一種體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法、體外檢測(cè)甲型h1n1流感病毒的試劑及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法、體外檢測(cè)甲型H1N1流感病毒的試劑及方法，它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，套引物FNP、套引物BNP。本發(fā)明所提供的體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法使引物與模板的接觸位點(diǎn)增加從而大大提高了擴(kuò)增效率，比普通LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間縮短50%左右，比加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短30%左右，對(duì)疾病的快速診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明所提供的檢測(cè)甲型H1N1流感病毒試劑，其引物之間的關(guān)系采用本發(fā)明所提供的體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法中的方案，對(duì)樣本的檢測(cè)只需40-45分鐘左右即可完成，具有操作簡(jiǎn)便，高效、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法、體外檢測(cè)甲型H1N1流感病毒的試劑及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的擴(kuò)增方法、體外檢測(cè)甲型HlNl流感病毒的試劑及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)依賴于 4 條能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，不需要熱變性的DNA作為模板，在恒溫下就可進(jìn)行高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。因此該方法具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值，不僅適合于科研工作，還可以作為設(shè)備條件相對(duì)較差的基層單位相關(guān)人員進(jìn)行常規(guī)和應(yīng)急檢測(cè)的工具。
[0003]目前最快速的LAMP反應(yīng)方法就是加入環(huán)引物，本研究的目的在于如何縮短等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)時(shí)間，達(dá)到比加入環(huán)引物更快的擴(kuò)增效率。LAMP反應(yīng)是以產(chǎn)物的量為判斷依據(jù)的，在普通LAMP中，和模板接觸的是一對(duì)引物，四個(gè)位點(diǎn)，一種擴(kuò)增程序，本程序確定了本反應(yīng)的內(nèi)在擴(kuò)增效率，除此之外的例如引物濃度等的條件優(yōu)化和模板量和酶的量等決定了外在的擴(kuò)增效率，本研究的目的是提高反應(yīng)的內(nèi)在擴(kuò)增效率。在LAMP反應(yīng)體系中加入環(huán)引物增加了兩個(gè)和核酸模板接觸的位點(diǎn)，所以提高了擴(kuò)增效率，但不改變產(chǎn)物的種類。如果把引物和模板的結(jié)合位置由4個(gè)變?yōu)?個(gè)，那么，反應(yīng)的產(chǎn)物將由I種變?yōu)?種，理論上能大幅增加擴(kuò)增效率。
[0004]2009年爆發(fā)的甲型HlNl流感病毒流行造成全球數(shù)千萬人大流行，死亡人數(shù)達(dá)到數(shù)千人。該病毒具有該病毒毒株包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片段，感染此病毒出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等癥狀。目前該病毒仍在流行，2013年國(guó)內(nèi)仍有死亡病例報(bào)道。本研究以甲型HlNl流感病毒為例，研究新型等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法及試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，使一個(gè)環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)擴(kuò)增完成的時(shí)間比加入環(huán)引物所用的時(shí)間更短。為此本發(fā)明采用以下設(shè)計(jì)方案:
[0006]在目的基因內(nèi)兩端設(shè)計(jì)常規(guī)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的引物，其中一對(duì)為外引物F3、B3和另一對(duì)為內(nèi)引物FIP、BIP，并留出設(shè)計(jì)套內(nèi)引物FNP、BNP和環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r的足夠堿基；加入環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r,可使LAMP反應(yīng)中引物和核酸模板接觸的位置增加2個(gè)，提高了擴(kuò)增效率；
[0007]在外側(cè)內(nèi)引物FIP和BIP之間設(shè)計(jì)一對(duì)套內(nèi)引物FNP、BNP，此時(shí)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)不但能用套內(nèi)引物FNP與BNP根據(jù)核酸模板進(jìn)行擴(kuò)`增，同時(shí)也可以和外側(cè)常規(guī)LAMP弓丨物擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合并擴(kuò)增，使和核酸模板接觸的位置又增加了 4個(gè)；[0008]套內(nèi)引物FNP不但可以和套內(nèi)引物的BNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物BIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增，增大了與核酸模板結(jié)合和擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，反之，套內(nèi)引物BNP也可以和套內(nèi)引物的FNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物FIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
