一種基于彈回探針引物技術(shù)的低頻突變檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種基于彈回探針引物技術(shù)的低頻突變檢測方法。本發(fā)明包括：設(shè)計(jì)彈回探針引物、制備DNA模板、配置檢測體系、設(shè)置反應(yīng)程序和確定Ts值、結(jié)果的判定等步驟。本發(fā)明是將彈回探針引物富集擴(kuò)增技術(shù)與彈回探針引物高分辨率溶解曲線相結(jié)合的低頻突變檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了萬分之一甚至更高的檢測靈敏度，并滿足了臨床上對突變檢測技術(shù)不易污染，靈敏性高,特異性強(qiáng),簡便易行，結(jié)果判定的要求，可用于各類組織，包括新鮮組織樣本，全血，血清，組織切片等樣本的基因篩查，基因分型(SNP，缺失突變，插入突變)等方面。
【專利說明】一種基于彈回探針引物技術(shù)的低頻突變檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種低頻突變檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著臨床上越來越多的運(yùn)用到基因檢測技術(shù)，基因檢測，尤其是基因分型技術(shù)得到較快的發(fā)展，為遺傳病的診斷，腫瘤標(biāo)志基因的的檢測，腫瘤病人的個(gè)性化用藥提供了可行的檢測方案。在腫瘤相關(guān)基因檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，由于腫瘤組織存在的異質(zhì)性，取樣位置的不確定性等，使得腫瘤組織檢測技術(shù)的靈敏度要求較高。
[0003]另外，眾多的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)DNA與組織DNA突變具有一致性，這就表明檢測腫瘤病人的外周游離的DNA能夠反應(yīng)腫瘤組織的突變狀況，使得外周游離樣本成為突變檢測可替代的樣本，由于循環(huán)外周血留取方便，可隨時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測，因此成為較佳的替代選擇。但是在循環(huán)血中除了腫瘤DNA，也存在正常組織DNA，且因個(gè)體差異，腫瘤發(fā)生發(fā)展時(shí)期，治療時(shí)期等原因，循環(huán)DNA的總量不定，且腫瘤DNA所占比例很低，通常小于10%，這就要求突變檢測的技術(shù)手段不需要依賴DNA濃度的判斷，無需聚類對比，具備高特異性以及超高的檢測靈敏度。
[0004]實(shí)現(xiàn)對低頻突變的檢測，需要結(jié)合富集擴(kuò)增技術(shù)和高靈敏的檢測技術(shù)。常見的富集擴(kuò)增的技術(shù)包括酶切富集擴(kuò)增，COLD-PCR，ARMS,鎖核酸/肽核酸探針富集擴(kuò)增技術(shù)(PNA/LNA probe ARMS), Scorpion-ARMS等，這些技術(shù)都能在原有的檢測技術(shù)之上提高檢測靈敏度幾倍到幾百倍，但是或多或少存在使用上的局限。
[0005]酶切富集擴(kuò)增依賴酶切位點(diǎn)的存在，有`許多的位點(diǎn)無法使用此技術(shù)富集，且有的限制酶較貴，限制了此技術(shù)的使用，需要開蓋分步操作，較為繁瑣，對于大規(guī)模的樣本檢測工作量大。COLD-PCR是較為價(jià)廉，方便的一種富集擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)突變與野生型模板之間存在微小的解鏈溫度的不同，在擴(kuò)增時(shí)選擇突變模板解鏈溫度作為變性溫度(Tc值)，從而使得突變模板得到富集擴(kuò)增，但是COLD-PCR技術(shù)要求突變的模板比野生型模板解鏈溫度低，另外突變與野生型模板解鏈溫度相差很小，使得實(shí)驗(yàn)前期Tc值較難摸索。且Tc值會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)體系改變，所用的儀器的改變，甚至是操作人員的改變而改變，因此不利于其推廣利用。ARMS以及鎖核酸/肽核酸探針富集擴(kuò)增技術(shù)(PNA/LNA probe ARMS), Scorpion-ARMS為等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)及其延伸擴(kuò)展技術(shù)，運(yùn)用這些技術(shù)已經(jīng)解決了一系列的低頻突變檢測難題，并開發(fā)出相應(yīng)的試劑盒對外出售。但是ARMS技術(shù)需要聚類對比，對原始擴(kuò)增的基因組模板DNA濃度，新鮮度均一化要求較高，就EGFR/KRAS基因突變檢測來說，基于Scorpion-ARMS技術(shù)的試劑盒一ADx_ Kras kit是目前公認(rèn)用來進(jìn)行EGFR/KRAS基因突變最敏感的方法，對突變檢測的靈敏度可達(dá)1%，但此試劑盒對于不同的突變檢測需要設(shè)計(jì)特異性探針。其結(jié)果受PCR儀的穩(wěn)定性、基因突變結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)以及熒光曲線的判讀等影響較大，技術(shù)通過聚類比較，判讀CT值，所以對原始的模板濃度需要均一化，而血清、血漿樣本的特點(diǎn)使得此方法運(yùn)用到血漿血清樣本檢測成為障礙。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、操作方便、易于推廣的低頻突變檢測方法。
