一種抑制多功能蛋白聚糖1表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制多功能蛋白聚糖1（Versican1，V1）表達(dá)的siRNA，所述siRNA序列如下：正義鏈：5′-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3′，反義鏈：5′-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3′。本發(fā)明提供的抑制多功能蛋白聚糖1表達(dá)的siRNA，能夠特異性抑制和下調(diào)多功能蛋白聚糖1的表達(dá)，有效促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白的沉積，并且具有長(zhǎng)期作用的特點(diǎn)，符合COPD的疾病特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種抑制多功能蛋白聚糖1表達(dá)的SiRNA及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種siRNA，尤其涉及一種抑制多功能蛋白聚糖I表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]慢性阻塞性肺疾病(ChronicObstructive Pulmonary Disease, C0PD)是一種常見(jiàn)、多發(fā)、高致殘性和高致死性的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。COPD患者典型的肺實(shí)質(zhì)破壞表現(xiàn)為小葉中央型肺氣腫，其導(dǎo)致的氣流阻塞是器質(zhì)性和永久性的改變，現(xiàn)有治療方法并不能有效預(yù)防及逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的肺組織破壞和肺功能損害。作為維持組織彈性和呼吸周期中肺泡正常開(kāi)放和回縮的主要成分，彈性蛋白破壞是肺氣腫的主要原因。CN102499925A公開(kāi)了一種中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，其活性成分為具有五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)的化合物，通過(guò)抑制彈性蛋白酶來(lái)減少?gòu)椥缘鞍椎慕到?，從而緩解肺氣腫等疾病。CN1201730A公開(kāi)了用RAR選擇性視黃醛衍生物激動(dòng)劑治療肺氣腫，通過(guò)促進(jìn)彈性蛋白原基因表達(dá)，來(lái)達(dá)到治療肺氣腫的目的。但是目前還沒(méi)有有效促進(jìn)肺組織彈性蛋白生成并有序沉積的有效方法。
[0003]多功能蛋白聚糖I (Versicanl, VI)是一種富含硫酸軟骨素(chondroitinsulfate, CS)的蛋白多糖,可通過(guò)形成局部高CS濃度而促進(jìn)彈性蛋白原脫落來(lái)抑制彈性蛋白生成。在皮膚以及動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)Vl高表達(dá)可抑制彈性蛋白形成。但是肺組織結(jié)構(gòu)特殊，不同于皮膚及動(dòng)脈；而且COPD是一個(gè)慢性疾病，吸煙及空氣污染是其重要的危險(xiǎn)因素，目前缺乏特異性抑制Vl達(dá)到修復(fù)煙草所致的彈性蛋白受損的方法。
[0004]近年來(lái),利用RNA干擾技術(shù),將化學(xué)合成的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)導(dǎo)至特定的細(xì)胞，沉默相關(guān)基因的表達(dá)，是研究基因功能最有效的手段之一，使用RNAi治療疾病的思路是根據(jù)病原體的致病基因序列以及生物體內(nèi)與疾病發(fā)生相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)和制備與這些基因序列具有同源性的小干擾RNA (siRNA)，然后通過(guò)某種方式將siRNA轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)使有關(guān)疾病基因發(fā)生沉默，從而達(dá)到治療的目的。其優(yōu)勢(shì)在于只抑制疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)，而不損傷正常細(xì)胞功能，其序列特異性及基因抑制作用的強(qiáng)大性是其他藥物難以匹敵的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種特異性抑制Vl表達(dá)的siRNA，本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種抑制多功能蛋白聚糖I (Versicanl, VI)表達(dá)的siRNA,所述siRNA序列如下:
[0007]正義鏈:5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3'，
[0008]反義鏈:5'-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種低表達(dá)多功能蛋白聚糖I的肺成纖維細(xì)胞，所述肺成纖維細(xì)胞攜帶有權(quán)利要求1所述的siRNA。[0010]本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種構(gòu)建上述低表達(dá)多功能蛋白聚糖I的肺成纖維細(xì)胞的方法，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將權(quán)利要求1所述的SiRNA轉(zhuǎn)染至肺成纖維細(xì)胞中，即得。
[0011]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法中使用的脂質(zhì)體為脂質(zhì)體TM2000。