[0009]利用上述引物對(duì)目的基因進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，常規(guī)LAMP反應(yīng)和加入環(huán)引物的LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物只有I種產(chǎn)物的循環(huán)序列，加入環(huán)引物不改變產(chǎn)物的序列；在加入套內(nèi)引物后，產(chǎn)物就是4種擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)序列，即內(nèi)引物FIP、BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP、BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0010]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種適用上述體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的檢測(cè)甲型HlNl流感病毒試劑，可以用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)甲型HlNl病毒。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0011]它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，套引物FNP、套引物BNP ;引物基因序列如下:
[0012]外引物F3: AAGACAAGTTCATGGCCCAATC ；
[0013]外引物B3:CGGCTGCATATCCTGACCC ；
[0014]內(nèi)引物FIP:
[0015]CCGGCTTGAACTTCTTGCTGTAGGGGCATTCACCATCCATCT ；
[0016]內(nèi)引物BIP:`
[0017]GTGCTATAAACACCAGCCTCCCAGGCCAGTCTCAATTTTGTGCTT ；
[0018]環(huán)引物L(fēng)oop-f:GCATTCTGATAGAGACTTTGTTGGT ；
[0019]環(huán)引物L(fēng)oop-r:TTCAGAATATACATCCGATCACAAT ；
[0020]套引物FNP:
[0021]TGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAA ；
[0022]套引物BNP:
[0023]TCATTTCAGATACACCAGTTCACGATTGCCTTGGGTGTCTGACAAGTTGTATTG。
[0024]本發(fā)明第三個(gè)目的是提供運(yùn)用上述試劑的體外新型高效等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)甲型HlNl流感病毒的方法，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)甲型HlNl流感病毒。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0025]引物混合物I μ L，10Xbuffer2.5μ L，模板 RNAl μ L，8U BstDNA 聚合酶 I μ L，10UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶I μ L,濃度為8mol/L的甜菜堿2 μ L，濃度為10mmol/L的dNTP2 μ L,濃度為IOOmmoI/L 的 MgSO4L 2 μ L, Eva_greenl μ L,加入 DEPC-H2O 補(bǔ)足 25 μ L 混勻；
[0026]各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、B3各I μ mol/L，F(xiàn)IP、BIP各15μπιο1/L, Loop-f > Loop-r 各 5 μ mol/L, FNP、BNP 各 15 μ mol/L ；
[0027]所述方法的步驟為:將陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和待測(cè)樣本分別按上述反應(yīng)體系孵育630C 40-45分鐘進(jìn)行反應(yīng)；其中陰性對(duì)照采用雙蒸水；結(jié)果判斷可采用以下方式:
[0028]在熒光定量PCR儀上觀察實(shí)時(shí)熒光曲線，出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線者含有甲型HlNl流感病毒，結(jié)果為陽性，未出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線者，則為沒有甲型HlNl流感病毒，結(jié)果為陰性；或者:[0029]取擴(kuò)增產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果，陽性對(duì)照孔產(chǎn)生階梯狀的條帶，陰性對(duì)照孔則沒有條帶產(chǎn)生，檢測(cè)樣本孔中如產(chǎn)生階梯狀條帶則含有甲型HlNl流感病毒，反之沒有甲型HlNl流感病毒；或者:
[0030]反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)管離心6000rpm，3分鐘，觀察結(jié)果，陽性對(duì)照管可見白色沉淀，陰性對(duì)照管沒有產(chǎn)生沉淀，樣本管中如產(chǎn)生白色沉淀則含有甲型HlNl流感病毒，反之沒有甲型HlNl流感病毒；或者:
[0031]在紫外燈下觀察熒光強(qiáng)度的變化，陽性對(duì)照產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光，陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度沒有變化，樣本管中如產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光則有甲型HlNl流感病毒，反之沒有甲型HlNl流
感病毒。