[0007]本發(fā)明提供的低頻突變檢測方法，基于彈回探針引物技術(shù)，是將彈回探針引物富集擴(kuò)增技術(shù)(Snapback ARMS)與彈回探針引物高分辨率溶解曲線(Snapback primer HRM)相結(jié)合的低頻突變檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了萬分之一甚至更高的檢測靈敏度，并滿足了臨床上對突變檢測技術(shù)不易污染，靈敏性高，特異性強(qiáng)，簡便易行，結(jié)果判定的要求，可用于各類組織，包括新鮮組織樣本，全血，血清，組織切片等樣本的基因篩查，基因分型(SNP，缺失突變，插入突變)等方面，以及實(shí)現(xiàn)對低頻體細(xì)胞突變的檢測。
[0008]本發(fā)明提供的基于彈回探針引物技術(shù)的低頻突變檢測方法，具體步驟為:
步驟1，設(shè)計(jì)彈回探針引物。
[0009]彈回探針引物(snapback primer)是將探針序列添加在一條擴(kuò)增引物序列5'端后形成的集探針和引物雙重作用的核酸序列，在PCR擴(kuò)增時(shí)，發(fā)揮引物5’ -3’延伸的作用；不對稱PCR擴(kuò)增后，形成產(chǎn)物單鏈結(jié)構(gòu)，探針序列可以彈回與目標(biāo)雜交序列結(jié)合，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖1所示；
(1)設(shè)計(jì)彈回探針引物序列時(shí)，先設(shè)計(jì)包含有待檢測突變位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物，產(chǎn)物大小不超過300bp ；
(2)將覆蓋突變位點(diǎn)的探針序列添加在相應(yīng)一條擴(kuò)增引物5'端，使得擴(kuò)增之后形成的產(chǎn)物單條鏈，形成彈回蝎型結(jié)構(gòu)，如圖1所示； 注意:使突變位點(diǎn)處于探針 序列中間三個(gè)堿基的位置上；選擇與野生型相匹配的探針；為防止彈回結(jié)構(gòu)為3'端時(shí)，彈回探針引物中的探針部分會(huì)作為引物延伸，需要在彈回探針引物探針末尾添加兩個(gè)不互補(bǔ)配對堿基；
(3)本發(fā)明采用不對稱擴(kuò)增的方式，上游高濃度引物為彈回探針引物，下游低濃度引物，稱為限制引物，即為另一條未連探針的普通擴(kuò)增引物；
(4)彈回探針引物和限制引物使用濃度比為10:1-20:1；
(5)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，由于限制引物使用濃度偏低，實(shí)際體系中退火溫度要比設(shè)計(jì)的溫度要低，因此在設(shè)計(jì)時(shí)，限制引物Tm值要比彈回探針引物Tm值高3°C -5°C ；
(6)將擴(kuò)增后形成的彈回結(jié)構(gòu)堿基序列輸入網(wǎng)頁”The mfold web serve” 一 “DNA folding form”堿基序列輸入框中，在陽離子濃度為50mM,Mg2+濃度為3mM,折疊溫度為
55°C的條件下，確保擴(kuò)增片段形成彈回蝎型結(jié)構(gòu)，即示意圖1中的結(jié)構(gòu)，且二級(jí)結(jié)構(gòu)形式單
o
[0010]步驟2，制備DNA模板。
[0011]使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany), QIAamp blood DNA Midi Kit(Qiagen , Germany),細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(如天根生化科技(北京)有限公司)分別抽提組織DNA，血漿DNA，細(xì)菌基因組DNA ；
(1)組織DNA和細(xì)菌基因組DNA的抽提按照試劑盒說明執(zhí)行；
(2)血漿DNA抽提之前在樣本中加入100-200ng細(xì)菌基因組DNA，之后按照試劑盒的說明進(jìn)行抽提。
[0012]步驟3，配置檢測體系
使用定量384孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)體系的配置，檢測體系中包含:彈回探針引物和限制引物，兩者濃度比為 10:1-20:1 ;還包括:1XPCR buffer, IxLC Green plus+ +,0.4 U TaKaRaTaq HS，DNA 模板，ddH20。
