2DL2/3共享。本發(fā)明的某些抗體，可以除了識別KIR2DL類型的多種基因產(chǎn)物之外，也識別存在于其他抑制性KIRs上的決定簇，例如KIR3DL受體群的基因產(chǎn)物；例如KIR3DL1和/或KIR3DL2。決定簇或表位可以代表由所述成員共享的肽片段或構(gòu)象表位。在更為具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體特異地結(jié)合單克隆抗體DF200識別的實(shí)質(zhì)上相同的表位。該決定簇存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者上。在另一個優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明抗體特異地結(jié)合由人類mAbl-7F9識別的實(shí)質(zhì)上相同表位，或人類mAbl-4Fl識別的表位，所述表位存在于KIR2DL1、-2和-3上，但不在KIR2DS4上。
[0133]除非另作說明或明顯地與上下文相矛盾，如在本文所使用，術(shù)語“抗體，”指的是多克隆和單克隆抗體，以及所述多克隆和單克隆抗體的片段和衍生物。根據(jù)重鏈恒定區(qū)的類型，全長抗體典型地分配到五個主要類型之一:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些中的幾個進(jìn)一步分為亞類或同種型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為“ α、” “ δ、” “ ε、” “ Y ”和“ μ ”。不同類的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型已經(jīng)眾所周知。IgG和/或IgM為本發(fā)明中使用的優(yōu)選種類抗體，因?yàn)樗鼈兪巧頎顟B(tài)下最普通的抗體，并且因?yàn)樗鼈冏钜子谠趯?shí)驗(yàn)室環(huán)境中制備。典型地，本發(fā)明上下文中的“抗體”指的是單克隆抗體，更優(yōu)選“人類”單克隆抗體。
[0134]為了治療目的，本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】提供了阻斷抑制性KIR和其在體內(nèi)對應(yīng)的HLA配體相互作用的方法，其包括內(nèi)源性NK細(xì)胞的活化。在這種環(huán)境中，避免耗盡NK細(xì)胞可能是有利的，因?yàn)槿绻谋M，NK細(xì)胞不能發(fā)揮其治療的有益效果。因此，抗體同種型例如IgG4和IgG2，其顯示對Fe-受體的很少結(jié)合，并且不活化補(bǔ)體系統(tǒng)，為典型的優(yōu)選。1-7F9的同種型為IgG4。也通常認(rèn)為IgG2抗體是非耗盡的，并可能也是比IgG4抗體更穩(wěn)定的分子，因此具有更長的體內(nèi)半衰期。1-4F1是IgG2同種型。
[0135]抗體生產(chǎn)
[0136]本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。典型地通過用包含抑制性KIR多肽，優(yōu)選KIR2DL多肽，更優(yōu)選人類KIR2DL多肽的免疫原免疫非人類動物，優(yōu)選小鼠進(jìn)行生產(chǎn)。抑制性KIR多肽可以含有人類抑制性KIR多肽的全長序列，或其片段或衍生物，典型地為免疫原性片段，也就是含有暴露在表達(dá)抑制性KIR受體的細(xì)胞表面上的表位的多肽部分。這種片段典型地包含成熟多肽序列的至少大約7個連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選地它的至少大約10連續(xù)的氨基酸。典型地，片段基本上來源于受體的胞外域。甚至更優(yōu)選的是人類KIR2DL多肽，其包括至少一個，更優(yōu)選地兩個全長KIRDL多肽的細(xì)胞外免疫球蛋白域，并且能模仿存在于KIR2DL受體內(nèi)至少一個構(gòu)象表位。在其他【具體實(shí)施方式】，所述多肽含有KIR2DL1多肽的1-224位氨基酸的細(xì)胞外免疫球蛋白域的至少大約8個連續(xù)氨基酸(根據(jù)Wagtmann等，Immunityl995 ；2:439-449的氨基酸編號，其在本文通過參考以其全部并入本申請，或根據(jù)在萬維網(wǎng)(www)地址 ncb1.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082, htm發(fā)現(xiàn)的PROW互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn))。
[0137]在一個【具體實(shí)施方式】中，免疫原含有脂膜中，典型地在細(xì)胞表面上的野生型人類KIR2DL多肽。在特殊的【具體實(shí)施方式】中，免疫原含有完整的NK細(xì)胞，特別是完整的人類NK細(xì)胞。在另一個【具體實(shí)施方式】中，細(xì)胞經(jīng)過裂解和以其它方式被處理，以致不是完整的。在給非人類哺乳動物，例如小鼠、兔、山羊、馬、狗、綿羊、豚鼠、大鼠、倉鼠等施用前，免疫原可以，例如懸浮或溶解于緩沖液中，該緩沖液任選地含有佐劑，例如完全弗氏佐劑。
[0138]用抗原免疫非人類哺乳動物的步驟可以以本領(lǐng)域眾所周知的任何刺激小鼠中抗體的產(chǎn)生的方式進(jìn)行(見，例如 E.Harlow 和 D.Lane, Antibodies:A Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY(1988))。然后免疫原懸浮或溶解于緩沖液，任選地有佐劑，例如完全弗氏佐劑。確定免疫原數(shù)量、緩沖液類型和佐劑數(shù)量的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，并且不以任何方式對本發(fā)明進(jìn)行限制。這些參數(shù)對不同的免疫原可以是不同的，但可容易地闡明。
[0139]相似地，與足夠刺激抗體產(chǎn)生的免疫部位和頻率的選擇相關(guān)的原理，在本領(lǐng)域也是眾所周知的。在有代表性的免疫方案中，在第一天和大約一周后再次用抗原腹膜內(nèi)注射非人類動物。然后在大約20天，任選地與不完全弗氏佐劑一起，恢復(fù)注射抗原。該恢復(fù)注射靜脈內(nèi)進(jìn)行而且可以重復(fù)幾個連續(xù)日。然后在第40天，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)，典型地不用佐劑，加強(qiáng)注射。該方案導(dǎo)致大約40天后產(chǎn)生抗原特異的產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。也可以應(yīng)用其他的方案，只要他們導(dǎo)致表達(dá)抗體的B細(xì)胞的產(chǎn)生，該抗體針對在免疫中使用的抗原。
[0140]對于多克隆抗體制備，從免疫的非人類動物中獲得血清，并且將其中存在的抗體通過眾所周知的技術(shù)進(jìn)行分離。血清可以使用上面陳述的連接到固體載體的任意免疫原進(jìn)行親和純化，以便獲得與抑制性KIR受體反應(yīng)的抗體。
[0141]在可替代的【具體實(shí)施方式】中，從未免疫的非人類哺乳動物中分離淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)物中在體外生長，并然后暴露于免疫原。然后收獲淋巴細(xì)胞并進(jìn)行下面描述的融合步驟。
[0142]對于單克隆抗體，下一個步驟是從免疫的非人類哺乳動物中分離脾細(xì)胞，并且隨后為了形成產(chǎn)生抗體的雜交瘤，這些脾細(xì)胞與免疫的細(xì)胞融合。從非人類哺乳動物中分離脾細(xì)胞在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且典型地包括從麻醉的非人類哺乳動物中取出脾，將它切為小塊并從脾被膜擠出脾細(xì)胞并通過尼龍篩網(wǎng)的細(xì)胞過濾器進(jìn)入適當(dāng)?shù)木彌_液中以產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。洗滌細(xì)胞，離心并在裂解任何紅細(xì)胞的緩沖液中重懸。該溶液再一次離心而且在顆粒沉淀中保留的淋巴細(xì)胞最終在新鮮緩沖液中重懸。
[0143]一旦得以分離并存在于單細(xì)胞懸液中，淋巴細(xì)胞可以與無限增殖細(xì)胞系融合。這典型的是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，雖然本領(lǐng)域已知許多其它對產(chǎn)生雜交瘤有用的無限增殖細(xì)胞系。優(yōu)選的鼠骨髓瘤細(xì)胞系包括，但不限于來源于M0PC-21和MPC-1l小鼠腫瘤的那些(從 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.美國可以得到)或X63Ag8653和SP_2細(xì)胞系(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville, Mary美國獲得)。細(xì)胞融合是使用聚乙二醇或類似物實(shí)現(xiàn)的。然后將得到的雜交瘤生長于包含一種或更多抑制未融合的、親代骨髓瘤細(xì)胞的生長或存活的物質(zhì)的選擇性培養(yǎng)基中。例如如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的培養(yǎng)基典型地將包括次黃嘌呤，氨基喋呤，和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)，該物質(zhì)預(yù)防缺乏HGPRT的細(xì)胞的生長。
[0144]雜交瘤典型地在巨噬細(xì)胞飼養(yǎng)層上生長。巨噬細(xì)胞優(yōu)選地來自用于分離脾細(xì)胞的非人類哺乳動物同窩仔，并且典型地在平板接種雜交瘤之前數(shù)天用不完全弗氏佐劑處理。融合方法在 Goding, “Monoclonal Antibodies:Principles andPractice, ”pp.59-103 (Academic Press, 1986)中進(jìn)行了描述， 在本文公開內(nèi)容通過參考合并入本申請。
[0145]為了克隆形成和抗體產(chǎn)生，允許細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長足夠的時間。這通常在大約7到大約14天之間。然后分析雜交瘤克隆的與多種抑制性KIR基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的抗體的產(chǎn)生。雖然可以使用多種其它類型的測定，包括免疫沉淀法和放射免疫測定法或FACS、Biacore、閃爍親近測定法(SPA)或本領(lǐng)域眾所周知的其它類型的測定，該測定典型地為比色性ELISA類測定。檢查含有具有期望特異性的抗體的孔以確定是否存在一個或更多區(qū)別性的雜交瘤細(xì)胞克隆。如果超過一個克隆存在，細(xì)胞可以進(jìn)行再克隆并生長以保證只有單個細(xì)胞產(chǎn)生生產(chǎn)期望抗體的克隆。具有單一明顯克隆的陽性孔典型地再克隆并再分析以確保只有一種單克隆抗體被檢測到并產(chǎn)生。[0146]在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，根據(jù)本發(fā)明可應(yīng)用的方法用于產(chǎn)生抗體的非人類動物是哺乳動物，例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠等)、牛、豬、馬、兔、山羊、綿羊等。另外，非人類哺乳動物可以通過基因修飾或基因工程產(chǎn)生“人類”抗體，例如Xenomouse?(Abgenix)或HuMAb-Mouse? (Medarex),如下所描述。
[0147]抗體也可以轉(zhuǎn)基因地通過對目標(biāo)免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列來說為轉(zhuǎn)基因的脊索動物(例如哺乳動物或禽)或植物的傳代產(chǎn)生，并從中產(chǎn)生可回收形式的抗體(見，例如 Ma 等，Nature Rev.Genetics4:794-805 (2003) ；Nolke 等，Expert Opin BiolTher.20030ct ;3 (7):1153-62 ;Schillberg 等，Cell Mol Life Sc1.2003Mar ；60(3):433-45 ；Tekoah 等，Arch Biochem Biophys.2004Junl5 ；426 (2):266-78 ；Fischer 等，Eur.J.0f Biochem.,262(3):810(1999);和關(guān)于在植物中產(chǎn)生抗體和抗體樣蛋白質(zhì)的美國專利申請20030084482)。關(guān)于在哺乳動物中的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)，可以在山羊、奶牛或其它哺乳動物中生產(chǎn)抗體和其他蛋白質(zhì)，并且從山羊、奶?；蚱渌溉閯游镏谢厥?。見，例如，美國專利5，827，690，5，756，687，5，750，172，和5，741，957?？贵w也可以在禽蛋中生產(chǎn)并從其中回收。見，例如，Tini 等，Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol.2002Mar ； 131 (3):569-74 和美國專利 4，550，019。
[0148]抗體也可以通過免疫球蛋白的組合文庫的選擇進(jìn)行生產(chǎn)，如例如在Ward等，Nature, 341 (1989) p.544 中所公開。
[0149]根據(jù)另外的【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明提供了來源于非人類宿主B細(xì)胞的雜交瘤，其中所述B細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)合存在于至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物上的決定簇的抗體，并且所述抗體能中和所述受體的抑制活性。更為優(yōu)選地，本發(fā)明這方面的雜交瘤不是產(chǎn)生單克隆抗體NKVSF1、不是A210和/或不是A802g的雜交瘤。根據(jù)本發(fā)明這方面的雜交瘤，可以如上所述，通過來自免疫的非人類哺乳動物的脾細(xì)胞與無限增殖細(xì)胞系融合產(chǎn)生。如在本文在別處所描述，可以對該融合產(chǎn)生的雜交瘤進(jìn)行篩選這種交叉反應(yīng)抗體的存在。優(yōu)選地，雜交瘤產(chǎn)生識別存在于至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物上的決定簇的抗體，并引起表達(dá)至少那些KIR受體之一的NK細(xì)胞的增強(qiáng)。甚至更加優(yōu)選地，雜交瘤產(chǎn)生與1-7F9結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同表位或決定簇而且加強(qiáng)NK細(xì)胞活性的抗體，或與1-4F1結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同表位的抗體。最優(yōu)選地，雜交瘤是產(chǎn)生單克隆抗體1-7F9的雜交瘤1-7F9，或產(chǎn)生單克隆抗體1-4F1的雜交瘤1-4F1。
[0150]證實(shí)產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，例如DMEM或RPM1-1640中大量生長?？蛇x擇地，雜交瘤細(xì)胞可以在動物體內(nèi)作為腹水瘤生長。
[0151]在足夠生長以產(chǎn)生期望的單克隆抗體之后，包含單克隆抗體的生長培養(yǎng)基(或腹水)可以與細(xì)胞分離，并且純化單克隆抗體。純化典型地通過使用蛋白A或蛋白G-Sepharose,或連接固體載體例如瓊脂糖或Sepharose珠的抗小鼠免疫球蛋白的色譜法(全部描述，例如在 the Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences,publication N0.18-1037-46，AC版中，公開的內(nèi)容通過參考將它并入本申請)，或通過其它已知技術(shù)例如電泳或透析完成。結(jié)合的抗體典型地通過使用低PH緩沖液(pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸鹽緩沖液)，用包含抗體部分的立即中和從蛋白質(zhì)A/蛋白質(zhì)G柱洗脫。這些部分可以根據(jù)需要進(jìn)行混合、透析和濃縮。