[0032]本發(fā)明所提供的體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)原有的LAMP技術(shù)的進(jìn)行了改良創(chuàng)新，使引物與模板的接觸位點(diǎn)增加從而大大提高了擴(kuò)增效率，比普通LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間縮短50%左右，比加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短30%左右，對(duì)疾病的快速診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0033]本發(fā)明所提供的檢測(cè)甲型HlNl流感病毒試劑，其引物之間的關(guān)系采用本發(fā)明所提供的體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法中的方案，利用上述方案建立的新型恒溫?cái)U(kuò)增甲型流感HlNl病毒檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便，高效、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)；該方法的建立，對(duì)樣本的檢測(cè)只需40-45分鐘左右即可完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1a為甲型HlNl流感病毒等溫?cái)U(kuò)增的特異性試驗(yàn)產(chǎn)物電泳結(jié)果，M為marker，I為陽性對(duì)照，2-3為甲型HlNl流感病毒，4-5為H3N2流感病毒，6_7為乙型流感病毒，8為水痘病毒，9為黃熱病毒疫苗，10為陰性對(duì)照。
[0035]圖1b為甲型HlNl流感病毒等溫?cái)U(kuò)增的特異性試驗(yàn)沉淀反應(yīng)結(jié)果，M為marker，I為陽性對(duì)照，2-3為甲型HlNl流感病毒，4-5為H3N2流感病毒，6_7為乙型流感病毒，8為水痘病毒，9為黃熱病毒疫苗，10為陰性對(duì)照。
[0036]圖1c為甲型HlNl流感病毒等溫?cái)U(kuò)增的特異性試驗(yàn)熒光檢測(cè)結(jié)果，M為marker，I為陽性對(duì)照，2-3為甲型HlNl流感病毒，4-5為H3N2流感病毒，6_7為乙型流感病毒，8為水痘病毒，9為黃熱病毒疫苗，10為陰性對(duì)照。
[0037]圖2為甲型HlNl流感病毒等溫?cái)U(kuò)增的靈敏度試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光結(jié)果，M為marker，2為I X IO6 拷貝 / μ L，3 為 I X IO5 拷貝 / μ L，4 為 I X IO4 拷貝 / μ L，5 為 I X IO3 拷貝 / μ L，6 為I X IO2 拷貝 / μ L，7 為 I X IO1 拷貝 / μ L。
[0038]圖3為甲型HlNl流感病毒等溫?cái)U(kuò)增的靈敏度試驗(yàn)產(chǎn)物電泳結(jié)果，M為marker，2為I X IO6 拷貝 / μ L，3 為 I X IO5 拷貝 / μ L，4 為 I X IO4 拷貝 / μ L，5 為 I X IO3 拷貝 / μ L，6 為I X IO2 拷貝 / μ L，7 為 I X IO1 拷貝 / μ L。
[0039]圖4為甲型HlNl流感病毒不同方式等溫?cái)U(kuò)增比較結(jié)果，I為新型快速LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，2為加入環(huán)引物的L`AMP擴(kuò)增反應(yīng)，3為普通LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0040]實(shí)施例1甲型HlNl流感病毒的檢測(cè)[0041]1.引物設(shè)計(jì)
[0042]根據(jù)甲型HlNl流感病毒HA基因，設(shè)計(jì)一系列引物，分別是外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，套引物FNP、套引物BNP。引物基因序列如下:
[0043]外引物F3: AAGACAAGTTCATGGCCCAATC ；
[0044]外引物B3: CGGCTGCATATCCTGACCC ；
[0045]內(nèi)引物FIP:
[0046]CCGGCTTGAACTTCTTGCTGTAGGGGCATTCACCATCCATCT ；
[0047]內(nèi)引物BIP:
[0048]GTGCTATAAACACCAGCCTCCCAGGCCAGTCTCAATTTTGTGCTT ；
[0049]環(huán)引物L(fēng)oop-f:GCATTCTGATAGAGACTTTGTTGGT ；
[0050]環(huán)引物L(fēng)oop-r: TTCAGAATATACATCCGATCACAAT ；
[0051]套引物FNP:
[0052]TGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAA ；
[0053]套引物BNP:
[0054]TCATTTCAGATAC`ACCAGTTCACGATTGCCTTGGGTGTCTGACAAGTTGTATTG。
[0055]在上述引物中，外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP是常規(guī)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的引物；
[0056]加入環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，可使LAMP反應(yīng)中引物和核酸模板接觸的位置增加2個(gè)；等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)不但能用套內(nèi)引物FNP與BNP根據(jù)核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)也可以和外側(cè)常規(guī)LAMP引物擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合并擴(kuò)增，使和核酸模板接觸的位置又增加了 4個(gè)；
[0057]套內(nèi)引物FNP不但可以和套內(nèi)引物的BNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物BIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增，增大了與核酸模板結(jié)合和擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，反之，套內(nèi)引物BNP也可以和套內(nèi)引物的FNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物FIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