[0013] 具體體系配置見實(shí)施實(shí)例。
[0014]步驟4，設(shè)置反應(yīng)程序，確定Ts值(Light Cycler 480 II )
使用Roche熒光定量PCR儀(Light Cycler 480 II )進(jìn)行反應(yīng)程序的設(shè)置。包括普通PCR擴(kuò)增設(shè)置，富集擴(kuò)增的設(shè)置，HRM檢測程序的設(shè)置。
[0015]富集擴(kuò)增技術(shù)與普通PCR技術(shù)不同的是在于延伸溫度上的選擇，富集擴(kuò)增技術(shù)選擇的延伸溫度為低于野生型擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈彈回結(jié)構(gòu)解鏈溫度而高于突變型擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈彈回結(jié)構(gòu)的解鏈溫度。
[0016]具體程序設(shè)計(jì)見具體實(shí)施實(shí)例。
[0017]步驟5，結(jié)果的判定。
[0018]Snager測序圖以及HRM結(jié)果分析判斷，LC480自帶分析軟件“Tm calling”分析。不同的突變區(qū)別對待。
[0019]本發(fā)明技術(shù)原理分析:
(I)高分辨率溶解曲線分析技術(shù)(high resolution melting analysis, HRM)利用不同長度或不同堿基組成的DNA序列溶解曲線不同的原理，在PCR后直接運(yùn)行高分辨溶解就可完成對樣品突變分析。通過大樣本的HRM分析證實(shí)HRM是一種靈敏度為100%的EGFR基因突變篩選技術(shù)，可用于體細(xì)胞突變的檢測和測序前突變的篩選。
[0020](2)傳統(tǒng)的HRM通過擴(kuò)增一段包含待檢測SNP位點(diǎn)的IOObp左右的產(chǎn)物。通過檢測產(chǎn)物的溶解溫度的變化判斷有無突變。該方法無需序列特異性探針，也不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，應(yīng)用Roche Light Cycler 480，等高分辨率的熒光定量PCR儀器分析，即可完成對樣品基因型的判斷，操作簡單，無需PCR后續(xù)操作，選擇性好。但該方法也有其局限性:只能分析純度單一的小片段DNA，產(chǎn)物超過300bp，靈敏度下降，點(diǎn)突變產(chǎn)生的Tm的變化往往小于1°C，有時(shí)只有0.10C -0.2°C。這就在判別上產(chǎn)生難度，對實(shí)驗(yàn)均一化要求較高，實(shí)際操作工作中只能達(dá)到10%的突變檢出率，反應(yīng)受到體系中離子濃度影響，即反應(yīng)條件以不相同就會(huì)出現(xiàn)差異，這就要求前期模板的均一化處理，且需要聚類比較，結(jié)果判斷需要經(jīng)驗(yàn)分析。
[0021](3)同時(shí)，并不是所有的SNP位點(diǎn)都能通過此法監(jiān)測分析，據(jù)統(tǒng)計(jì)研究，條件優(yōu)化的情況下，仍然有4%左右的SNP位點(diǎn)，以及一些純和的大片段缺失無法通過其檢測分析，總使得此技術(shù)的推廣受到局限。
[0022](4)但是HRM技術(shù)作為一種閉管檢測，簡便快速，靈敏度高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測的一種分型篩查方式，在臨床推廣上有著無可比擬的優(yōu)越性。本發(fā)明旨在運(yùn)用更高精度的HRM技術(shù)，增加其靈敏度，降低判別難度，拓寬檢測范圍，降低技術(shù)門檻，使其在臨床運(yùn)用上得到更好的運(yùn)用。
[0023](5) HRM技術(shù)的檢測原理依據(jù)在于堿基改變產(chǎn)生的Tm的變化，突變堿基在檢測產(chǎn)物中所占比例越小，那么突變產(chǎn)生的堿基改變就會(huì)越大。有研究者就使用小片段擴(kuò)增(small amplication (50bp)左右的產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析,實(shí)驗(yàn)可以解決SNP檢測的盲區(qū),突變產(chǎn)生的Tm的變化明顯，相較而言判別容易，但是小片段擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線易于與引物二聚體相混判，長度上又有要求所以在引物的設(shè)計(jì)上要求高，難設(shè)計(jì)，檢測受到局限。[0024](6)隨后Zhou等發(fā)明了 Unlabeled primer HRM的HRM法，使得此技術(shù)得到較高程度上的提升，其原理為:合成一段封閉探針，與待檢測位點(diǎn)雜交，形成雙鏈雜交峰，通過雜交探針峰Tm值的變化判斷突變有無。