[0152]人類抗體
[0153]在一方面，本發(fā)明提供了人類抗KIR抗體?！ㄈ祟悺贵w與〃人源化的〃抗體是有區(qū)別的(其分別描述如下)。這種"人類"抗體可以包括不被人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如在體外由隨機(jī)或位點(diǎn)特異的誘變或通過在體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)，例如在⑶Rs內(nèi)，例如⑶R3內(nèi)。然而，如在本文所使用，術(shù)語〃人類抗體"，不打算包括人源化的抗體或人類/小鼠嵌合抗體，其中來源于另外的哺乳動物物種，例如小鼠的種系的⑶R序列已經(jīng)移植到人類框架序列上。
[0154]含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物能夠而且已經(jīng)開發(fā)，免疫后，在沒有小鼠免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下，產(chǎn)生全套人類抗體?？梢詰?yīng)用這種人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人類抗體。這種人類抗體可以在含有人類免疫球蛋白基因座和天然的免疫球蛋白基因缺失的人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、牛、馬等)中，例如在Xeno Mouse?(Abgenix - Fremont, CA, USA)中產(chǎn)生(見，例如 Green 等 Nature Genetics7:13-21 (1994) ;Mendez 等Nature Geneticsl5:146-156 (1997) ;Green和 Jakobovits J.Exp.Med.188:483-495(1998);歐洲專利 N0.EP 0 463 151 BI ;國際專利申請 Nos.TO94/02602、W096/34096、W098/24893、W099/45031、W099/53049 和 W000/037504 和美國專利 5，916，771、5，939，598,5, 985，615,5, 998，209,5, 994，619,6, 075，181,6, 091，001,6, 114，598 和6，130，364)或在含有人類免疫球蛋白編碼基因的微衛(wèi)星基因座的轉(zhuǎn)基因動物，例如HuMab-Mouse?(Medarex-Princeton，NJ, USA)中產(chǎn)生(見，例如 EP0546073，EP0546073 ；美國專利 Nos.5，545，807、5，545，806、5，625，825、5，625，126、5，633，425、5，661，016、5，770，429、5，789，650、5，814，318、5，591，669、5，612，205、5，721，367、5，789，215、5，643，763 和國際專利申請 N os.W092/03918、W092/22645、W092/22647、W092/22670、W093/12227、W094/00569、W094/25585、W096/14436、W097/13852 和 W098/24884)。如在本文所述，根據(jù)熟知技術(shù)，可以使用來自這種轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞以產(chǎn)生分泌人類單克隆抗體的雜交瘤。相似的技術(shù)和原理在，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,90:2551-255 (1993) ; Jakobovits 等，Nature, 362:255-258 (1993);和 Bruggemann 等，Year inImmun0.，7:33(1993))中進(jìn)行了描述。
[0155]進(jìn)一步，人類抗體或來自其它物種的抗體可以通過展示類技術(shù)，包括不限于，噬菌體展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示、核糖體展示和其它相關(guān)技術(shù)，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法產(chǎn)生，并且得到的分子可以進(jìn)行附加的成熟方法，例如親和力成熟，因?yàn)檫@種技術(shù)也是眾所周知的(見，例如(Hoogenboom 等.，J.Mol.Biol.227:381 (1991)(卩遼菌體展示)；Vaughan,等，Nature Biotechl4:309 (1996)(卩遼菌體展不)；Hanes 和 Plucthau PNAS USA94:4937-4942(1997)(核糖體展示)；Parmley 和 Smith Gene73:305-318(1988)(噬菌體展示)；Marks 等，J.Mol.Biol.，222:581 (1991)，Scott TIBS17:241-245 (1992) ；Cwirla 等PNAS USA87:6378-6382(1990) ；Russel 等 Nucl.Acids Research21:1081-1085(1993)；Hoganboom 等 Immunol.Reviewsl30:43-68 (1992) ；Chiswell 和 McCafferty TIBTECH10:80-84(1992)，和美國專利5，733，743)。如果利用展示技術(shù)生產(chǎn)不是人類的抗體，這種抗體可以被人源化，例如如在本文在別處所描述。
[0156]因此，如在本文所述，抗KIR mAbs對治療癌癥和病毒感染和其它疾病和障礙是有前途的物質(zhì)?？筀IR mAbs可以通過不同的方法,例如鼠mAbs的人源化或通過來自人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠(XenoMouse或HuMab小鼠)的脾細(xì)胞融合，通過噬菌體展示或通過人類產(chǎn)生Ab的B細(xì)胞的無限增殖化，或通過其它方法產(chǎn)生。在任一情況下，在需要它時，抗體可以通過細(xì)胞系產(chǎn)生并以適于配制、包裝和注入患者的數(shù)量進(jìn)行純化。
[0157]重組產(chǎn)生
[0158]抗KIR抗體也可以通過在單細(xì)胞生物，例如酵母中；或在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物(例如在大腸村菌(E.coli)中);或在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中(例如在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中)，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)重組表達(dá)進(jìn)行制備。
[0159]因而，根據(jù)備擇的【具體實(shí)施方式】，編碼交叉反應(yīng)和中和性抗KIR抗體重鏈和輕鏈的DNA(所述抗體結(jié)合存在于至少兩種不同的人類抑制性KIRs上的決定簇)從本發(fā)明的雜交瘤中分離并為了轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)乃拗髦?，放于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。然后該宿主用于抗體，或其變體的重組生產(chǎn)，例如所述單克隆抗體的人源化形式、抗體的活性片段或含有抗體的抗原識別部分的嵌合抗體。優(yōu)選地，用于該【具體實(shí)施方式】中的DNA編碼識別存在于至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物上，但不在KIR2DS3或-4上的決定簇的抗體，并且該抗體引起表達(dá)那些KIR2DL受體中的至少一種NK細(xì)胞的增強(qiáng)。甚至更為優(yōu)選地，DNA編碼與1-7F9的抗體結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同表位或決定簇，并且加強(qiáng)NK細(xì)胞活性的抗體。最優(yōu)選地，DNA編碼單克隆抗體1-7F9。
[0160]編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA使用常規(guī)步驟，容易地分離和測序(例如通過使用能特異地結(jié)合編碼鼠或人類抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。一旦分離，DNA可以放入表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體`轉(zhuǎn)染入不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體片段的DNA在本領(lǐng)域是眾所周知的(見，例如 Skerra 等，Curr.0pinion in Tmmunol.,5, pp.256(1993);和 Pluckthun, Tmmunol.Revs.130,pp.151 (1992))。
[0161]另外，由已知可變重鏈(VH)區(qū)和可變輕鏈區(qū)(VL)和人類恒定區(qū)重組生產(chǎn)抗體已經(jīng)通過下面文獻(xiàn)進(jìn)行了描述，例如Ruker等(Annals of the New York Academy ofSciences.1991 ；646:212-219)，他報告了人類單克隆抗HIV-1抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)；Bianchi 等(Biotechnology 和 Bioengineering.2003 ；84:439-444)，他描述了使用反式互補(bǔ)表達(dá)載體的全長抗體的高水平表達(dá)；No Soo Kim等(Biotechnol.Prog.2001 ;17:69-75)，他描述了在二氫葉酸還原酶介導(dǎo)基因擴(kuò)增中，在CHO細(xì)胞的人源化的抗體表達(dá)中克隆變異存在的關(guān)鍵決定簇；King等(Biochemical Journal.1992 ；281:317-323)，他報告了小鼠-人類嵌合的抗體和嵌合的Fab’片段的表達(dá)，純化和特征；W02003064606描述了分離的人類單克隆抗體，該抗體含有人重鏈和輕鏈可變區(qū)，兩者含有FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、CDR3和FR4序列；和W02003040170描述了嵌合的或人類單克隆抗體和抗原結(jié)合部分，其特異地結(jié)合并活化人類⑶40。[0162]編碼人類IgG恒定區(qū)的全部cDNA序列可以在下面GenBank條目中發(fā)現(xiàn),其每一項(xiàng)在本文通過參考將其并入本申請中，獲取在2005年I月6日登入。
[0163]人類IgGl恒定重鏈區(qū)=GenBank登記入冊號# J00228
[0164]人類IgG2恒定重鏈區(qū)=GenBank登記入冊號# J00230
[0165]人類IgG3恒定重鏈區(qū)=GenBank登記入冊號#:X04646
[0166]人類IgG4恒定重鏈區(qū):GenBank登記入冊號#:K01316
[0167]人類K輕鏈恒定區(qū)=GenBank登記入冊號# J00241。
[0168]在代表性【具體實(shí)施方式】中，為生產(chǎn)從1-7F9或1-4F1VH和VL序列產(chǎn)生的重組mAb，可以應(yīng)用下列方案。步驟1-3描述了從雜交瘤或其他產(chǎn)生1-7F9或1-4F1的細(xì)胞中檢索VH和VL區(qū)。然而，用于步驟4中的編碼1-7F9或1-4F1VH和VL序列(或其突變體或衍生物)的cDNA，也可以使用建立好的合成DNA片段的技術(shù)，從圖14或15中提供的序列信息進(jìn)行制備。備擇地，為了表達(dá)全長抗體，1-7F9或1-4F1，或其突變體或衍生物的VH和VL片段可以克隆入包含期望的免疫球蛋白亞類恒定區(qū)的科學(xué)文獻(xiàn)中描述的許多表達(dá)載體的任一和/或商業(yè)上可獲得的表達(dá)載體。另外地，為了表達(dá)抗體片段(例如Fab片段)，1-7F9或1-4F1，或其突變體或衍生物的VH和VL片段可以克隆入編碼截短的恒定區(qū)的載體。商業(yè)上可獲得載體的一個例子是PASK84，可以從ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，目錄號87094)得到。
[0169](I)從雜交瘤細(xì)胞中分離總RNA
[0170]使用Qiagen的RNea sy小試劑盒,根據(jù)廠商說明書，分泌針對人類KIR抗體的4xl06雜交瘤細(xì)胞(例如1-7F9或1-4F1)用于分離總RNA，并簡要略述如下:細(xì)胞通過1000rpm離心5分鐘而成粒狀并通過添加包含10 μ I/ml β -巰基乙醇的350 μ I RLT緩沖液破裂。將裂解物轉(zhuǎn)移到來自Qiagen的QIA shredder柱并以最大速度離心2分鐘。流通物與等量的70%乙醇混合。每個Rneasy旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen)適用至多700 μ I樣品并以14000rpm離心，并丟棄流通物。每一柱適用700 μ IRffl緩沖液，以HOOOrpm離心15秒洗滌柱。用500 μ IRPE緩沖液洗滌柱兩次并以HOOOrpm離心15秒。為了干燥柱，以HOOOrpm另外離心2分鐘。柱轉(zhuǎn)移到新的收集管，并且用50 μ I無核酸酶的水洗脫RNA并以HOOOrpm離心I分鐘。通過0D=260nm的吸光度測量RNA濃度。RNA儲存于_80°C，直到需要時為止。
[0171](2)cDNA 合成:
[0172]使用Clontech的SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，使用Iyg RNA合成第一鏈cDNA。為了制備5’ -RACE-Ready cDNA，制備包含如上所述分離的RNA、反向引物5’ -⑶S引物背和SMART II A寡核苷酸的反應(yīng)混合物，和該混合物在72°C孵育大約2分鐘，并且隨后在冰上冷卻大約2分鐘，然后加Ix第一鏈緩沖液、DTT(20mM) ^dNTP(IOmM)和PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)混合物在42°C孵育1.5小時，并且加三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)-EDT緩沖液并在72°C孵育7分鐘。在這點(diǎn)上，樣品可以儲存在_20°C。
[0173](3)人類可變輕鏈(VL)區(qū)和人類可變重鏈(VH)區(qū)的克隆和PCR擴(kuò)增:
[0174]為了從上面制備的cDNA中分離擴(kuò)增VL和VH 二者的可變區(qū)，建立了包含IxAdvantage HF2PCR 緩沖液、dNTP(IOmM)和 IxAdvantage HF2 多聚酶混合物的 PCR(多聚酶鏈反應(yīng))反應(yīng)混合物。
[0175]為了擴(kuò)增VL，使用了下列引物:
[0176]UPM (通用引物混合物):[0177]5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，(SEQ ID NO:26)
[0178]5，-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEQ ID NO:27)
[0179]VK RACE2:
[0180]5，-GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3’ (SEQ ID NO:28)
[0181]為了擴(kuò)增VH，使用了下列引物:
[0182]UPM (通用引物混合物):
[0183]5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，(SEQ ID NO:29)