[0058]利用上述引物對(duì)目的基因進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，常規(guī)LAMP反應(yīng)和加入環(huán)引物的LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物只有I種產(chǎn)物的循環(huán)序列，加入環(huán)引物不改變產(chǎn)物的序列；在加入套內(nèi)引物后，產(chǎn)物就是4種擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)序列，即內(nèi)引物FIP、BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP、BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0059]2.病毒RNA的提取
[0060]將甲型HlNl病毒陽性的鼻咽拭子用無菌生理鹽水混勻洗脫，吸取100 μ I加入ImLtrizol溶液中，按試劑盒說明書提取病毒RNA，溶于100 μ I無RNase水中，一 70°C保存。
[0061]3.新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫(LAMP)擴(kuò)增的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
[0062]反應(yīng)體系如下:10Xbuffer2.5 μ L，引物混合物I μ L(各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、B3 各 I μ mol/L, FIP、BIP 各 15 μ mol/L, Loop-f、Loop-r 各 5 μ mol/L, FNP、BNP 各 15μmol/L)，模板RNAlμL，8U BstDNA 聚合酶 I μ L，10U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，甜菜喊(8mol/L) 2 μ L, dNTP (10mmol/L) 2 μ L, MgSO4 (100mmol/L) 1.2 μ L, Eva_greenl μ L，加入DEPC-H2O補(bǔ)足25 μ L，混勻，在63 °C恒溫反應(yīng)45分鐘。[0063]4.特異性試驗(yàn)
[0064]將乙型流感病毒、H3N2流感病毒、水痘病毒、黃熱病毒疫苗用核酸抽提試劑盒根據(jù)說明書提取核酸，與甲型HlNl流感病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增反應(yīng)體系為10Xbuffer2.5μ L，引物混合物I μ L (各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、B3各I μ mol/L, FIP、BIP 各 15 μ mol/L, Loop-f > Loop-r 各 5 μ mol/L, FNP、BNP 各 15 μ mol/L),模板 RNAlyL，8U BstDNA 聚合酶 I μ L，IOU AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，甜菜堿(8mol/L) 2 μ L，dNTP (IOmmoI/L) 2 μ L, MgSO4 (IOOmmoI/L) 1.2 μ L，Eva_greenl μ L,力卩入 DEPC-H2O 補(bǔ)足25 μ L，混勻，在63°C恒溫反應(yīng)45分鐘后。反應(yīng)電泳結(jié)果見圖la，沉淀反應(yīng)結(jié)果見圖1b，紫外燈下觀察熒光結(jié)果見圖lc。
[0065]反應(yīng)結(jié)果說明除甲型HlNl流感病毒核酸出現(xiàn)比普通LAMP反應(yīng)條帶排列更密的階梯狀條帶的陽性結(jié)果外，陰性對(duì)照、H3N2流感病毒與乙型流感病毒核酸、水痘病毒、黃熱病毒的檢測(cè)結(jié)果均未擴(kuò)增出條帶，顯示為陰性；在熒光定量PCR儀上可見，僅有甲型HlNl流感病毒出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他病毒均為出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，顯示了該方法具有很好的特異性。
[0066]5.靈敏度試驗(yàn)
[0067]用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機(jī)引物法將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收，對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)定OD值，根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度和OD值進(jìn)行拷貝數(shù)計(jì)算，將產(chǎn)物最終稀釋到I X IO8拷貝/ul。將cDNA進(jìn)行10倍遞進(jìn)稀釋，取I μ I作為模板加入反應(yīng)體系中，在63°C恒溫條件下，反應(yīng)60min。在熒光定量PCR儀上觀察實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)圖，結(jié)果見圖3 ;并取2 μ I反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，見圖2，1-6泳道均出現(xiàn)梯狀條帶，表示出現(xiàn)有陽性擴(kuò)增反應(yīng)?？梢耘卸ū痉椒ǖ臋z測(cè)極限約為IX IO2拷貝/yL。
[0068]6.普通LAMP反應(yīng)、加入環(huán)引物L(fēng)AMP反應(yīng)與新型快速LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間比較