[0025](7)實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵在于:為實(shí)現(xiàn)閉管一步，實(shí)驗(yàn)要求使用不對稱PCR產(chǎn)生與探針雜交的單鏈，使用的探針需要對3'端進(jìn)行封閉，阻止在PCR過程的延伸。實(shí)驗(yàn)要求使用不對稱PCR產(chǎn)生與探針雜交的單鏈。Unlabeled primer HRM可以檢測幾乎所有的SNP位點(diǎn)，缺失突變。點(diǎn)突變產(chǎn)生的Tm值的變化在2-8 V。
[0026](8)此方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)很大程度上滿足低頻稀少突變的檢測。但是需要對探針封閉，使得實(shí)驗(yàn)受到封閉效率，方式上的限制，且費(fèi)用增加。
[0027](9)彈回探針HRM技術(shù):本發(fā)明在Unlabeled primer HRM技術(shù)基礎(chǔ)上，使用彈回探針(snapback primer)HRM技術(shù),其原理是,將雜交探針設(shè)計(jì)在一條擴(kuò)增引物的5'端,通過不對稱擴(kuò)增后，探針彈回與目標(biāo)片段雜交，形成分子內(nèi)雜交的莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，最后通過雜交區(qū)段的溶解曲線分析實(shí)現(xiàn)突變檢測，由于彈回為5'端，所以不需要任何封閉修飾，為防止擴(kuò)增中互補(bǔ)鏈彈回后進(jìn)行3'的擴(kuò)增，在彈回探針引物5'端需要設(shè)計(jì)2個(gè)不匹配堿基。實(shí)驗(yàn)證明，點(diǎn)突變產(chǎn)生的Tm的變化在2V _8°C。與unlabeled primer HRM檢測靈敏度相等。甚至是更高，且不需要額外增加封閉費(fèi)用。真正實(shí)現(xiàn)了低廉、閉管、簡便、快速檢測。
[0028](10)彈回探針HRM顯示野生型與突變型之間的差異在5°C左右，因此在擴(kuò)增循環(huán)過程中，將擴(kuò)增延伸溫度設(shè)置在探針與野生型模板結(jié)合的溫度和與突變型模板結(jié)合的溫度之間，將此擴(kuò)增延伸溫度稱之為Ts值。如圖2:突變型的樣本模板在擴(kuò)增時(shí)，單鏈彈回二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠打開，游離的探針也無法結(jié)合在模板上，因此可以較為順暢的進(jìn)行擴(kuò)增。而野生型由于能完全匹配，結(jié)合溫度高于突變型5°C，因此在擴(kuò)增時(shí)有彈回阻滯，一些游離的snapback primer探針部分也會(huì)結(jié)合在模板探針結(jié)合位點(diǎn)上造成探針對野生型模板擴(kuò)增的阻滯。
[0029]本發(fā)明的優(yōu)勢
(I)使用彈回探針富集擴(kuò)增技術(shù)，使得突變樣本得到很好的富集擴(kuò)增，靈敏度大大提高，與傳統(tǒng)的富集擴(kuò)增技術(shù)相比，彈回阻滯技術(shù)操作便捷，簡單，無任何成本的增加，相比COLD-PCR中Tc值選擇的難度，Ts值更易摸索，且對儀器，操作嚴(yán)苛程度上大大下降，便于推廣實(shí)行，可實(shí)現(xiàn)技術(shù)的試劑盒商品化。
[0030](2)本發(fā)明利用彈回探針實(shí)現(xiàn)富集擴(kuò)增以及HRM檢測，在傳統(tǒng)HRM技術(shù)之上毫無成本的增加，實(shí)現(xiàn)超高靈敏度，高特異，方便，快速，一步進(jìn)行的高通量檢測。
[0031](3)本發(fā)明在判讀方式上僅僅依靠峰型的判斷，無需特殊的分析軟件，更無需聚類分析比較，可實(shí)現(xiàn)不同濃度樣本的檢測，這就意味著對樣本均一化處理要求不高，降低了技術(shù)的操作門檻，可實(shí)現(xiàn)濃度差異很大，不同處理方式樣本的分型比較。
[0032](4)本發(fā)明技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在外周循環(huán)血樣本中進(jìn)行體細(xì)胞突變的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1:產(chǎn)物彈回結(jié)構(gòu)圖示。
[0034]圖2;彈回探針富集PCR原理圖。
[0035]圖3:彈回探針 HRM 技術(shù)(EGFR EXONl9 del，LC480 II)圖示。[0036]圖4:彈回探針富集擴(kuò)增HRM技術(shù)(EGFR EX0N19 del，LC480 II)圖示。
[0037]圖5:EGFR-exon 19 del (15bp)，經(jīng)過彈回探針富集擴(kuò)增(右圖)的混合比例突變樣本測序?qū)Ρ取?br> [0038]圖6:彈回探針 HRM 技術(shù)(EGFR，L858R，LC480 II)圖示。