[0184]5’-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEQ ID NO:30)
[0185]AB90RACE:
[0186]5，-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-3’ (SEQ ID NO:31)
[0187]進(jìn)行三輪PCR。第一輪:PCR進(jìn)行5循環(huán)的94°C 5秒和72°C 3分鐘。第二輪:PCR進(jìn)行5循環(huán)的94°C 5秒，70°C 10秒和72°C I分鐘。第三輪:PCR進(jìn)行28循環(huán)的94°C 5秒，68 0C 10秒和72 0C I分鐘。
[0188]通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析而且使用Qiagen的QIAEXl I瓊脂糖凝膠提取試劑盒，從凝膠中純化DNA。
[0189]使用Invitrogen的TOPO TA克隆試劑盒將純化的PCR產(chǎn)物引入PCR4-T0P0載體并用來轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞。
`[0190]通過集落PCR，使用Taq多聚酶、IxTaq多聚酶緩沖液、dNTP (IOmM)和下列引物和PCR程序，對適當(dāng)數(shù)量的菌落進(jìn)行分析:
[0191]M13 正向引物:5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3’ (SEQ ID NO:32)
[0192]M13 反向引物:5’ -CAGGAAACAGCTATGAC-3’ (SEQ ID NO:33)
[0193]PCR 程序:
[0194]進(jìn)行25循環(huán)的94V 30秒、55 °C 30秒和72 °C I分鐘。
[0195]對來自分別含有VL和VH插入片段的克隆的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行提取并使用上面列出的M13正向引物和M13反向引物進(jìn)行測序。就人類抗KIR mAbl_7F9來說，編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列如圖15所示。
[0196](4)抗體基因亞克隆進(jìn)入哺乳動物表達(dá)載體
[0197]基于對編碼mAb的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNAs的序列數(shù)據(jù)，分別設(shè)計引物來擴(kuò)增可變輕(VL)鏈和可變重(VH)鏈基因。通過PCR對可變區(qū)進(jìn)行設(shè)計(format)以包括Kozak序列、前導(dǎo)序列和獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)。對于VL，這是通過設(shè)計5’ PCR引物，以引入HindIII位點(diǎn)、Kozak序列而且與可變輕鏈區(qū)的前導(dǎo)序列的5’端同源來實(shí)現(xiàn)的。3’引物與可變區(qū)的3’端是同源的，并且在可變區(qū)的3’邊界引入BsiWI位點(diǎn)。VH區(qū)以相似的方式產(chǎn)生，除了將NotI和NheI位點(diǎn)分別引入5’和3，端，代替HindIII和BsiffI之外。
[0198]使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將擴(kuò)增的基因產(chǎn)物各自克隆進(jìn)入一個包含輕鏈和重鏈恒定區(qū)的真核表達(dá)載體。用HindIII和BsiWI消化VL DNA片段，并連接入真核表達(dá)載體，該載體包含編碼氨芐青霉素抗性的內(nèi)酰胺酶基因和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(PUC);得到的質(zhì)粒命名為VLCL0用NotI和NheI消化VH DNA片段，并引入由如上所述引入VL片段產(chǎn)生的VLCL載體。得到的質(zhì)粒包含編碼相同質(zhì)粒上抗體的重鏈和輕鏈二者的功能性表達(dá)盒。連接的質(zhì)粒用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌。質(zhì)粒DNA從這些氨芐青霉素抗性細(xì)菌群落中制備并用來轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細(xì)胞，或其他哺乳動物細(xì)胞系中。通過例如在“Molecular Cloning” Sambrook等中所述標(biāo)準(zhǔn)方法，完成轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)果為穩(wěn)定地表達(dá)并分泌目標(biāo)抗體分子，例如1-7F9或1-4F1人類抗KIR mAb或含有1-7F9或1-4F1的VH和VL區(qū)的mAb,或另外人類抗KIRmAb的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
[0199]抗體的變體可以容易地產(chǎn)生。例如，與1-7F9或1-4F1具有精確相同特異性，但與IgG4或IgG2相比分別地為不同的同種型的抗體，可以通過亞克隆編碼1-7F9或1-4F1的VL和VH的cDNA進(jìn)入包含編碼K輕鏈恒定區(qū)和選自IgGl或IgG2或IgG3或IgG4重鏈恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)cDNA的質(zhì)粒獲得。因而，如所產(chǎn)生的抗體能具有任意的同種型而且然后該抗體可以使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)進(jìn)行同種型轉(zhuǎn)換。這種技術(shù)包括使用直接重組技術(shù)(見，例如美國專利4，816，397)，細(xì)胞-細(xì)胞融合技術(shù)(見例如美國專利5，916，771)，和本領(lǐng)域已知的其他適合的技術(shù)。因此，通過同種型轉(zhuǎn)換為，例如用于包括治療用途的不同用途的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗體,本發(fā)明提供的抗體效應(yīng)物功能相對于親本抗體的同種型可以“變化”。
[0200]因而，在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了雜交瘤，其含有:(a)來自哺乳動物宿主(典型地非人類哺乳動物宿主)的B細(xì)胞，該宿主已經(jīng)用抗原進(jìn)行了免疫，其中抗原含有存在于抑制性KIR多肽上的表位，其融合至(b)無限增殖化細(xì)胞(例如骨髓瘤細(xì)胞)，其中所述雜交瘤產(chǎn)生結(jié)合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體的單克隆抗體，并在表達(dá)所述至少兩種不同的人類抑制性KIR受體的NK細(xì)胞的群體中，能至少實(shí)質(zhì)上中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制作用。在一個【具體實(shí)施方式】中，哺乳動物宿主是能產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動物。任選地，所述雜交瘤不產(chǎn)生單克隆抗體NKVSFl、不產(chǎn)生A210和/或不產(chǎn)生A802g。在不同的【具體實(shí)施方式】中，抗體結(jié)合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者上的KIR2DL1和KIR2DL2/3受體或共同決定簇。雜交瘤可以產(chǎn)生抗體，該抗體抑制在80位有賴氨酸殘基的HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL1受體結(jié)合，抑制在80位有天冬酰胺殘基的HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL2/3受體結(jié)合。例如，在雜交瘤可以產(chǎn)生與單克隆抗體1-7F9或1-4F1結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同的在任一 KIR2DL1或KIR2DL2/3或KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者上的表位。
[0201]本發(fā)明也提供了產(chǎn) 生與多個KIR2DL基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)而且降低或中和這種KIRs抑制活性的抗體的方法，所述方法含有如下步驟:
[0202](a)用含有KIR2DL多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
[0203](b)從所述免疫的哺乳動物中制備抗體，其中所述抗體結(jié)合所述的KIR2DL多肽，
[0204](c)選擇(b)的與至少兩種不同的KIR2DL基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的抗體，和
[0205](d)選擇(C)的加強(qiáng)NK細(xì)胞的抗體。在一個【具體實(shí)施方式】中，所述非人類哺乳動物被設(shè)計以表達(dá)人類抗體所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物(例如非人類含有人類免疫球蛋白基因座和天然的免疫球蛋白基因缺失的哺乳動物，例如Xeno mouse?(Abgenix - Fremont,CA，USA)或含有人類免疫球蛋白編碼基因的微衛(wèi)星基因座的非人類哺乳動物，例如HuMabmouse? (Medarex - Princeton, NJ, USA))。任選地,可以用獲得抗KIR mAbs的備擇的方法代替步驟a和b，包括不限于，使用噬菌體展示或人類B細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，或本領(lǐng)域已知的其它方法。任選地，該方法進(jìn)一步含有選擇在靈長類，優(yōu)選結(jié)合獼猴中KIR的抗體，NK細(xì)胞或KIR多肽。任選地，本發(fā)明進(jìn)一步含有評價抗KIR抗體的方法，其中根據(jù)上面方法產(chǎn)生的抗體給靈長類，優(yōu)選獼猴施用，優(yōu)選地其中觀察猴抗體毒性指示的存在或缺乏。[0206]本發(fā)明也提供了生產(chǎn)結(jié)合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的抗體的方法，其中該抗體通過表達(dá)至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞的群體，能中和KIR介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制(或加強(qiáng)NK細(xì)胞毒性)，該方法含有如下步驟:
[0207](a)用含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
[0208](b)從免疫的動物中制備抗體，其中抗體結(jié)合KIR多肽，
[0209](c)選擇(b)的與至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的抗體，和
[0210](d)選擇(C)的抗體，該抗體能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性對表達(dá)至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞的群體的抑制作用，其中步驟(c)和(d)的順序任意地顛倒，并且任選地重復(fù)任意數(shù)目的步驟一次或多次。在一個【具體實(shí)施方式】中，用于免疫的抑制性KIR多肽可以為一個或更多的KIR2DL多肽而且在步驟(c)中選擇的抗體與至少KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，抗體識別存在于至少兩種不同的KIR受體基因產(chǎn)物上的共同決定簇；最優(yōu)選地，KIRs是KIR2DL1和KIR2DL2/3。在一個【具體實(shí)施方式】中，步驟(c)含有選擇與至少一種KIR2DL和一種KIR3DL受體基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的抗體。例如選擇的抗體能與KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR3DL1和/或KIR3DL2反應(yīng)。任選地，該方法進(jìn)一步含有選擇結(jié)合靈長類，優(yōu)選獼猴，NK細(xì)胞或KIR多肽的抗體。任選地，本發(fā)明還包括評價抗體的方法，其中將根據(jù)上述方法生產(chǎn)的抗體給予靈長類，優(yōu)選獼猴，優(yōu)選地其中觀察猴抗體毒性指示的存在或缺乏。
[0211]任選地，上面描述的方法中，在步驟c)或d)中選擇的抗體不是NKVSFl，不是A210和/或不是A802g。優(yōu)選地，在在上面方法中的步驟(b)中制備的抗體是單克隆抗體。優(yōu)選地在上面方法的步驟(c)中選擇的抗體抑制一個或更多在80位有賴氨酸殘基的HLA-C同種異型結(jié)合人類KIR2DL1受體，和一個或更多在80位有天冬酰胺殘基的HLA-C同種異型結(jié)合人類KIR2DL2/3受體。優(yōu)選地，在上面方法的步驟(d)中選擇的抗體引起NK細(xì)胞毒性的增強(qiáng)，或KIR介導(dǎo)的抑制NK細(xì)胞毒性的中和作用。優(yōu)選地，該抗體與單克隆抗體1-7F9結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同的KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的表位。任選地，該方法還或備擇地含有如下附加步驟:制造選擇的單克隆抗體的片段，制造選擇的單克隆抗體的衍生物(例如通過與放射性核素、細(xì)胞毒性藥劑、報道分子或類似物綴合)，或制造從中產(chǎn)生的抗體片段，或含有對應(yīng)于這種單克隆抗體序列的序列抗體片段的衍生物。在另一方面，這種抗體的變體可以通過制備含有，通過上面描述的方法，通過使用已知的基因工程方法獲得的抗體的變異的氨基酸序列(例如被修飾以便改變該抗體的結(jié)合特性，增加或減少該抗體的穩(wěn)定性，增強(qiáng)抗體的純化，增強(qiáng)抗體的檢測，和/或改變抗體對于將被施用該抗體的宿主的免疫學(xué)特性的序列)。
[0212]本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)結(jié)合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的抗體的方法，其中該抗體能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性對表達(dá)至少一種所述不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞的群體的抑制作用(或加強(qiáng)NK細(xì)胞毒性)，該方法含有如下步驟:
[0213](a)從文庫或全部組成部分中，選擇與至少兩種不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的單克隆抗體或抗體片段，并且