[0069]將普通LAMP、加入`環(huán)引物L(fēng)AMP和新型快速等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)采用相同樣本、相同反應(yīng)條件同時(shí)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為63°C，55s,熒光采集5s，100個(gè)循環(huán)。普通LAMP反應(yīng)體系為:10Xbuffer2.5yL，引物混合物IyL (各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、B3 各 I μ mol/L, FIP、BIP 各 15 μ mol/L)，模板 RNAl μ L，8U BstDNA聚合酶 I μ L，IOU AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，甜菜堿(8mol/L) 2 μ L，dNTP (lOmmol/L) 2 μ L,MgSO4 (IOOmmoI/L) 1.2 μ L，Eva_greenl μ L，加入 DEPC-H2O 補(bǔ)足 25 μ L。加入環(huán)引物的反應(yīng)體系為:10Xbuffer2.5μ L，引物混合物I μ L (各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、B3 各 I μ mol/L, FIP、BIP 各 15 μ mol/L, Loop-f、Loop-r 各 5 μ mol/L)，模板 RNAl μ L，8UBstDNA 聚合酶 I μ L, IOU AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，甜菜堿(8mol/L) 2 μ L，dNTP (10mmol/L) 2 μ L，MgSO4(IOOmmoI/L) 1.2μ L, Eva_greenl μ L，加入 DEPC-H2O 補(bǔ)足 25 μ L。新型快速等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系:10Xbuffer2.5μ L，引物混合物I μ L (各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、B3 各 I μ mol/L, FIP、BIP 各 15 μ mol/L, Loop-f、Loop-r 各 5 μ mol/L, FNP、BNP 各15μmol/L)，模板RNAlμL，8U BstDNA 聚合酶 I μ L，10U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，甜菜堿(8mol/L) 2 μ L，dNTP (IOmmoI/L) 2 μ L, MgSO4 (IOOmmoI/L) 1.2 μ L，Eva_greenl μ L,加入 DEPC-H2O 補(bǔ)足25yL。結(jié)果見圖4。由實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)圖可見FAST-LAMP的反應(yīng)時(shí)間大約控制在40-45分鐘左右，加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間為65分鐘左右，普通LAMP反應(yīng)時(shí)間在90分鐘左右。
[0070]實(shí)施例2，出入境發(fā)熱人員甲型HlNl流感病毒的檢測(cè)[0071]采用機(jī)場(chǎng)口岸入境的發(fā)熱病人鼻咽拭子30人份，利用RNA抽提試劑盒根據(jù)說明書提取RNA，反應(yīng)體系如下:10Xbuffer2.5μ L，引物混合物I μ L (引物混合物中各引物濃度分別如下:F3、Β3 各 I μ mol/L, FIP、BIP 各 15 μ mol/L, Loop-f、Loop-r 各 5 μ mol/L, FNP、BNP 各 15μmol/L)，模板RNAlμL，8U BstDNA 聚合酶 I μ L，IOU AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，甜菜喊(8mol/L) 2 μ L, dNTP (10mmol/L) 2 μ L, MgSO4 (100mmol/L) 1.2 μ L, Eva_greenl μ L，加入DEPC-H2O補(bǔ)足25 μ L，混勻，以滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。在熒光定量PCR儀上反應(yīng)程序?yàn)?3°C，55秒，63°C，5秒，讀取熒光值，60個(gè)循環(huán)。30例發(fā)熱病人中有4例出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，新型等溫?cái)U(kuò)增甲型HlNl病毒檢測(cè)結(jié)果為陽性，其他未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陰性。結(jié)果與甲型HlNl熒光定量PCR試劑檢測(cè)`結(jié)果相符。
【權(quán)利要求】
1.一種體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于: 在目的基因內(nèi)兩端設(shè)計(jì)常規(guī)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的引物，其中一對(duì)為外引物F3、B3和另一對(duì)為內(nèi)引物FIP、BIP，并留出設(shè)計(jì)套內(nèi)引物FNP、BNP和環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r的足夠堿基；加入環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r,可使LAMP反應(yīng)中引物和核酸模板接觸的位置增加2個(gè)，提高了擴(kuò)增效率； 在外側(cè)內(nèi)引物FIP和BIP之間設(shè)計(jì)一對(duì)套內(nèi)引物FNP、BNP，此時(shí)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)不但能用套內(nèi)引物FNP與BNP根據(jù)核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)也可以和外側(cè)常規(guī)LAMP弓丨物擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合并擴(kuò)增，使和核酸模板接觸的位置又增加了 4個(gè)； 