[0039]圖7:彈回探針富集擴(kuò)增HRM技術(shù)(EGFR-L858R，LC480 II)圖示。
[0040]圖8:經(jīng)過彈回探針富集擴(kuò)增之后送交測序圖。
[0041]圖9:彈回探針 HRM 技術(shù)(KRAS-G12A，LC4II)圖示。
[0042]圖10:彈回探針富集擴(kuò)增HRM技術(shù)(KRAS-G12A，LC4II)圖示。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
[0044]實(shí)施例1
使用EGFR基因19號(hào)外顯子缺失突變樣本，按照不同比例濃度與正常人樣本DNA進(jìn)行混合，將突變占1/106、1/105、1/104、1/1000、1/100、1/10比例的突變混合樣本以及純和突變型、野生型樣本使用 彈回探針普通擴(kuò)增法，富集擴(kuò)增法分別進(jìn)行擴(kuò)增，分別進(jìn)行HRM檢測，并將富集擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送交測序。檢測靈敏度，富集效率。
[0045]1.1.DNA模板的制備:
1.1.1使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany)提取肺癌病人癌旁組織,腫瘤組織DNA，用Nano Drop 2000分光光度計(jì)檢測濃度，并用滅菌雙蒸水稀釋至20ng/W，經(jīng)sanger測序獲得野生型樣本,突變樣本(15bp的缺失)。
[0046]1.1.2將等濃度(20ng/W)突變型與野生型的DNA按所需比例進(jìn)行混合配比得到 DNA模板。
[0047]1.2.配置10微升反應(yīng)體系:
50 mmol/L Tris (pH 8.3), 500 mg/L BSA(牛血清)，3 mmol/L MgCl2，200mmol/LdNTP mix,0.4 U TaKaRa Taq HS，IxLC Green plus+ ,0.5 mol/L 彈回探針引物，0.05mol/L限制引物，DNA模板(40ng)，H20補(bǔ)平至10微升。
[0048]彈回探針引物序列: AACGGAGATGTTGCTTCTCTTAATTCCTTGATAGTCTGTCATAGGGACTCTGGAT (SEQ.1D.N0.1)。
[0049]限制引物序列:
AAGGGAAAGACATAGAAAGTGAACATTTAGGA (SEQ.1D.N0.2)
1.3.反應(yīng)程序(Lightcycler 480 II ):
1.3.1彈回探針HRM程序:
95 °C預(yù)變性2min，擴(kuò)增包括50個(gè)循環(huán)的95 °C變性15 s，65°C，退火10s，75 V延伸15s。HRM檢測包括95 °C變性60 s, 60 V退火60s，從60 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升溫度，進(jìn)行熒光值的收集，最后冷卻至40 °C結(jié)束。
[0050]1.3.2彈回探針富集擴(kuò)增HRM程序:
95°C預(yù)變性2min，擴(kuò)增包括50個(gè)循環(huán)的95 °C變性15 s, 65V退火10s，69 V延伸 15s。
[0051]HRM檢測包括95 °C變性60 s, 60 V退火60s，從60 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升溫度，進(jìn)行熒光值的收集，最后冷卻至40°C結(jié)束。
[0052]1.4.結(jié)果分析:
1.4.1 HRM結(jié)果分析判斷:LC480自帶分析軟件” Tm calling”分析。
[0053]觀察熔解曲線形狀，如圖3:在75°C左右可以看到雜交峰，突變型由于堿基缺失(15bp-18bp)突變使得探針無法雜交，因此野生型樣本為雜交峰最高的，突變占絕對比例的樣本(曲線3)所示無雜交峰，因此選擇低于75°C以下的溫度即可選為Ts值。突變占的越多雜交峰相對越低；除此之外突變樣本雙鏈產(chǎn)物峰也會(huì)產(chǎn)生變化，曲線I野生型低于產(chǎn)物Tm值(87.50C ) 2°C處有個(gè)小的突起雜交峰(注意看縱線所劃區(qū)域區(qū)別)；純和突變型標(biāo)本在75°C無明顯的雜交峰，且低于產(chǎn)物峰Tm值4°C處有突起雜交峰。多次不同樣本，不同比例突變樣本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只要低于產(chǎn)物峰2 °C處出現(xiàn)突起雜交峰，此樣本則為野生型樣本，低于4 1:處出現(xiàn)突起雜交峰則為野生型樣本彈回探針HRM如圖3:到1%后無法分辨出。因此其靈敏度達(dá)不到1%以下的檢測靈敏度，實(shí)驗(yàn)證明其靈敏度在1%。彈回探針富集擴(kuò)增HRM如圖4:到10/0000后仍然可以分辨出，因此其靈敏度可以檢測10/0000突變樣本。