[0214](b)選擇能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性在表達(dá)至少兩種不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞的群體中的抑制作用的(a)的抗體。優(yōu)選地，該抗體結(jié)合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇。任選地，在步驟(b)中選擇的抗體不是NKVSFl。優(yōu)選地，在步驟(b)中選擇的抗體抑制在80位有賴氨酸殘基的HLA-c等位分子結(jié)合人類KIR2DL1受體，和在80位有天冬酰胺殘基的HLA-C等位分子結(jié)合人類KIR2DL2/3受體。優(yōu)選地，在步驟(b)中選擇的抗體引起NK細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。優(yōu)選地，該抗體與單克隆抗體1-7F9結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同的KIR2DL1和/或KIR2DL2/3上的表位。備擇地，該抗體與單克隆抗體1-4F1結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同表位。任選地，該方法含有如下附加步驟:制造選擇的單克隆抗體的片段，制造選擇的單克隆抗體的衍生物，或制造選擇的單克隆抗體片段的衍生物。
[0215]另外，本發(fā)明也提供了生產(chǎn)結(jié)合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的抗體的方法，其中該抗體能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性在表達(dá)兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物中至少一種的NK細(xì)胞的群體中的抑制作用，該方法含有如下步驟:
[0216]a)在允許生產(chǎn)單克隆抗體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤；并且
[0217]b)從雜交瘤細(xì)胞中分離單克隆抗體。任選地該方法含有如下附加步驟:制造單克隆抗體的片段、制造單克隆抗體的衍生物或制造這種單克隆抗體片段的衍生物。優(yōu)選地，該抗體結(jié)合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇。
[0218]本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)結(jié)合至少兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物的抗體，其中該抗體能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性在表達(dá)兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物中至少一種的NK細(xì)胞的群體中的抑制作用，該方法含有如下步驟:
[0219](a)從本發(fā)明的雜交瘤中分離編碼單克隆抗體的核酸；
[0220](b)任選地修飾該核酸以便獲得修飾的核酸，該修飾的核酸含有編碼修飾的或衍生的抗體的序列，該修飾或衍 生的抗體含有對應(yīng)于單克隆抗體的功能序列或與其實(shí)質(zhì)上相似的(例如與這種序列為至少大約65%、至少大約75%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%(例如大約70-99%)相同)的氨基酸序列，其選自人源化抗體、嵌合的抗體、單鏈抗體、抗體的免疫活性片段或含有這種免疫活性片段的融合蛋白；
[0221](C)將核酸或修飾的核酸(或編碼相同氨基酸序列的相關(guān)核酸)插入到表達(dá)載體中，其中當(dāng)表達(dá)載體存在于在適當(dāng)?shù)臈l件下生長的宿主細(xì)胞中時，編碼的抗體或抗體片段能進(jìn)行表達(dá)；
[0222]d)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞不另外產(chǎn)生免疫球蛋白；
[0223]e)在引起抗體或抗體片段表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；而且
[0224]f)分離由轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的產(chǎn)生的抗體或抗體片段。優(yōu)選地該抗體結(jié)合存在于KIR2DL1和KIR2DL2/3上的共同決定簇。
[0225]抗體篩選和選擇
[0226]本發(fā)明特別的抗體能夠降低或中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制作用；特別是由KIR2DL受體介導(dǎo)的抑制作用而且更特別地是至少KIR2DL1-和KIR2DL2/3- 二者介導(dǎo)的抑制作用。因而，這些抗體是“中和”、“阻斷”或“抑制性”抗體，在這個意義上，當(dāng)這些與MHC I類分子相互作用時，他們至少部分或可檢測地降低、中和和/或阻斷由KIR受體介導(dǎo)的抑制性信號通路。更重要地，關(guān)于幾種類型的抑制性KIR受體，優(yōu)選幾種KIR2DL受體基因產(chǎn)物，并且更優(yōu)選地至少KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者，展示了該中和作用活性，以便這些抗體可以高功效地用于大多數(shù)或全部人類受試者中。KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性抑制作用的中和，如在本文所述，可以通過不同的分析或試驗(yàn)，例如標(biāo)準(zhǔn)的體外細(xì)胞毒性分析進(jìn)行評估。
[0227]一旦鑒別與多種抑制劑KIR受體交叉反應(yīng)的抗體，就可以測定其在完整的NK細(xì)胞中降低或中和那些KIR受體的抑制作用的能力。在特定變體中，中和活性可以通過所述抗體通過表達(dá)HLA-C的靶標(biāo)的KIR2DL表達(dá)性NK細(xì)胞重建裂解的能力來闡明。在另一個特定【具體實(shí)施方式】中，抗體的中和活性是通過該抗體阻斷或降低HLA-C分子結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL3(或密切相關(guān)的KIR2DL2)受體的能力定義的，進(jìn)一步優(yōu)選地的是用該抗體改變KIR2DL2/3結(jié)合選自Cwl、Cw3、Cw7和Cw8的HLA-C分子(或在80位有天冬酰胺殘基的另外的HLA-C分子)和/或KIR2DL1結(jié)合選自Cw2、Cw4、Cw5和Cw6的HLA-C分子(或在80位有賴氨酸殘基的另外的HLA-C分子)的能力來定義它。
[0228]在另外的變體中，如在本文提供的實(shí)施例中過公開的，本發(fā)明抗體的中和活性可以在基于細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中進(jìn)行評估。
[0229]在另外的變體中，本發(fā)明的抗體的中和活性可以在釋放細(xì)胞因子的試驗(yàn)中進(jìn)行評估，其中NK細(xì)胞用檢測抗體和表達(dá)NK群體的KIR分子識別的一種HLA-C等位基因的靶細(xì)胞系孵育，以刺激NK細(xì)胞因子產(chǎn)生(例如IFN- Y和/或GM-CSF產(chǎn)生)。在代表性的方案中，在培養(yǎng)基中大約4天后，從PBMC產(chǎn)生IFN- Y通過細(xì)胞表面和胞質(zhì)內(nèi)染色，和由流式細(xì)胞儀的分析進(jìn)行評估。簡要地，布雷菲德菌素A (Sigma Aldrich)可以以大約5 μ g/ml的終濃度添加用于培養(yǎng)最少大約4小時。然后,細(xì)胞可以在透化(IntraPrep? ;Beckman Coulter)之前與抗CD3和抗CD56mAb孵育，并且用PE-抗IFN- Y或PE-1gGl (Pharmingen)染色?？梢允褂肊LISA進(jìn)行測量上清中從多克隆活化的NK細(xì)胞中產(chǎn)生GM-CSF和IFN(GM_CSF =DuoSetElisa, R&D Systems, Minneapolis, MN ；IFN- y:OptElA set, Pharmingen)。
[0230]本發(fā)明的抗體可以部分地(也就是降低)或完全地中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的抑制作用。例如本發(fā)明優(yōu)選的抗體能夠誘導(dǎo)或增加HLA-匹配的，或HLA-兼容的，或自體靶細(xì)胞群，也就是在所述抗體缺乏時，NK細(xì)胞不能有效地裂解的細(xì)胞群的裂解。因此，本發(fā)明的抗體也可以定義為在體內(nèi)和/或體外促進(jìn)NK細(xì)胞活性。
`[0231]在特定的【具體實(shí)施方式】中，所述抗體與單克隆抗體DF200(由雜交瘤DF200產(chǎn)生)，1-7F9,或1-4F1，結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同的表位。這種抗體在本文分別被稱為“DF200樣抗體”、“1-7F9-樣抗體”和“1-4F1-樣抗體”。在進(jìn)一步優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，抗體是單克隆抗體。更優(yōu)選的本發(fā)明的“DF200樣抗體”是除單克隆抗體NKVSFl以外的抗體。最優(yōu)選的是單克隆抗體1-7F9或1-4F1，和含有1-7F9或1-4F1的VH和/或VL區(qū)的抗體。
[0232]與在本文描述的單克隆抗體結(jié)合實(shí)質(zhì)上或基本上相同表位的一種或更多抗體的鑒定可以使用其中能評估抗體競爭的多種免疫學(xué)篩選試驗(yàn)中的任一種容易地進(jìn)行測定。許多的這類試驗(yàn)被常規(guī)地進(jìn)行而且為本領(lǐng)域眾所周知(見，例如美國專利N0.5，660，827，1997，08.26授權(quán)，其特別通過引用將其并入本申請)。將要理解，為鑒別與本文描述的單克隆抗體結(jié)合相同或?qū)嵸|(zhì)上相同表位的抗體，并不是任何時候都必需實(shí)際測定在本文描述的抗體結(jié)合的表位。
[0233]例如，當(dāng)將要檢查的測試抗體從不同來源動物獲得，或甚至具有不同的免疫球蛋白同種型，可以應(yīng)用簡單競爭試驗(yàn)，其中對照抗體(例如DF200)與測試抗體混合，然后應(yīng)用到含有KIR2DL1和/或KIR2DL2/3任一或二者的樣品，已知它們中的每一個與DF200結(jié)合?；贓LISAs、放射免疫測定法、免疫印跡和應(yīng)用BIACORE分析(如所描述，例如在本文實(shí)施例部分中)的方案，適于在這種簡單競爭研究中使用。
[0234]在一些【具體實(shí)施方式】中，在應(yīng)用于KIR抗原樣品以前，將對照抗體(例如，1-7F9或1-4F1)與數(shù)量變化的測試抗體(例如以大約1:1、1:2、1:10或大約1:100比率)預(yù)先混合一段時間。在其他的【具體實(shí)施方式】中，在暴露于KIR抗原樣品期間，對照和數(shù)量變化的測試抗體可以簡單地分別進(jìn)行添加并混合。只要能將結(jié)合抗體與游離抗體區(qū)分(例如通過使用分離或洗滌技術(shù)以除去未結(jié)合抗體)并區(qū)分對照抗體與測試抗體(例如通過使用物種特異性或同種型特異的二抗或通過用可檢測到的標(biāo)記特異地標(biāo)記對照抗體)，將能確定測試抗體是否降低對照抗體結(jié)合不同的KIR2DL抗原，提示測試抗體與1-7F9識別實(shí)質(zhì)上相同表位。(標(biāo)記的)對照抗體的結(jié)合在存在完全不相關(guān)的抗體(其不結(jié)合KIR)時能用作對照高值。對照低值能通過用相同但未標(biāo)記對照抗體孵育標(biāo)記對照抗體獲得，而競爭將發(fā)生并降低標(biāo)記抗體的結(jié)合。在測試分析中，存在測試抗體時標(biāo)記抗體反應(yīng)性顯著降低表現(xiàn)了識別實(shí)質(zhì)上相同表位的測試抗體，也就是與標(biāo)記的對照抗體競爭的抗體。例如，以大約1:1或1:10和大約1:100之間任何比率的1-7F9:測試抗體或1-4F1:測試抗體，降低1-7F9或1-4F1與KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原二者結(jié)合至少大約50%，例如至少大約60%，或更優(yōu)選地至少大約70%(例如大約65-100%)的任何測試抗體，被認(rèn)為是分別與1-7F9或1-4F1結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同表位或決定簇的抗體。優(yōu)選地，這種測試抗體將降低1-7F9結(jié)合至少一個其它的，優(yōu)選地每一個KIR2DL抗原，優(yōu)選地至少大約50%、至少大約60%、至少大約80%或至少大約90%(例如大約95%)的在缺乏測試抗體時觀察到的1-7F9或1-4F1的結(jié)合。當(dāng)然，這種方法可適合于鑒別和/或評價與其它抗體和/或KIR抗原競爭的抗體。
[0235]競爭能同樣或備擇地通過，例如流式細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)行評估。在這種試驗(yàn)中，具有給定的KIR的細(xì)胞可以首先與對照抗體(例如，1-7F9或1-4F1)孵育，并且然后與用熒光染料或生物素標(biāo)記的測試抗體孵育。如果與飽和量的對照抗體預(yù)孵化獲得的結(jié)合為通過測試抗體不與對照抗體進(jìn)行預(yù)孵化獲得的結(jié)合(如依靠熒光測量)的大約80%，優(yōu)選地大約50%、大約40%或更低(例如大約30%)，表示該抗體與對照抗體競爭。備擇地，如果在用飽和量的測試抗體預(yù)孵化的細(xì)胞上，用標(biāo)記對照抗體(通過熒光燃料或生物素)獲得的結(jié)合為未用測試抗體預(yù)孵化獲得的結(jié)合的大約 80%，優(yōu)選地大約50%、大約40%，或更低(例如大約30%)，表示抗體與對照抗體競爭。
[0236]其中以飽和濃度預(yù)吸附和應(yīng)用測試抗體到其上固定有KIR2DL1或KIR2DL2/3任一或二者的表面的簡單競爭分析，同樣可以方便地利用。簡單競爭分析中的表面優(yōu)選地為BIACORE芯片(或其它適于表面胞質(zhì)基因組共振分析的介質(zhì))。測量對照抗體(例如1-7F9或1-4F1)與KIR-包被的表面的這種結(jié)合。該對照抗體單獨(dú)與包含KIR表面的結(jié)合與存在測試抗體時對照抗體的結(jié)合比較。存在測試抗體時由對照抗體與包含KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面的結(jié)合顯著降低，表明測試抗體與對照抗體識別實(shí)質(zhì)上相同表位，這樣測試抗體與對照抗體“競爭”。任何降低對照抗體(例如1-7F9或1-4F1)與KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原二者的結(jié)合至少大約20%或更多、至少大約40%、至少大約50%、至少大約70%或更多的測試抗體，可以認(rèn)為是與對照抗體(例如1-7F9或1-4F1)結(jié)合實(shí)質(zhì)上相同表位或決定簇的抗體。優(yōu)選地，這種測試抗體將降低對照抗體(例如1-7F9或1-4F1)與每一種KIR2DL抗原的結(jié)合至少大約50%(例如至少大約60%，至少大約70%或更多)。將要理解，對照抗體和測試抗體的順序可以顛倒進(jìn)行；也就是對照抗體可以首先結(jié)合表面而且然后在其后的競爭試驗(yàn)中測試抗體與表面接觸。優(yōu)選地，對KIR2DL1和KIR2DL2/3抗原具有更高親和力的抗體首先結(jié)合包含KIR2DL1和KIR2DL2/3的表面，因?yàn)轭A(yù)期對于二抗(假設(shè)抗體是競爭性的)所觀察到的結(jié)合將會更大幅度地減少。在本文的實(shí)施例中，和在例如Saunal和Regenmortel, (1995) J.1mmunol.Methodsl83:33-41 中提供了這種試驗(yàn)的進(jìn)一步的例子，其公開內(nèi)容在本文通過參考并入本申請。
[0237]盡管為例證的目的，在1-7F9或1-4F1的上下文中進(jìn)行了描述，但將要理解上面描述的篩選試驗(yàn)也可以用于鑒別與NKVSF1、DF200、EB6、GL183和根據(jù)本發(fā)明其它抗體、抗體片段和抗體衍生物中一種或多種競爭的抗體。
[0238]在脊椎動物或細(xì)胞中免疫并產(chǎn)生抗體后，可以進(jìn)行特別的選擇步驟以分離所要求保護(hù)的抗體。在這點(diǎn)上，在特定的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明也涉及產(chǎn)生這種抗體的方法，它包括如下步驟:
[0239](a)用含有抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
[0240](b)從所述免疫的動物中制備抗體，其中所述抗體結(jié)合所述KIR多肽，
[0241](c)選擇與至少兩種不同的抑制性KIR基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的(b)的抗體，和
[0242](d)選擇能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性對表達(dá)所述兩種不同的人類抑制性KIR受體基因產(chǎn)物中至少一種的NK細(xì)胞的群體的抑制作用的(c)的抗體。
[0243]在某些【具體實(shí)施方式】中，在上面的步驟(C)和(d)之間，進(jìn)行附加步驟，以選擇不與KIR2DS4反應(yīng)的抗KIR mA bs。
[0244]與至少兩種不同的抑制性KIR基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的抗體選擇可以通過篩選針對兩種或更多種不同的抑制性KIR抗原的抗體完成。在更優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在步驟(b)中制備的抗體是單克隆抗體。因而，如在本文所使用，術(shù)語“從所述免疫的動物中制備抗體”，包括從免疫的動物中獲得B細(xì)胞并使用那些B細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)抗體的雜交瘤，以及直接從免疫動物的血清中獲得抗體。在另一個優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，在步驟(c)中選擇的抗體是與至少KIR2DL1和KIR2DL2/3交叉反應(yīng)的那些。
[0245]還有在另一個【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)在對表達(dá)同源HLA I類分子的靶細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放試驗(yàn)中所測量時，與在缺乏抗KIR mAb時特異性裂解比較，在步驟(d)中選擇的抗體引起由顯示至少一個被抗體識別的KIR的NK細(xì)胞介導(dǎo)的至少大約10%更多的特異性裂解，并且優(yōu)選地至少大約40%更多的特異性裂解，至少大約50%更高的特異性裂解或更優(yōu)選地至少增加大約70%特異性裂解(例如大約增加60-100%特異性裂解)。備擇地，在步驟(d)中選擇的抗體當(dāng)用于鉻釋放試驗(yàn)時，該試驗(yàn)應(yīng)用表達(dá)一種或幾種抑制性KIRs的NK細(xì)胞克隆和表達(dá)至少一個HLA等位基因(它被NK克隆上的KIRs之一識別)的靶細(xì)胞，用該抗體獲得的細(xì)胞毒性水平應(yīng)為以相同的效應(yīng)物:祀細(xì)胞比率，用相同濃度的DF200或用阻斷抗MHCI類抗體獲得的特異細(xì)胞毒性的至少大約20%，優(yōu)選地至少大約30%或更多。
[0246]上面剛剛描述的方法的步驟(C)和(d)的順序可以改變。任選地，該方法同樣或備擇地可以進(jìn)一步含有制造單克隆抗體片段或單克隆抗體的衍生物或例如在本文別處所描述的這樣的片段的附加步驟。
[0247]在另一個變體中，本發(fā)明提供了獲得抗體的方法，它包括如下步驟:
[0248](a)從文庫或全部組成部分中，選擇與至少兩種不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)的單克隆抗體、單克隆抗體片段或其任一的衍生物，并且
[0249](b)選擇能中和KIR介導(dǎo)的NK細(xì)胞細(xì)胞毒性對表達(dá)所述至少兩種不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產(chǎn)物的NK細(xì)胞群體的抑制作用的(a)的抗體。
[0250]所有組成成分可能是任何(重組的)抗體或其片段的所有組成成分，任選地通過任何適當(dāng)結(jié)構(gòu)(例如噬菌體、細(xì)菌、合成復(fù)合體等)進(jìn)行顯示。抑制性抗體的選擇可以如上面所公開的進(jìn)行，并在實(shí)施例中進(jìn)一步闡明。
[0251 ] KIR2DL1、_2和_3 (KIR2DL1-3)的胞外域的計算機(jī)模擬，基于其公布的晶體結(jié)構(gòu)(Maenaka 等 Structure with Folding and designl999 ；7:391-398 ；Fan 等，Natureimmunology2001 ；2:452-460 ；Boyington 等 Nature, 2000 ；405:537-543)，揭示在這些 KIR和抗KIR2DL交叉反應(yīng)性鼠單克隆抗體DF200和NKVSFl之間的相互作用中涉及一些區(qū)或KIR2DLU-2和-3。因而，在一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了在由氨基酸殘基(105、106、
107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、
158、159、160、161、162、163、181和192)限定的區(qū)域中唯一地結(jié)合KIR2DL1的抗體。在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2/3而不與由殘基(105、106、107、
108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、
159、160、161、162、163、181和192)限定的區(qū)域外面的氨基酸殘基相互作用的抗體。
[0252]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1和不結(jié)合其中R131(也就是在KIR2DL1突變體131位的精氨酸殘基)是丙氨酸殘基(也就是被丙氨酸殘基取代)的KIR2DL1突變體的抗體。
[0253]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1和不結(jié)合其中R157是丙氨酸的KIR2DL1突變體的抗體。
[0254]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1和不結(jié)合其中R158是丙氨酸的KIR2DL1突變體的抗體。
[0255]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1殘基131，157，和158的抗體。
[0256]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DS3 (R131W)，但不結(jié)合野生型KIR2DS3的抗體。
[0257]在特殊的【具體實(shí)施方式】中，所述抗體只在由氨基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87和Y88 (其中字母指的是氨基酸的單一字母代碼，并且數(shù)字為KIR2DL1(SEQ ID NO:23)的殘基位置，使用在Wagtmann等，Immunityl995 ;2:439-449中描述的編號系統(tǒng))限定的區(qū)域中結(jié)合KIR2DL1。這些殘基已被鑒定為1-7F9KIR2DL1表位(見實(shí)施例11)。
[0258]在另一個【具體實(shí)施方式】中，抗體結(jié)合KIR2DL1序列中由SEQ ID NO:23的L38到Y(jié)88片段組成的抗原表位。在還有一個【具體實(shí)施方式】中，抗體結(jié)合KIR2DL1序列中含有SEQID NO:23的L38到Y(jié)88片段的抗原表位。
[0259]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2/3而不與殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 限定區(qū)域外的
氨基酸殘基相互作用的抗體。
[0260]在另一個【具體實(shí)施方式】中，抗體在含有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多的氨基酸殘基 L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87和Y88的區(qū)域中結(jié)合KIR2DL1。在特殊的【具體實(shí)施方式】中，KIR2DL1對抗體的表位含有氨基酸殘基M44和F45 (見實(shí)施例9和11)。
[0261]在另一個【具體實(shí)施方式】中，抗體在含有至少1、2、4、6、8、10或12或全部氨基酸殘基 L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 的區(qū)域中結(jié)合KIR2DL1。在特殊的【具體實(shí)施方式】中，該區(qū)域含有氨基酸殘基M44和F45和任選地至少1、2、4、6、8、10 或全部的 L38、R41、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 (見實(shí)施例9和11)。在另一個特殊的【具體實(shí)施方式】中，該區(qū)域含有至少氨基酸殘基M44、F45和D72，其在1-7F9表位和HLA-C結(jié)合部位重疊的KIR2DL1區(qū)域。
[0262]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1、KIR2DL2/3和KIR2DS4的抗體。
[0263]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者但不結(jié)合KIR2DS4的抗體。
[0264]在另一個【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供了結(jié)合KIR2DL1和KIR2DL2/3 二者但不結(jié)合KIR2DS3或KIR2DS4的抗體。
[0265]確定在上面限定的表位區(qū)之一內(nèi)的抗體、抗體片段或抗體衍生物是否結(jié)合，可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。見，例如實(shí)施例9和11。在這種繪圖/表征方法的另一個實(shí)施例中，對于抗KIR抗 體的表位區(qū)可以通過表位〃足跡法〃，使用KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白質(zhì)中暴露的胺/羧基的化學(xué)修飾進(jìn)行確定。這種足跡法技術(shù)的一個特定的例子是使用HXMS (通過質(zhì)譜法檢測到的氫-氘交換)，其中發(fā)生受體和配體蛋白質(zhì)酰胺質(zhì)子的氫/氘交換，結(jié)合，并且反向(back)交換，其中參與蛋白質(zhì)結(jié)合的主鏈酰胺基團(tuán)被保護(hù)不進(jìn)行反向交換而且因此將仍然是氘化的。有關(guān)的區(qū)域可以在這點(diǎn)上通過消化性蛋白酶解，快速微孔高效液相色譜法分離，和/或電噴射離子化質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定。見，例如Ehring H,AnalyticalBiochemistry, Vol.267 (2) pp.252-259(1999)和 / 或 Engen, J.R.和 Smith, D.L.(2001)Anal.Chem.73，256A-265A。另一個適當(dāng)?shù)谋砦昏b定技術(shù)例子是核磁共振表位作圖(NMR)，其中典型地比較游離抗原和與抗原結(jié)合肽，例如抗體復(fù)合的抗原的二維NMR光譜(spectres)中信號的位置?？乖湫偷赜?5N選擇性地同位素標(biāo)記，所以只有對應(yīng)于抗原的信號可以在NMR-譜中看到和看不到來自抗原結(jié)合肽的信號。起源于參與與抗原結(jié)合肽的相互作用的氨基酸的抗原信號，與游離抗原的光譜比較，典型地將移動在復(fù)合體中的光譜的位置，并且可以那樣確認(rèn)參與結(jié)合的氨基酸。見，例如Ernst Schering Res Found Workshop.2004 ；(44):149-67 ;Huang 等，Journal of Molecular Biology, Vol.281(l)pp.61-67(1998);和Saito 和 Patterson, Methods.1996Jun ；9 (3):516_24。
[0266]表位作圖/表征也可以使用質(zhì)譜學(xué)方法進(jìn)行。見，例如Downward, J MassSpectrom.2000Apr ；35 (4):493-503 和 Kiselar 和 Downard, Anal Chem.1999Mayl ；71 (9):1792-801 ο
[0267]蛋白酶消化技術(shù)也可以用于表位作圖和鑒定的范圍中。抗原決定簇有關(guān)的區(qū)/序列可以通過蛋白酶消化進(jìn)行確定，例如通過以與KIR2DL1或KIR2DL2/3的比率大約1:50使用胰蛋白酶，在37°C和pH7-8進(jìn)行(ο/η)消化，繼之以質(zhì)譜法(MS)分析進(jìn)行肽鑒定。由抗KIR抗體保護(hù)免于胰蛋白酶切割的肽隨后進(jìn)行鑒定，該鑒定是通過比較受到胰蛋白酶消化的樣品和用抗體進(jìn)行孵育然后受到消化例如胰蛋白酶(由此顯色抗體的足跡)的樣品進(jìn)行的。其它的酶象胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，同樣或備擇地可以用于相似的表位表征方法。而且，酶的消化能提供快速的分析潛在的抗原決定簇序列是否在結(jié)合KIR多肽的上下文中KIR2DL1的區(qū)域內(nèi)。如果多肽不是表面暴露的，根據(jù)免疫原性/抗原性最有可能不相關(guān)。關(guān)于相似技術(shù)的討論，見例如 Manca, Ann 1st Super Sanita.1991 ；27 (I):15_9。
[0268]定點(diǎn)誘變是對闡明結(jié)合表位有用的另一種技術(shù)。例如在“丙氨酸-掃描”中，在蛋白質(zhì)區(qū)段內(nèi)的每一殘基用丙氨酸殘基取代，并且對結(jié)合親和力的結(jié)果進(jìn)行了測量。如果突變導(dǎo)致結(jié)合親和力顯著地降低(resuction)，它最有可能參與結(jié)合。對結(jié)構(gòu)表位特異的單克隆抗體(也就是不結(jié)合未折疊蛋白質(zhì)的抗體)可以用于證實(shí)，丙氨酸-置換不影響蛋白質(zhì)的全部折疊。見，例如 Clackson 和 Wells, Sciencel995 ；267:383 - 386 ;和 Wells, ProcNatl Acad Sci USA1996 ；93:1 -6。
[0269]電子顯微鏡術(shù)也可以用于表位“足跡法”。例如Wang等，Naturel992 ；355 =275-278使用了冷凍電鏡術(shù)、三維圖像重構(gòu)和X-射線晶體學(xué)的協(xié)調(diào)應(yīng)用以確定天然豇豆花葉病毒的衣殼表面上Fab-片段的物理足跡。
[0270]對表位評價的其它形式的“無標(biāo)記”試驗(yàn)包括表面胞質(zhì)基因組共振(SPR，BIA⑶RE)和反射計干涉光譜學(xué)(RifS)。見，例如Fagerstam等，Journal OfMolecular Recognitionl990 ；3:208-14 ；Nice 等，J.Chromatogr.1993 ；646: 159 - 168 ；Leipert 等，Angew.Chem.1nt.Ed.1998 ；37:3308 - 3311 ； Kroger 等，Biosensors 和Bioelectronics2002；17:937_944。
[0271]抗體片段和衍生物