[0012]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肺成纖維細(xì)胞為經(jīng)受煙草刺激的肺成纖維細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供上述抑制Vl的siRNA在在制備促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白修復(fù)的藥物或材料中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供上述抑制Vl表達(dá)的siRNA在制備治療肺氣腫藥物或材料中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明提供的抑制多功能蛋白聚糖I表達(dá)的siRNA，能夠特異性抑制和下調(diào)多功能蛋白聚糖I的表達(dá)，有效促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白的沉積，并且具有長(zhǎng)期作用的特點(diǎn)，符合COPD的疾病特點(diǎn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明提供的siRNA轉(zhuǎn)染肺成纖維細(xì)胞后Vl表達(dá)結(jié)果圖，圖A為VlmRNA相對(duì)表達(dá)水平圖，圖B為Vl和彈性蛋白檢測(cè)結(jié)果圖；
[0017]圖2為檢測(cè)本發(fā)明提供的siRNA對(duì)煙草所致的肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白喪失的影響的流程圖，圖A為彈性蛋白mRNA檢測(cè)結(jié)果圖，圖B為上清液中可溶性彈性蛋白含量檢測(cè)結(jié)果圖，圖C為彈性蛋白沉積量檢測(cè)結(jié)果圖，*ρ〈0.01，#p<0.001 ；
[0018]圖3為煙草對(duì)CCL-210人肺成纖維細(xì)胞系合成彈性蛋白原以及彈性蛋白沉積的影響結(jié)果圖；
[0019]圖4為本發(fā)明提供的siRNA對(duì)煙草所致的CCL-210人肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白沉積的影響結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，以更好地理解本發(fā)明。
[0021]一、本發(fā)明提供的抑制多功能蛋白聚糖I表達(dá)的SiRNA對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞中多功能蛋白聚糖I的表達(dá)和彈性蛋白沉積的影響
[0022]1、多功能蛋白聚糖I (Versicanl, VI) siRNA革巴位點(diǎn)序列及其轉(zhuǎn)染。
[0023]設(shè)計(jì)并合成VlsiRNA靶位點(diǎn)序列為:
[0024]正義鏈:5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3'，
[0025]反義鏈:5'-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
[0026]采用脂質(zhì)體Lipofectamin TM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染步驟如下:
[0027](I)使用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基將正常肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中，37°C，5%C02，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0028](2)當(dāng)細(xì)胞鋪滿90-95%的孔底面積是，先吸去培養(yǎng)基，然后用無(wú)菌的PBS洗一次，然后加入5ml無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0029](3)脂質(zhì)體Lipofectamin TM2000使用之前先輕輕搖勻。按每孔I μ I脂質(zhì)體對(duì)50μ I培養(yǎng)基的比例，計(jì)算好用量后將脂質(zhì)體加入到不含血清與抗生素的F-12K培養(yǎng)基中，輕搖混勻后室溫靜置5min。
[0030](4)按每孔20pmol對(duì)50 μ I培養(yǎng)基的比例，計(jì)算好用量后將siRNA加入到不含血清和抗生素的F-12K培養(yǎng)基中，輕搖混勻后室溫靜置5min。
[0031](5) siRNA溶液與脂質(zhì)體混和均勻，室溫靜置20min。
[0032](6)24孔培養(yǎng)板上的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS (pH=7.4)洗滌細(xì)胞1_2次。每孔細(xì)胞加100 μ I SiRNA/脂質(zhì)體混合物，輕輕搖晃混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C、5%C02條件下培養(yǎng)4-6h。
[0033](7)取出培養(yǎng)板，小心吸去DNA/脂質(zhì)體混合物，每孔加500 μ I新鮮的含10%血清F-12K培養(yǎng)基，37°C、5%C02繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞加入裂解液，測(cè)定Vl的RNA和彈性蛋白含量，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的siRNA能有效特異性抑制肺成纖維細(xì)胞內(nèi)源性Vl的合成分泌。
[0034]二、本發(fā)明提供的抑制多功能蛋白聚糖I表達(dá)的siRNA對(duì)煙草所致的肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白喪失的影響
[0035]如圖2所示，設(shè)計(jì)針對(duì)Vl的祀位點(diǎn)siRNA序列，用脂質(zhì)體Lipofectamin TM2000法轉(zhuǎn)染CCL-210人肺成纖維細(xì)胞系。在以煙草刺激復(fù)制而成的COPD彈性蛋白減少體外模型中應(yīng)用本發(fā)明涉及的VlsiRNA加以干預(yù)并觀察效果。