[0054]1.4.2 Sanger測序:將彈回探針富集擴(kuò)增的產(chǎn)物與沒有進(jìn)行富集擴(kuò)增的產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行測序?qū)Ρ取?由上海華大基因科技有限公司完成測序工作)如圖5:圖中對比結(jié)果可以看出彈回探針富集作用明顯，經(jīng)過富集擴(kuò)增之后，此缺失突變?nèi)f分之一的突變樣本可以通過組織測序檢測出來,突變富集效率為1000倍，10%的突變樣本經(jīng)過富集作用后測序圖顯中突變樣本峰為主要峰，野生型峰僅占20%左右。
[0055]實(shí)施例2
使用EGFR基因L858R位點(diǎn)突變樣本，按照不同比例濃度與正常人樣本DNA進(jìn)行混合，將突變占1/106、1/105、1/104、1/1000、1/100、1/10比例的突變混合樣本以及純和突變型、野生型樣本使用彈回探針普通擴(kuò)增法，富集擴(kuò)增法分別進(jìn)行擴(kuò)增，分別進(jìn)行HRM檢測，并將富集擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送交測序。檢測靈敏度，富集效率。
[0056]2.1.DNA模板的制備:
2.1.1使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany)提取肺癌病人癌旁組織,腫瘤組織DNA，，用Nano Drop 2000分光光度計(jì)檢測濃度，并用滅菌雙蒸水稀釋至20ng/W，經(jīng)sanger測序獲得野生型樣本，突變樣本(L858R)。
[0057]2.1.2將等濃度(20ng/W)突變型與野生型的DNA按所需比例進(jìn)行混合配比得到 DNA模板。
[0058]2.2.配置10微升反應(yīng)體系:
50 mmol/L Tris (pH 8.3),500 mg/L BSA(牛血清)，3.5 mmol/L MgCl2 ,200 mmol/LdNTP mix, IxLC Green plus+, 0.4 U TaKaRa Taq HS , 0.5 mol/L 彈回探針引物，0.05 mol/L限制引物，DNA模板(40ng)，H20補(bǔ)平至10微升。
[0059]彈回探針引物序列:
TACACAGATTTTGGACTGGTCAAACTGCGCCACCTCCTTACTTTGCC (SEQ.1D.N0.3)
限制引物序列:
CCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAG (SEQ.1D.N0.4)
2.3.反應(yīng)程序(Lig htcycler 480 II ):
2.3.1彈回探針HRM程序:95 °C預(yù)變性2min，擴(kuò)增包括50個(gè)循環(huán)的95 °C變性15 s，65°C，退火10s，75 °C延伸 15s。
[0060]HRM檢測包括95 °C變性60 s, 55 V退火60s，從55 1:到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升溫度，進(jìn)行熒光值的收集，最后冷卻至40°C結(jié)束。
[0061]2.3.2彈回探針富集擴(kuò)增HRM程序:
95 °C預(yù)變性2min，擴(kuò)增包括50個(gè)循環(huán)的95 °C變性15 S，65°C退火10s，68 V延伸 15s。
[0062]HRM檢測包括95 °C變性60 s, 58 °C退火60s，從58 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升溫度，進(jìn)行熒光值的收集，最后冷卻至40°C結(jié)束。
[0063]2.4.結(jié)果分析:
2.4.1 HRM結(jié)果分析判斷:LC480自帶分析軟件” Tm calling”分析。
[0064]圖6、圖7中包含野生型樣本及各混合比例突變樣本，突變型彈回探針雜交峰出現(xiàn)在65 °C野生型彈回探針雜交峰在71 °C左右，因此可以選擇65 0C-71 1:之間的溫度作為Ts值，越接近65 °C，富集效率越高，對野生型模板的抑制擴(kuò)增作用越明顯。圖6為普通PCR后進(jìn)行的彈回探針HRM檢測圖，圖中I號(hào)曲線和2號(hào)曲線分別表示純和突變樣本和野生型樣本，其余的為突變野生混合樣本,3號(hào)曲線代表突變占1%的樣本，低于1%的突變樣本無法檢測到突變型，因此經(jīng)過普 通PCR彈回探針HRM檢測的靈敏度為1%.圖7為經(jīng)過富集作用的彈回探針HRM檢測圖，圖中I號(hào)，4號(hào)曲線分別代表純突變型和野生型樣本，2號(hào)和3號(hào)曲線代表1/105、1/104的檢測曲線，如圖中所示不低于1/104的突變樣本可以檢測出來，因此經(jīng)過彈回探針富集擴(kuò)增進(jìn)行HRM檢測的靈敏度為1/103。