[0272]本發(fā)明的抗體片段和衍生物(如在本申請中使用，其包含于術(shù)語“抗體”和“抗體類”中，除非另作說明或明顯地與上下文相矛盾)，優(yōu)選地1-7F9-或1-4F1-樣抗體，可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生。“免疫反應(yīng)性片段”含有完整抗體的一部分，通常包含抗原結(jié)合部位或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括〃 K體〃(見,例如Ill等，Protein EnglO:949-57(1997))和 〃janusins〃(在本文別處進(jìn)一步描述)。Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab)2、F(ab’)2、dAb(Ward 等，(1989) Nature341:544-546);基本上由 VH 域組成)、Fd (基本上由VH和CHl域組成)和Fv (基本上由VL和VH域組成)片段；雙抗體；κ體和janusins。例如抗體片段包括具有由毗連氨基酸殘基的不間斷序列組成一級結(jié)構(gòu)的多肽(在本文稱為〃單鏈抗體片段"或"單鏈多肽")，包括不限于⑴單鏈Fv (scFv)分子⑵只包含一個輕鏈可變域的單鏈多肽，或其包含輕鏈可變域三個CDRs的片段，沒有相關(guān)重鏈部分和(3)只包含一個重鏈可變區(qū)的單鏈多肽，或其包含重鏈可變區(qū)三個CDRs的片段，沒有相關(guān)的輕鏈部分；和由抗體片段形成的多特異性抗體。例如，F(xiàn)ab或F(ab’)2片段可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)，通過分離抗體的蛋白酶消化產(chǎn)生。
[0273]將要理解，免疫反應(yīng)性片段可以使用已知方法進(jìn)行修飾，例如減緩體內(nèi)清除率并獲得更合意的藥物動力學(xué)特征。例如該片段可以用聚乙二醇(PEG)或聚氧乙烯化多元醇進(jìn)行修飾。偶聯(lián)和位點(diǎn)特異的綴合PEG到Fab’片段的方法在,例如Leong等，Cytokinel6(3):106-119(2001)和Delgado 等，Br.J.Cancer73 (2):175-182(1996)中進(jìn)行了描述，其公開內(nèi)容在本文通過參考并入本申請。
[0274]在特殊的方面，如圖14所闡明，本發(fā)明提供了含有1-7F9或1-4F1的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)序列的抗體、抗體片段和抗體衍生物。在另一方面，如圖15所闡明或上面所描述，本發(fā)明提供了含有一個或更多1-7F9或1-4F1的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)⑶Rs的抗體、其抗體片段和衍生物。這種序列的功能性變體/類似物可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過制造適當(dāng)?shù)娜〈?、添加?或缺失，在這些公開的氨基酸序列中產(chǎn)生，該標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可輔助以序列比較。從7F9/KIR2DL1復(fù)合體和KIR2DL1/MHC I類復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)的重疊(Fan等，Nat.1mmunol.2001 ；2:452-460)，PDB-代碼1頂9，可以得出結(jié)論1-7F9的scFv衍生物將能阻斷MHC I類結(jié)合KIR2DL1。同樣單獨(dú)的1-7F9的單L-鏈或1-7F9的單VL域，當(dāng)結(jié)合KIR2DL1時，將阻斷MHC I類結(jié)合。
[0275]這種序列的功能性變體/類似物可以通過在這些公開的氨基酸序列中，通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜〈?、添加?或缺失產(chǎn)生，該標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可輔助以比較序列。在另一方面，其中存在于這些抗體之一的序列中的殘基的位置，但不是另一個，可能適于缺失、取代和/或插入。
[0276]備擇地，編碼本發(fā)明抗體，例如1-7F9-或1-4F1樣抗體的DNA，可以進(jìn)行修飾以使編碼本發(fā)明的片段。然后，將修飾的DNA插入表達(dá)載體并用以轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，然后其表達(dá)期望的片段，如在本文別處所描述。
[0277]在備擇的【具體實(shí)施方式】中，產(chǎn)生本發(fā)明的鼠抗體，例如DF200樣抗體的雜交瘤的DNA，可以在插入表達(dá)載體之前進(jìn)行修飾，例如通過用人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源的非人類序列(如通過例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81,PP- 6851(1984)描述)。在另一個【具體實(shí)施方式】中，編碼本發(fā)明抗體的可變區(qū)可以通過重組DNA工程結(jié)合至免疫球蛋白編碼序列對非免疫球蛋白多肽的全部或部分的編碼序列。以那種方式，制備了 "嵌合的"或"雜交"抗體，其具有原始抗體的結(jié)合特異性。典型地，用這種非免疫球蛋白多肽取代本 發(fā)明抗體的恒定區(qū)。
[0278]因而，根據(jù)另一個【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的抗體、優(yōu)選地DF-200樣抗體是人源化的。根據(jù)本發(fā)明，"人源化的"形式的抗體是特異性嵌合的免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)，其包含來源于鼠免疫球蛋白的最小序列。對大部分來說，人源化抗體是人類免疫球蛋白(接受體抗體)，其中來自該接受體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自原始抗體(供體抗體)CDR的殘基取代，同時保持了原始抗體期望的特異性、親和力和能力。在一些例子中，人類免疫球蛋白的Fv框架殘基可以被對應(yīng)的非人類殘基代替。此外，人源化抗體能含有沒有在接受體抗體或在輸入的CDR或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化抗體性能。通常，人源化抗體將實(shí)質(zhì)上含有全部至少一個，并且典型地兩個可變域，其中全部或?qū)嵸|(zhì)上全部的CDR區(qū)對應(yīng)于原始抗體的那些和全部或?qū)嵸|(zhì)上全部的FR區(qū)是人類免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最佳地也將含有至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地為人類免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)。更詳細(xì)的資料見Jones等,Nature, 321,pp.522 (1986) ；Reichmann等，Nature,332,pp.323 (1988);和 Presta,Curr.0p.Struct.Biol.，2, pp.593 (1992)。
[0279]人源化本發(fā)明的抗體的方法為本領(lǐng)域眾所周知。通常地，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體具有從原始抗體引入其中的一個或更多的氨基酸殘基。這些鼠或其它非人類氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其典型地取自“輸入”可變域。人源化可以基本上按Winter和合作者(Jones 等，Nature, 321, pp.522 (1986) ;Riechmann 等，Nature, 332, pp.323 (1988)；Verhoeyen等，Science, 239, pp.1534 (1988))的方法進(jìn)行。因此，這種“人源化”抗體為嵌合抗體(Cabilly等,美國專利N0.4，816，567),其中實(shí)質(zhì)上小于完整的人類可變域已經(jīng)被來自原始鼠抗體的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體典型地為其中一些CDR殘基和可能一些FR殘基被來自原始鼠抗體中類似部位的殘基取代的人類抗體。
[0280]用于制造人源化抗體的人類可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈二者)的選擇對降低抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的〃最適〃方法，針對已知人類可變域序列的全部文庫篩選本發(fā)明抗體的可變域序列。然后采用最接近于小鼠序列的人類序列作為人源化抗體的人類框架(FR) (Sims 等，J.1mmunol., 151, pp.2296(1993) ；Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.，196，PP.901(1987))。另一個方法使用了來自輕鏈或重鏈特殊亞群的全部人類抗體共有序列的特殊框架。相同框架可以用于幾種不同的人源化的抗體(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，89, pp.4285 (1992) ；Presta 等，J.1mmunol.，51, pp.1993))。
[0281]進(jìn)一步重要的是，在保留有對多種抑制性KIR受:體的聞未和力和其他有利的生物學(xué)特性的情況下人源化抗體。為了達(dá)到該目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，人源化抗體是通過使用親本序列和人源化序列的三維模型，分析親本序列和不同的概念性人源化產(chǎn)物的過程進(jìn)行制備的。三維免疫球蛋白模型一般可以得到而且對那些本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟悉的?？梢缘玫接嬎銠C(jī)程序，其闡明并顯示選擇的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。這些顯示的檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，也就是分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原能力的殘基。這樣，F(xiàn)R殘基可以從共同序列和輸入序列中選擇并組合以便獲得期望的抗體特征，例如對靶抗原親和力的增加。通常，CDR殘基直接地而且最實(shí)質(zhì)上參與影響抗原結(jié)合。
[0282]如上所述，制造人類單克隆抗 體的方法是使用XenoMoUSe? (Abgenix,Fremont, CA)，作為用來免疫的小鼠。根據(jù)本發(fā)明，XenoMouse是其免疫球蛋白基因被功能性人類免疫球蛋白基因代替 的鼠宿主。因而，由該小鼠或在由該小鼠的B細(xì)胞制造的雜交瘤中產(chǎn)生的抗體已經(jīng)是人源化的。XenoMouse在美國專利N0.6, 162, 963中進(jìn)行了描述,在本文通過參考將其全部并入本申請。類似的方法可以使用HuMAb-Mouse?(Medarex)完成。
[0283]人類抗體也可以根據(jù)不同的其它技術(shù)產(chǎn)生，例如對于免疫，通過使用其它的轉(zhuǎn)基因動物，其已經(jīng)設(shè)計以表達(dá)人類抗體所有組成成分(Jakobovitz等，Nature362 (1993) 255),或通過使用噬菌體展示方法，選擇抗體全部組成部分。如在本申請中所公開，這種技術(shù)對技術(shù)人員來說是已知的而且可以從單克隆抗體開始來實(shí)現(xiàn)。
[0284]本發(fā)明的抗體，優(yōu)選地1-7F9-或1-4F1樣抗體，也可以衍生為〃嵌合的〃抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與原始抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而這(些)鏈的剩余部分與來源于另外物種或?qū)儆诹硗饪贵w類或亞類的抗體以及這類抗體的片段中相應(yīng)序列相同或同源，只要它們顯示期望的生物學(xué)活性(Cabilly等，supra ;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,81, pp.6851 (1984))。
[0285]本發(fā)明范圍內(nèi)的其它衍生物包括功能化的抗體，也就是與毒素，例如蓖麻毒素、白喉毒素、相思豆毒素和假單胞菌外毒素，或治療性放射性核素，例如，例如9°Y或131I;與可檢測到的部分，例如熒光部分，診斷性放射性同位素或顯影劑；或與固體載體，例如瓊脂糖珠或類似物綴合或共價結(jié)合的抗體。這些其它的藥劑綴合或共價結(jié)合至抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知。[0286]與毒素的綴合對顯示其細(xì)胞表面交叉反應(yīng)性KIR受體之一的NK細(xì)胞的靶向殺傷是有用的。一旦本發(fā)明的抗體結(jié)合這種細(xì)胞的細(xì)胞表面，其被內(nèi)在化而且毒素在細(xì)胞內(nèi)釋放，選擇性地殺傷所述細(xì)胞。這種使用是本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。
[0287]當(dāng)本發(fā)明的抗體用于診斷目的時，與可檢測到的部分綴合是有用的。這種目的包括，但不限于分析生物樣品中其細(xì)胞表面上具有交叉性反應(yīng)KIR的NK細(xì)胞存在，和檢測在活的生物中具有交叉性反應(yīng)KIR的NK細(xì)胞存在。這種分析和檢測方法也是本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。
[0288]本發(fā)明的抗體綴合到固體載體，作為在其細(xì)胞表面上具有交叉反應(yīng)性KIR的NK細(xì)胞的親和純化工具是有用的，NK細(xì)胞來自來源，例如生物學(xué)流體。該純化方法是本發(fā)明的另一個備擇【具體實(shí)施方式】，得到的純化的NK細(xì)胞群體也是本發(fā)明的另一個備擇【具體實(shí)施方式】。
[0289]藥物組合物和應(yīng)用
[0290]本發(fā)明也提供了含有人類或人源化抗體，或其片段和衍生物的藥物組合物，其中所述抗體、片段或衍生物在患者中或在含有NK細(xì)胞的生物樣品中，在任何適當(dāng)?shù)拿浇橹幸杂行Э蓹z測地加強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的量，與NK細(xì)胞表面的至少兩種抑制性KIR受體交叉反應(yīng)，降低或中和它們的抑制性信號并加強(qiáng)那些細(xì)胞的活性。用于根據(jù)本發(fā)明的用途，含有人類或人源化的抗KIR mAb,任選地和另一種活性劑的藥物組合物，按照常規(guī)技術(shù)例如在 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro 編，MackPublishing C0., Easton, PA, 1995中公開的那些,可以與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑以及任意其它已知佐劑和賦形劑配制。組合物可以以常規(guī)形式，例如膠囊劑、片劑、氣霧劑、溶液或懸液、或以凍干粉末出現(xiàn)。
[0291]因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供含有人類或人源化抗體，或其片段或衍生物的藥物制劑，其存在濃度從lmg/ml到500mg/ml，并且其中所述制劑pH從2.0到10.0。該制劑可以進(jìn)一步含有緩沖液系統(tǒng)、防腐劑(類)、張力劑(類)、螯合劑(類)、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個【具體實(shí)施方式】中，藥物制劑是含水制劑，也就是含有水的制劑。這種制劑典型地是溶液或懸液。在本發(fā)明進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，藥物制劑為水溶液。如在本文所使用，術(shù)語“含水劑型”為含有至少50%w/w水的制劑。同樣地，術(shù)語“水溶液”為含有至少50%w/w水的溶液，并且術(shù)語“含水懸液”為含有至少50%w/w水的懸液。
[0292]在另一個【具體實(shí)施方式】中，藥物制劑為冷凍干燥的制劑，在使用之前，醫(yī)生或患者向其中加入溶劑和/或稀釋劑。