套內(nèi)引物FNP不但可以和套內(nèi)引物的BNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物BIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增，增大了與核酸模板結(jié)合和擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，反之，套內(nèi)引物BNP也可以和套內(nèi)引物的FNP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)也能跟外側(cè)的常規(guī)內(nèi)引物FIP聯(lián)合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng); 利用上述引物對(duì)目的基因進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，常規(guī)LAMP反應(yīng)和加入環(huán)引物的LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物只有I種產(chǎn)物的循環(huán)序列，加入環(huán)引物不改變產(chǎn)物的序列；在加入套內(nèi)引物后，產(chǎn)物就是4種擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)序列，即內(nèi)引物FIP、BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP、BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，內(nèi)引物FIP和套內(nèi)引物BNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，套內(nèi)引物FNP和內(nèi)引物BIP的擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.一種適用權(quán)利要求1所述體外新型快速環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的檢測(cè)甲型HlNl流感病毒試劑，其特征在于:它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)oop-f、環(huán)引物L(fēng)oop-r，套引物FNP、套引物BNP，引物基因序列如下:
外引物 F3:AAGACAAGTTCATGGCCCAATC ；
外引物 B3:CGGCTGCATATCCTGACCC ； 內(nèi)引物FIP:
CCGGCTTGAACTTCTTGCTGTAGGGGCATTCACCATCCATCT ； 內(nèi)引物BIP:
GTGCTATAAACACCAGCCTCCCAGGCCAGTCTCAATTTTGTGCTT ；
環(huán)引物 Loop-f:GCATTCTGATAGAGACTTTGTTGGT ；
環(huán)引物 Loop-r:TTCAGAATATACATCCGATCACAAT ； 套引物FNP:
TGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAA ； 套引物BNP:
TCATTTCAGATACACCAGTTCACGATTGCCTTGGGTGTCTGACAAGTTGTATTGo
3.一種運(yùn)用權(quán)利要求2所述試劑的體外新型快速等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)甲型HlNl流感病毒的方法，其特征在于: 反應(yīng)體系如下:引物混合物I μ L，10 X buffer2.5 μ L，模板RNAl μ L，8U BstDNA聚合酶I μ L，IOU AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I μ L，濃度為8mol/L的甜菜堿2 μ L，濃度為lOmmol/L的dNTP2 μ L，濃度為 IOOmmoI/L 的 MgSO4L 2 μ L, Eva-greenl μ L,加入 DEPC-H2O 補(bǔ)足 25 μ L 混勻； 各引物在引物混合物中濃度分別如下:F3、Β3各lymol/L，F(xiàn)IP、BIP各15 μ mol/L，Loop-f > Loop-r 各 5 μ mol/L, FNP、BNP 各 15 μ mol/L ； 所述方法的步驟為:將陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和待測(cè)樣本分別按上述反應(yīng)體系孵育.63°C 40-45分鐘進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果判斷可采用以下方式:在熒光定量PCR儀上觀察實(shí)時(shí)熒光曲線，出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線者含有甲型HlNl流感病毒，結(jié)果為陽性，未出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線者，則為沒有甲型HlNl流感病毒，結(jié)果為陰性；或者:取擴(kuò)增產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果，陽性對(duì)照孔產(chǎn)生階梯狀的條帶，陰性對(duì)照孔則沒有條帶產(chǎn)生，檢測(cè)樣本孔中如產(chǎn)生階梯狀條帶則含有甲型HlNl流感病毒，反之沒有甲型HlNl流感病毒；或者: 反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)管離心6000rpm，3分鐘，觀察結(jié)果，陽性對(duì)照管可見白色沉淀，陰性對(duì)照管沒有產(chǎn)生沉淀，樣本管中如產(chǎn)生白色沉淀則含有甲型HlNl流感病毒，反之沒有甲型HlNl流感病毒；或者: 在紫外燈下觀察熒光強(qiáng)度的變化，陽性對(duì)照產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光，陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度沒有變化，樣本管中如產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光則有甲型HlNl流感病毒，反之沒有甲型HlNl流感病毒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103497947SQ201310419597
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】呂沁風(fēng), 鄭偉, 吳忠華, 徐琦, 羅鵬, 何蕾, 李 禾 申請(qǐng)人:浙江國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心