[0065]2.4.2 Sanger測序:將彈回探針富集擴(kuò)增的產(chǎn)物與沒有進(jìn)行富集擴(kuò)增的產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行測序?qū)Ρ取?由上海華大基因科技有限公司完成測序工作)如圖8經(jīng)過彈回探針富集擴(kuò)增之后送交測序圖，1/200的突變樣本可以經(jīng)過測序判斷，千分之一的富集產(chǎn)物sanger測序無法分辨，因此此點(diǎn)突變的富集作用達(dá)到200倍。低于千分之一的突變經(jīng)過阻滯富集擴(kuò)增之后，由于突變模板所占比例很低，因此擴(kuò)增產(chǎn)物很低，測序信號(hào)很弱，無法測序，這也從側(cè)面證明阻滯野生型模板擴(kuò)增作用明顯。
[0066]實(shí)施例3
使用KRAS基因位點(diǎn)突變樣本，按照不同比例濃度與正常人樣本DNA進(jìn)行混合，將突變占1/106、1/105、1/104、1/1000、1/100、1/10比例的突變混合樣本以及純和突變型、野生型樣本使用彈回探針普通擴(kuò)增法，富集擴(kuò)增法分別進(jìn)行擴(kuò)增，分別進(jìn)行HRM檢測，并將富集擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送交測序。檢測靈敏度，富集效率。
[0067]3.1.DNA模板的制備:
3.1.1使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany)提取肺癌病人癌旁組織,腫瘤組織DNA，用Nano Drop 2000分光光度計(jì)檢測濃度，并用滅菌雙蒸水稀釋至20ng/W，經(jīng)sanger測序獲得野生型樣本，突變樣本(G12A)。
[0068]3.1.2將等濃度(20ng/W)突變型與野生型的DNA按所需比例進(jìn)行混合配比得到 DNA模板。
[0069]3.2.配置10微升反應(yīng)體系:
50 mmol/L Tris (pH 8.3), 500 mg/L BSA(牛血清)，3 mmol/L MgCl2，200mmol/LdNTP
mix, 0.4 U TaKaRa Taq HS , IxLC Green plus+, 0.5 mol/L 彈回探針引物，0.05mol/L限制引物，DNA模板(40ng)，H20補(bǔ)平至10微升。
[0070]彈回探針引物序列:
TTACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGATCATATTCGTCCACA (SEQ.1D.N0.5)
限制引物序列:
GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGT (SEQ.1D.N0.6)
3.3.反應(yīng)程序(Lightcycler 480 II ):
3.3.1彈回探針HRM程序:
95 °C預(yù)變性2min，擴(kuò)增包括55個(gè)循環(huán)的95 °C變性15 s，65°C，退火10s，75 V延伸 15s。
[0071]HRM檢測包括95 °C變性60 s, 55 V退火60s，從55 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升溫度，進(jìn)行熒光值的收集，最后冷卻至40°C結(jié)束。
[0072]3.3.2彈回探針富集擴(kuò)增HRM程序:
95 °C預(yù)變性2min，擴(kuò)增包括55個(gè)循環(huán)的95 °C變性15 s, 65V退火10s，69 V延伸 15s。
[0073]HRM檢測包括95 °C變性60 s, 55 °C退火60s，從55 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升溫度，進(jìn)行熒光值的收集，最后冷卻至40°C結(jié)束。
[0074]3.4.結(jié)果分析:
3.4.1 HRM結(jié)果分析判斷:LC480自帶分析軟件” Tm calling”分析。
[0075]圖9，圖10中包含野生型樣本及各混合比例突變樣本，突變型彈回探針雜交峰出現(xiàn)在66 °C，野生型彈回探針雜交峰在72 °C左右。如圖9為普通PCR后進(jìn)行的彈回探針HRM檢測圖，圖中I號(hào)曲線和2號(hào)曲線分別表示純和突變樣本和野生型樣本，其余的為突變野生混合樣本，3號(hào)曲 線代表突變占1%的樣本，低于1%的突變樣本無法檢測到突變型，因此經(jīng)過普通PCR彈回探針HRM檢測的靈敏度為1%。
[0076]圖10為經(jīng)過富集作用的彈回探針HRM檢測圖，圖中I號(hào)，3號(hào)曲線分別代表純和突變和野生型樣本，2號(hào)和3號(hào)曲線代表1/103突變樣本的檢測曲線，如圖中所示不低于1/103的突變樣本可以檢測出來，因此經(jīng)過彈回探針富集擴(kuò)增進(jìn)行HRM檢測的靈敏度為1/103。
[0077]應(yīng)用示例:
按照示例要求提取肺癌病人肺癌組織樣本47例，同時(shí)抽取離心獲得Iml以上相對應(yīng)的血漿樣本47例，用QIAGEN blood Midi Kit抽提獲得血漿DNA (抽提前，在血漿樣本中加A 100-200ng的細(xì)菌基因組DNA，抽提產(chǎn)物無需測濃度稀釋，直接使用原液DNA1-2微升)。按照實(shí)施示例要求進(jìn)行組織DNA與對應(yīng)血漿DNA樣本EGFR EX19 dele，EX21 L858R基因突變位點(diǎn)的檢測，并使用普通的測序方案進(jìn)行對比。
[0078]結(jié)果顯示彈回富集HRM技術(shù)可以達(dá)到與sanger測序的準(zhǔn)確性，且在靈敏度上大大提高，在Sanger測序的基礎(chǔ)之上檢出多例額外的突變樣本。
[0079]另外相對應(yīng)的血漿DNA樣本檢測結(jié)果顯示，Sanger測序檢測結(jié)果與組織測序的檢測結(jié)果符合率僅僅為10%左右，而本發(fā)明技術(shù)符合度高達(dá)80%，且測出額外組織沒有檢測出突變的樣本一例(可能是組織取樣位置造成結(jié)果符合度的誤差)。[0080]具體突變樣本編號(hào)總結(jié)如下表:_
【權(quán)利要求】
1.一種基于彈回探針引物技術(shù)的低頻突變檢測方法，其特征在于，具體步驟為: 步驟1，設(shè)計(jì)彈回探針引物 彈回探針引物是將探針序列添加在一條擴(kuò)增引物序列5'端后形成的集探針和引物雙重作用的核酸序列，在PCR擴(kuò)增時(shí)，發(fā)揮引物5’ -3’延伸的作用；不對稱PCR擴(kuò)增后，形成產(chǎn)物單鏈結(jié)構(gòu)，探針序列可以彈回與目標(biāo)雜交序列結(jié)合，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)； (1)設(shè)計(jì)彈回探針引物序列時(shí)，先設(shè)計(jì)包含有待檢測突變位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物，產(chǎn)物大小不超過300bp ； (2)將覆蓋突變位點(diǎn)的探針序列添加在相應(yīng)一條擴(kuò)增引物5'端，使得擴(kuò)增之后形成的產(chǎn)物單條鏈，形成彈回蝎型結(jié)構(gòu)； 其中，使突變位點(diǎn)處于探針序列中間三個(gè)堿基的位置上；選擇與野生型相匹配的探針；并且，在彈回探針引物探針末尾添加兩個(gè)不互補(bǔ)配對堿基，以免彈回結(jié)構(gòu)為3'端時(shí)，彈回探針引物中的探針部分會(huì)作為引物延伸； (3)采用不對稱擴(kuò)增的方式，上游高濃度引物為彈回探針引物，下游低濃度引物，稱為限制引物，即為另一條未連探針的普通擴(kuò)增引物；彈回探針引物和限制引物使用濃度比為 10:1-20:1 ； (4)在設(shè)計(jì)時(shí)，限制引物Tm值要比彈回探針引物Tm值高3°C-5°C ； (5)將擴(kuò)增后形成的彈回結(jié)構(gòu)堿基序列輸入網(wǎng)頁”The mfold web serve” 一 “DNA folding form”堿基序列輸入框中，在陽離子濃度為50mM, Mg2+濃度為3mM,折疊溫度為55°C的條件下，確保擴(kuò)增片段形成彈回蝎型結(jié)構(gòu)，且二級(jí)結(jié)構(gòu)形式單一；` 步驟2，制備DNA模板 使用 QIAamp DNA Mini Kit, QIAamp blood DNA Midi Kit,細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒分別抽提組織DNA，血漿DNA，細(xì)菌基因組DNA; 步驟3，配置檢測體系 檢測體系中包含:彈回探針引物和限制引物，還包括:1XPCR buffer, IxLC Greenplus+ +, 0.4 U TaKaRa Taq HS，DNA 模板，ddH20 ； 步驟4，設(shè)置反應(yīng)程序，確定Ts值 使用R°C he熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)程序的設(shè)置，包括普通PCR擴(kuò)增設(shè)置，富集擴(kuò)增的設(shè)置，HRM檢測程序的設(shè)置； 富集擴(kuò)增技術(shù)選擇的延伸溫度為低于野生型擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈彈回結(jié)構(gòu)解鏈溫度而高于突變型擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈彈回結(jié)構(gòu)的解鏈溫度； 步驟5，結(jié)果的判定 Snager測序圖以及HRM結(jié)果分析判斷，LC480自帶分析軟件“Tm calling”分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103614457SQ201310415839
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】孫海燕, 盧大儒 申請人:復(fù)旦大學(xué)