[0293]在另一個【具體實(shí)施方式】中，藥物制劑為即時可用而不需要任何預(yù)先溶解的干燥制劑(例如冷凍干燥或噴霧干燥)。
[0294]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及含有如在本文所述抗體水溶液和緩沖液的藥物制劑，其中所述抗體以lmg/ml或更高濃度存在，并且其中所述制劑pH從大約2.0到大約10.0。
[0295]在另一個【具體實(shí)施方式】中，該制劑的pH選自由2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6、
2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、
4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、
6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、
8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9 和 10.0 組成的列表。
[0296]在進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，緩沖劑選自由醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、雙甘氨肽、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸、蘋果酸、琥珀酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物組成的組。這些具體緩沖劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。
[0297]在進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，制劑也含有藥學(xué)上可接受的防腐劑。在另一個【具體實(shí)施方式】中，防腐劑選自由苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、甲基對-羥基苯甲酸酯、丙基對-羥基苯甲酸酯、2_苯氧乙醇、丁基對-羥基苯甲酸酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和硫柳汞、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定、脫氫醋酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、苯索氯銨、氯苯甘醚(3對氯苯氧基丙-1，2-二醇)或其混合物組成的組。在一個【具體實(shí)施方式】中，防腐劑以濃度從0.lmg/ml到20mg/ml存在。在另一個【具體實(shí)施方式】中，防腐劑以濃度從0.lmg/ml到5mg/ml存在。在還有另一個【具體實(shí)施方式】中，防腐劑以濃度從5mg/ml到10mg/ml存在。在另一個【具體實(shí)施方式】，防腐劑以濃度從10mg/ml到20mg/ml存在。所列出的具體防腐劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。盡管防腐劑在藥物組合物中的用途對技術(shù)人員是眾所周知的；但為了便利，參考Remington:The Science andPractice of Pharmacy,% 19 版，1995。
[0298]在進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，制劑也含有等滲劑。在一個【具體實(shí)施方式】中，等滲劑選自由鹽(例如氯化鈉)、糖、糖醇、氨基糖、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、糖醇(例如甘油(甘油)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3_丙二醇、1，3_ 丁二醇)和聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物組成的群。可以使用任何適當(dāng)?shù)奶?，包括但不限于單_，雙-或多糖和水溶性葡聚糖，例如例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖 、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素鈉。在一個【具體實(shí)施方式】中，糖添加劑是蔗糖。糖醇定義為有至少一個羥基基團(tuán)的C4-C8碳?xì)浠衔锒野?，例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿糖醇。在一個【具體實(shí)施方式】中，糖醇添加劑為甘露醇。上面提到的糖或糖醇可以單獨(dú)或結(jié)合使用。對使用的數(shù)量沒有固定的限制，只要糖或糖醇在液體制劑中是可溶的而且不會不利地影響使用本發(fā)明的方法獲得的穩(wěn)定效應(yīng)。在一個【具體實(shí)施方式】中，糖或糖醇濃度在大約lmg/ml和大約150mg/ml之間。在另一個【具體實(shí)施方式】中，等滲劑以濃度從lmg/ml到50mg/ml存在。在另一個【具體實(shí)施方式】中，等滲劑以濃度從lmg/ml到7mg/ml存在。在另一個【具體實(shí)施方式】中，等滲劑以濃度從8mg/ml到24mg/ml存在。在另一個【具體實(shí)施方式】中，等滲劑以濃度從25mg/ml到50mg/ml存在。上面列出的每一特定等滲劑構(gòu)成本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。盡管藥物組合物中等滲劑的使用對技術(shù)人員是眾所周知的；但為了便利，參考 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19版，1995。
[0299]在進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，制劑也含有螯合劑。在一個【具體實(shí)施方式】中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)，檸檬酸，和天冬氨酸，及其混合物的鹽類。在另一個【具體實(shí)施方式】中，螯合劑以濃度從0.lmg/ml到5mg/ml存在。在另一個【具體實(shí)施方式】中，螯合劑以濃度從0.lmg/ml到2mg/ml存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，螯合劑以濃度從2mg/ml到5mg/ml存在。這些特定螯合劑的每一個構(gòu)成本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。藥物組合物中螯合劑的用途對技術(shù)人員是眾所周知的。為了方便，參考Remington:The Science andPractice of Pharmacy,% 19 版，1995。
[0300]在進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，制劑也含有穩(wěn)定劑。盡管藥物組合物中穩(wěn)定劑的用途對技術(shù)人員是眾所周知的；但為了方便，參考Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第 19 版，1995。
[0301]本發(fā)明的組合物可以，例如為穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療性活性組分包括可能在液體藥物制劑中在儲存期間顯示聚集體形成的多肽。"聚集形成"意思是在引起寡聚體形成的多肽分子之間物理相互作用，其可以保留可溶性，或從溶液中沉淀的大的可見聚集體。"在儲存期間"意思是一旦制備液體藥物組合物或制劑，不立即給受試者施用。反而，在制備后，將其包裝或以液體形式，以冷凍態(tài)或以干燥形式儲存，用于后來重建為液體形式或適于給受試者施用的其它形式。"干燥形式"意思是液體藥物組合物或制劑通過冷凍干燥(也就是凍干；見,例如Williams和Polli (1984) J.Parenteral Sc1.Technol.38:48-59),噴霧干燥(見 Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed ；Longman Scientific 和 Technical, Essez, U.K.), pp.491-676 ；Broadhead 等(1992)DrugDevel.1nd.Pharm.18:1169-1206 ；和 Mumenthaler 等(1994)Pharm.Res.11:12-20)，或風(fēng)干(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryobiology25:459-470 ；和 Roser (1991) Biopharm.4:47-53)進(jìn)行干燥。在液體藥物組合物儲存期間多肽的聚集形成能不利地影響導(dǎo)致藥物組合物治療性功能喪失的多肽的生物學(xué)活性。此外，當(dāng)使用輸注系統(tǒng)施用包含多肽的藥物組合物時，聚集形成可以引起其它的問題例如阻塞管、膜或泵。
[0302]本發(fā)明的藥物組合物也可以含有足夠減少在組合物儲存期間多肽引起的聚集形成的量的氨基酸堿。"氨基酸堿"意思是氨基酸或氨基酸組合，其中任意所給的氨基酸以其游離堿形式或以其鹽形式存 在。當(dāng)使用氨基酸的組合時，全部的氨基酸可以它們的游離堿形式存在，全部可以它們的鹽形式，或一些可以它們游離堿形式而其它以它們的鹽形式存在。在一個【具體實(shí)施方式】中，在制備本發(fā)明組合物中使用的氨基酸是帶有電荷側(cè)鏈的那些，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如蛋氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸和其混合物)的任何立體異構(gòu)體(也就是L、D或其混合物)或這些立體異構(gòu)體的組合，可以在本發(fā)明的藥物組合物中存在，只要該特定氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。在一個【具體實(shí)施方式】中，使用了 L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明的組合物也可以與這些氨基酸的類似物配制。"氨基酸類似物"意思是引起降低在本發(fā)明的液體藥物組合物儲存期間由多肽引起的聚集形成期望效果的自然存在的氨基酸衍生物。適當(dāng)?shù)木彼犷愃莆锇?，例如氨基胍，鳥氨酸和N- —乙基L-精氨酸，適當(dāng)?shù)牡鞍彼犷愃莆锇ㄒ伊虬彼岷蚥uthionine而且適當(dāng)?shù)陌腚装彼犷愃莆锇⊿-甲基-L半胱氨酸。當(dāng)用其它的氨基酸時，將氨基酸類似物以它們的游離堿形式或鹽形式合并入組合物中。在本發(fā)明進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，氨基酸或氨基酸類似物以足夠預(yù)防或延遲蛋白質(zhì)聚集的濃度使用。
[0303]在進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)用作治療藥的多肽是含有至少一個對這種氧化敏感的蛋氨酸殘基的多肽時，可以添加蛋氨酸(或其它含硫的氨基酸或氨基酸類似物)以抑制蛋氨酸殘基氧化為蛋氨酸亞砜。"抑制"意思是隨時間蛋氨酸氧化的種類的最小的積聚。抑制蛋氨酸氧化導(dǎo)致多肽以其適當(dāng)?shù)姆肿有问礁蟮谋Ａ??？梢允褂玫鞍彼?L或D)的任何立體異構(gòu)體或其組合。要添加的量應(yīng)為足夠抑制蛋氨酸殘基氧化的量，這樣蛋氨酸亞砜的量對管理機(jī)構(gòu)來說是可以接受的。典型地，這意味著組合物包含不大于大約10%到大約30%的蛋氨酸亞砜。通常地，這可以通過添加蛋氨酸(這樣添加的蛋氨酸與蛋氨酸殘基的比率范圍從大約I:1到大約1000:1，例如10:1到大約100:1)來獲得。
[0304]在進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，制劑也含有選自高分子量聚合物或低分子化合物組的穩(wěn)定劑。在一個【具體實(shí)施方式】中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL, HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)如一硫代甘油、巰基乙酸和2-甲硫基乙醇，和不同的鹽類(例如氯化鈉)。這些特定穩(wěn)定劑的每一個構(gòu)成本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。
[0305]藥物組合物也可以含有進(jìn)一步增強(qiáng)其中治療活性多肽的穩(wěn)定性的附加的穩(wěn)定劑。為本發(fā)明所特有興趣的穩(wěn)定劑包括，但不限于，保護(hù)多肽免于蛋氨酸氧化的蛋氨酸和EDTA，和保護(hù)多肽免于與凍融或機(jī)械剪切有關(guān)的聚集的非離子表面活性劑。
[0306]在進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，制劑也含有表面活性劑。在一個【具體實(shí)施方式】中，表面活性劑選自去污劑、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙酰單酸甘油乙酯、脂肪酸脫水山梨醇酯、聚氧化丙稀-聚氧化乙烯嵌段共聚物(例如泊咯沙姆例如Pluronic? F68、泊咯沙姆188和407、TritonX-100)、聚氧化乙烯脂肪酸脫水山梨醇酯、聚氧化乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80和Bri j-35)、單酸甘油酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧化乙烯衍生物、醇類、甘油、凝集素類和磷脂類(例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、雙磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂類衍生物(例如棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂類(例如乙醇胺的棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和1-?；?sn-丙三醇-3-磷酸酯、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸)和溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿類的 烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿的月桂酰和肉豆蘧酰衍生物和極性頭基團(tuán)的修飾形式，其為膽堿類、乙醇胺類、磷脂酸、絲氨酸類、蘇氨酸類、甘油、肌醇和正電荷的DODAC、D0TMA、DCP、BISH0P、溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸和丙三醇磷脂類(例如腦磷脂類)、甘油糖脂類(例如吡喃半乳糖苷)、神經(jīng)鞘糖脂類(例如神經(jīng)酰胺類、神經(jīng)節(jié)苷脂類)、十二烷基磷酸膽堿、雞蛋溶血卵磷脂、梭鏈孢酸衍生物(例如?；嵌渌箧滄咚徕c等)、C6-C12的長鏈脂肪酸和其鹽類(例如油酸和辛酸)、?；鈮A類和衍生物、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的N°-酰化衍生物、或賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈酰化衍生物、含有賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸任何組合的二肽類的N°-?；苌?、含有中性氨基酸和兩個帶電氨基酸任何組合的三肽的N°-?；苌?、DSS(琥珀辛酯鈉、CAS登記號[577-11-7])、琥珀辛酯鈣、CAS登記號[128-49-4])、琥珀辛酯鉀、CAS登記號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或十二烷基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸類和其鹽類與甘氨酸或牛磺酸綴合物、烏素脫氧膽酸、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘膽酸鈉、N-十六烷基-N，N- 二甲基-3-氨溶-1-丙磺酸鹽、陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽)單價表面活性劑、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N，N- 二甲氨溶-1-丙磺酸鹽類、3-膽酰氨基-1-丙基二甲氨溶-1-丙磺酸鹽、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如十六烷基-三甲溴化銨、十六烷基氯化吡啶銀)、非離子表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)、乙二胺衍生物類(poloxamines)(例如Tetronic’ s)、其為來源于連續(xù)添加環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙燒到乙二胺的四功能嵌段共聚物，或表面活性劑可以選自咪唑啉衍生物或其混合物的組。這些特定表面活性劑的每一個構(gòu)成本發(fā)明備擇的【具體實(shí)施方式】。