[0036]1、香煙提取物的制備及體外COPD模型的復(fù)制:
[0037]將I 支科研用香煙2R1的燃燒煙霧溶于5ml不含血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整pH值至pH7.4，0.22 um濾菌器除菌，工作濃度為1%和10%。檢測(cè)經(jīng)受煙草刺激的肺成纖維細(xì)胞中彈性蛋白原及彈性蛋白沉積情況，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，煙草能夠抑制彈性蛋白原mRNA表達(dá)，刺激14天時(shí)彈性蛋白原(即可溶性彈性蛋白)和彈性蛋白沉積(即彈性蛋白原單體組裝成不可溶性彈性蛋白)均顯著下降。
[0038]2、設(shè)計(jì)并合成VI靶位點(diǎn)的s i RNA序列為:
[0039]正義鏈:5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3'，
[0040]反義鏈:5'-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
[0041]3、siRNA 的轉(zhuǎn)染:
[0042](I)使用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中，37°C，5%C02,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);
[0043](2)當(dāng)細(xì)胞鋪滿90-95%的孔底面積。先吸去培養(yǎng)基，然后用無(wú)菌的PBS洗一次，然后加入5ml無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0044](3)脂質(zhì)體Lipofectamin TM2000使用之前先輕輕搖勻。按每孔I μ I脂質(zhì)體對(duì)50μ I培養(yǎng)基的比例，計(jì)算好用量后將脂質(zhì)體加入到不含血清與抗生素的F-12K培養(yǎng)基中，輕搖混勻后室溫靜置5min。
[0045](4)按每孔20pmol對(duì)50 μ I培養(yǎng)基的比例，計(jì)算好用量后將siRNA加入到不含血清和抗生素的F-12K培養(yǎng)基中，輕搖混勻后室溫靜置5min。
[0046](5) siRNA溶液與脂質(zhì)體混和均勻，室溫靜置20min。
[0047](6)24孔培養(yǎng)板上的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS (pH=7.4)洗滌細(xì)胞1_2次。每孔細(xì)胞加100 μ I SiRNA/脂質(zhì)體混合物，輕輕搖晃混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37°C、5%C02條件下培養(yǎng)4-6h。[0048](7)取出培養(yǎng)板，小心吸去DNA/脂質(zhì)體混合物，每孔加500 μ I新鮮的含10%血清F-12K培養(yǎng)基，37°C、5%C02繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞加入裂解液。
[0049]檢測(cè)彈性蛋白原mRNA表達(dá)、彈性蛋白原(soluble elastin)和彈性蛋白(insoluble elastin)的濃度,結(jié)果如圖4所示:本發(fā)明提供的siRNA能夠顯著改善香煙刺激導(dǎo)致的彈性蛋白沉積減少(圖4B)，但并不改善彈性蛋白原的合成和分泌(圖4A)。這說(shuō)明Vl在煙草所致的彈性蛋白喪失中是從抑制分泌后加工起作用的，應(yīng)用Vl靶位點(diǎn)siRNA序列特異性抑制其表達(dá)能夠促進(jìn)彈性蛋白沉積，并且這種效應(yīng)只有作用一定時(shí)間后才顯現(xiàn)，而非短期效應(yīng)。
[0050]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制多功能蛋白聚糖I表達(dá)的SiRNA,其特征在于,所述SiRNA序列如下: 正義鏈:5, -GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3,， 反義鏈:5' -UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3'。
2.—種低表達(dá)多功能蛋白聚糖I的肺成纖維細(xì)胞，其特征在于，所述肺成纖維細(xì)胞攜帶有權(quán)利要求1所述的siRNA。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求2所述的肺成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將權(quán)利要求1所述的siRNA轉(zhuǎn)染至肺成纖維細(xì)胞中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法中使用的脂質(zhì)體為脂質(zhì)體 TM2000。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述肺成纖維細(xì)胞為經(jīng)受煙草刺激的肺成纖維細(xì)胞。
6.一種權(quán)利要求1所述的siRNA在制備促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白修復(fù)的藥物或材料中的應(yīng)用。
7.—種權(quán)利要求1 所述的siRNA在制備治療肺氣腫藥物或材料中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103468681SQ201310415689
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】瞿介明, 張靜, 吳棟, 陸運(yùn)濤 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院