[0307]雖然藥物組合物中表面活性劑的用途對技術(shù)人員是眾所周知的；但是為了方便，參考 Remington:The Science 和 Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。
[0308]在進(jìn)一步【具體實(shí)施方式】中，雖然也可以使用其它的商業(yè)上可獲得和適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?，該制劑也含有蛋白酶抑制劑例如EDTA(乙二胺四乙酸)和芐脒HC1。為了抑制自催化，蛋白酶抑制劑的用途在含有蛋白酶的酶原的藥物組合物中特別有用。
[0309]其它的成分也可以在本發(fā)明的藥物制劑中存在。這種附加成分可以包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力改進(jìn)劑、螯合劑、金屬離子、含油賦形劑、蛋白質(zhì)(例如人類血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))和兩性離子(例如氨基酸例如甜菜堿、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。這種附加成分優(yōu)選地不會不利地影響本發(fā)明藥物制劑的總穩(wěn)定度。
[0310]包含根據(jù)本發(fā)明抗體的藥物組合物可以給需要這種治療的患者，在幾個部位施用，例如在局部部位，例如皮膚和粘膜部位，在繞過吸收的部位，例如在動脈、在靜脈、在心臟中施用和在包括吸收的部位，例如在皮膚中、在皮下、在肌肉中和腹部中施用。
[0311]根據(jù)本發(fā)明藥物組合物的施用可以通過幾個途徑給需要這種治療的患者施用，例如舌、舌下、頰、口中、口服、胃和腸中、鼻、肺，例如通過細(xì)支氣管和肺泡或其組合、表皮、真皮、透皮、陰道、直腸、眼睛、例如通過結(jié)膜、輸尿管和胃腸外。
[0312]本發(fā)明的組合物可以多種劑量形式施用，例如溶液、懸液、乳劑、微乳劑、多重乳劑、泡沫、油膏劑、膏劑、硬膏劑、軟膏劑、片劑、包衣片劑、清洗劑、膠囊劑、例如硬明膠膠囊和軟明膠膠囊、栓劑、直腸用膠囊、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣霧劑、吸人劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼用清洗劑、陰道栓 劑、陰道環(huán)、陰道軟膏劑、注射液、原地轉(zhuǎn)化溶液、例如原地膠凝、原地凝固(Se11 ing )、原地沉淀、原地結(jié)晶化、輸注液和植入物。
[0313]為了進(jìn)一步增強(qiáng)抗體穩(wěn)定性，提高生物利用度，提高溶解度，減少不良作用，達(dá)到對本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的擇時治療，和提高患者順應(yīng)性或其任何組合，本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步例如通過共價，疏水和靜電相互作用，混合在或連接到藥物載體，藥物傳遞系統(tǒng)和高級藥物傳遞系統(tǒng)。載體，藥物傳遞系統(tǒng)和高級藥物傳遞系統(tǒng)的例子包括，但不限于聚合體，例如纖維素和衍生物、多糖，例如右旋糖苷和衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚羥基乙酸和其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白質(zhì)，例如白蛋白、凝膠，例如熱膠凝(thermogelling)系統(tǒng),例如對那些本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的嵌段共聚物系統(tǒng)、膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米顆粒、液晶和其分散體、L2相和其分散體，其對那些脂質(zhì)-水系統(tǒng)中相行為領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，聚合膠束、多重乳劑、自乳化、自微乳化、環(huán)糊精和其衍生物和樹狀聚合物(dendrimers)。
[0314]本發(fā)明的組合物在固體、半固體、粉劑和溶液制劑中是有用的，用于使用例如定量吸入器、干粉吸入器和霧化器(所有的裝置對那些本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的)肺給予抗體。
[0315]本發(fā)明的組合物在控制的、持續(xù)的、延長的、延遲和緩慢釋放藥物傳遞系統(tǒng)的制劑中特別有用。更特別地，但不限于，組合物在本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的胃腸外控制釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)(兩系統(tǒng)導(dǎo)致施用次數(shù)的多倍減少)制劑中是有用的。甚至更優(yōu)選地，是皮下施用的控制釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)。不限制本發(fā)明的范圍，有用的控制釋放系統(tǒng)和組合物的例子是水凝膠、油質(zhì)凝膠、液晶、聚合膠束、微球體、納米粒子。
[0316]產(chǎn)生對本發(fā)明的組合物有用的控制釋放系統(tǒng)的方法包括，但不限于，結(jié)晶、濃縮、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻化、包囊、噴霧干燥、微囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以產(chǎn)生微球體、擠壓和超臨界流體過程。通常參考Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise, D.L.編，Marcel Dekker, New York,2000)和 Drug and thePharmaceutical Sciences vol.99:Protein Formulation and Delivery(MacNally,E.J.編，Marcel Dekker，New York, 2000)。
[0317]胃腸外施用可以使用注射器，任選地筆樣注射器通過皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行。備擇地，胃腸外施用可以使用輸注泵進(jìn)行。進(jìn)一步選擇是可以是用于以鼻或肺噴霧形式施用抗體溶液或懸液的組合物。作為另外的選擇，包含本發(fā)明抗體的藥物組合物也可以適合于經(jīng)皮施用，例如通過無針注射或來自貼片，任選地離子電滲貼片，或經(jīng)粘膜，例如頰施用。
[0318]抗體可以通過肺途徑，使用適于肺部藥物輸送的任意已知類型的裝置，在介質(zhì)中以溶液、懸液或干粉形式進(jìn)行施用。
[0319]這些的例子含有，但不限于，用于肺部藥物輸送的產(chǎn)生氣霧劑的三個通常類型，并且可以包括噴射器或超聲波霧化器，定量吸入器，或干粉吸入器(Cf.Yu J，ChienYff.Pulmonary drug delivery:Physiologic and mechanistic aspects.Crit Rev TherDrug Carr Sysl4(4)(1997)395-453)。
[0320]基于標(biāo)準(zhǔn)化的測試方法學(xué)，將粒子的空氣動力直徑(da)定義為單位密度的參考標(biāo)準(zhǔn)球形粒子的幾何等價直徑(lg/cm3)。在最簡單的情況，對于球形粒子，da與參考直徑(d)相關(guān)，參考直徑為密度比率 的平方根的函數(shù)，如下式所描述:
[0321]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的人類抗體，其與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一個結(jié)合，但是不結(jié)合 KIR2DS4。
2.權(quán)利要求1的分離的人類抗體，其進(jìn)一步不與KIR2DS3結(jié)合。
3.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體阻斷KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一個與I類HLA-C分子結(jié)合。
4.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體阻斷HLA-Cw4分子與KIR2DL1的結(jié)合，以及HLA-Cw3分子與KIR2DL2或KIR2DL3中的至少一個結(jié)合。
5.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體加強(qiáng)NK細(xì)胞對表達(dá)I類HLA-C分子的人類靶細(xì)胞的裂解活性。
6.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體在與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的至少一個結(jié)合中，與含有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體競爭。
7.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體在與KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一個結(jié)合中，與含有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體競爭。
8.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體含有包含SEQID N0:15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
9.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體包含: (a)對應(yīng)于SEQID NO:17的殘基31-35的重鏈CDRl氨基酸序列； (b)對應(yīng)于SEQID NO:17的殘基50-65的重鏈CDR2氨基酸序列；和 (c)對應(yīng)于SEQID NO:17的殘基99-112的重鏈CDR3氨基酸序列。
10.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體含有包含SEQID NO:17的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
11.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體對KIR2DL1的解離常數(shù)(Kd)不大于大約0.45nM。
12.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體對KIR2DL3的Kd不大于大約0.025nM.
13.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體與實(shí)質(zhì)上含有氨基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、152、F64、D72、Y80、P87 和 Y88 的 KIR2DL1 表位結(jié)合。
14.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體阻斷HLA-Cw4分子與KIR2DL1的胞外部分(SEQ ID NO:23)的殘基M44、F45和D72的結(jié)合。
15.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體為單克隆抗體。
16.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
17.前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的分離的人類抗體，該抗體為IgG4抗體。
18.編碼前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的人類抗體的核酸。
19.含有權(quán)利要求18的核酸的載體。
20.含有權(quán)利要求19的載體的細(xì)胞。
21.—種產(chǎn)生人類抗KIR抗體的方法，它包括在適于表達(dá)抗KIR抗體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求20的細(xì)胞。
22.—種藥物組合物，它含有可檢測地加強(qiáng)患者中NK細(xì)胞細(xì)胞毒性有效量的權(quán)利要求1-17任意一項(xiàng)的人類抗體，或通過權(quán)利要求21的方法產(chǎn)生的人類抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，它含有吐溫80、蔗糖，或吐溫80和蔗糖二者。
24.一種加強(qiáng)有其需要的受試者中NK細(xì)胞活性的方法，該方法包括給予該受試者有效量的權(quán)利要求22到23任意一項(xiàng)的組合物。
25.權(quán)利要求24的方法，其中受試者為患有癌癥的患者。
26.權(quán)利要求25的方法，其中患者患有選自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤的癌癥。
27.權(quán)利要求25的方法，其中患者患有選自結(jié)腸直腸癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和惡性黑色素瘤的癌癥。
28.權(quán)利要求24的方法，其中受試者為患有感染性疾病的患者。
29.權(quán)利要求24到28任意一項(xiàng)的方法，它還包括給予選自免疫調(diào)節(jié)劑、激素藥劑、化學(xué)治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、結(jié)合抑制性KIR的第二抗體、抗感染劑、導(dǎo)向劑和輔助化合物的治療劑。
【文檔編號】C12N15/13GK103509111SQ201310415588
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2004年7月1日
【發(fā)明者】A·莫雷塔, M·德拉齊薩, P·安德烈, L·戈捷, F·羅馬格涅, P·A·N·R·瓦格特曼, I·斯文德森, S·扎恩, A·斯溫森, M·斯奧夫森, S·貝格佩德凱爾, K·謝爾高, P·施佩, W·邁克爾 申請人:諾和諾德公司, 伊納特醫(yī)藥公司, 熱納亞大學(xué)