利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，以糖蜜為原料，采用固定化米曲霉發(fā)酵經(jīng)酸解預(yù)處理的糖蜜。本發(fā)明通過前期對(duì)糖蜜進(jìn)行酸處理，一方面可除掉糖蜜中不利于微生物生長(zhǎng)代謝的膠體、重金屬、亞硝酸鹽等雜質(zhì)，另一方面可促使糖蜜中的蔗糖轉(zhuǎn)化為易于被微生物利用的葡萄糖、果糖等單糖。采用固定化米曲霉進(jìn)行發(fā)酵，提供了一種新的固定化方法和發(fā)酵條件，以縮短發(fā)酵周期、提高菌種發(fā)酵能力，一定程度上控制了菌體的過度生長(zhǎng)，也可以重復(fù)利用，并且還具有抗雜菌能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。總之，本發(fā)明綜合利用甘蔗糖業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)曲酸，具有成本低廉、步驟簡(jiǎn)單、容易掌控等優(yōu)點(diǎn)，可有效解決目前曲酸需求增加而產(chǎn)量低、成本高的問題。
【專利說明】利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于有機(jī)酸生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖蜜是制糖行業(yè)生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物，糖膏經(jīng)過反復(fù)蒸煮結(jié)晶后剩余的一種深褐色的粘稠的液體，它含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、維生素、生物素、胺類、色素、酚類等可溶性物質(zhì)。糖蜜成分中含有蔗糖30%?40%、轉(zhuǎn)化糖12%?24%、膠體9%?11%、灰分10%?20%，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種可再生資源，具有巨大的應(yīng)用潛力。我國(guó)是僅次于巴西和印度的世界第三甘蔗種植大國(guó)，南方糖廠擁有非常豐富的甘蔗糖蜜資源。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，2011年廣西甘蔗的種植面積為1547萬(wàn)畝，甘蔗產(chǎn)量5700萬(wàn)噸，按照每噸甘蔗產(chǎn)生0.03噸糖蜜計(jì)算，廣西全區(qū)各糖廠產(chǎn)生的糖蜜就多達(dá)170多萬(wàn)噸。
[0003]糖蜜用途廣泛:早期糖蜜與其他輔料混合制成舔塊，應(yīng)用于飼料行業(yè)；生產(chǎn)焦糖色素的原料；蔗糖分的重提取；糖蜜中含有大量的可發(fā)酵性糖以及微生物生長(zhǎng)所需各種微量元素，還可代替淀粉、葡萄糖等原料用于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外利用糖蜜發(fā)酵獲得的產(chǎn)品主要有:酒精、味精、檸檬酸、酵母、氨基酸、核糖核酸、抗生素、氫氣等。在我國(guó)，糖蜜主要用于酒精發(fā)酵和酵母生產(chǎn)，而隨著糖價(jià)的不斷攀升，糖蜜價(jià)格也逐漸升高，酒精生產(chǎn)成本相應(yīng)提高，此外，高COD和BOD的酒精廢液對(duì)環(huán)境威脅巨大。因此，亟待進(jìn)一步探索糖蜜的綜合利用途徑。
[0004]曲酸(Kojic acid)，學(xué)名5-羥基-2-羥甲基-1，4-吡喃酮，是曲霉屬的某些菌株以糖類為原料，經(jīng)好氧發(fā)酵 生產(chǎn)的一種弱酸性次級(jí)代謝產(chǎn)物。曲酸具有較強(qiáng)的抗菌、抗氧化、與金屬離子螯合和抑制酪氨酸酶活性的作用，也是制備增香劑麥芽酚和乙基麥芽酚的工業(yè)原料，因此，曲酸作為穩(wěn)定劑、保鮮劑、護(hù)色劑、增香劑、多酚氧化酶抑制劑、農(nóng)作物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、殺蟲劑和祛斑劑等被廣泛用于食品加工、化妝品、醫(yī)藥、香料生產(chǎn)和農(nóng)作物生產(chǎn)的諸多領(lǐng)域。
[0005]我國(guó)從上世紀(jì)80年代才開始研究曲酸產(chǎn)品并進(jìn)行了多年研究，1997年以前，該產(chǎn)品一直依賴進(jìn)口。目前，國(guó)內(nèi)多以淀粉質(zhì)為原料進(jìn)行生物發(fā)酵合成曲酸，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取精制。2001年國(guó)內(nèi)曲酸需求量在25噸左右。隨著產(chǎn)品市場(chǎng)的日漸成熟，尤其是在食品添加劑和化妝品方面的廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)對(duì)曲酸的需求日益劇增。曲酸的應(yīng)用方向研究已日趨成熟，增加產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本已經(jīng)成為現(xiàn)階段科技攻關(guān)的主要方向。
[0006]固定化技術(shù)是利用物理或化學(xué)手段將游離的微生物(細(xì)胞)或酶定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持活性且能反復(fù)利用的一種技術(shù)。它具有處理效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、無(wú)二次污染、能耗低以及菌種高純高效、生物濃度高、反應(yīng)易于控制、喪失活性可恢復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，因而越來越受到人們的重視。固定化技術(shù)最早應(yīng)用于醋酸的生產(chǎn)，隨著技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)米曲霉的固定化技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，與游離細(xì)胞發(fā)酵工藝相比較，米曲霉固定化技術(shù)在發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)連續(xù)化和生提高產(chǎn)效率，尤其能有效地解除產(chǎn)物抑制型發(fā)酵過程中產(chǎn)物的抑制效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低廉、步驟簡(jiǎn)單、容易掌控的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，以糖蜜為原料，采用固定化米曲霉發(fā)酵經(jīng)酸解預(yù)處理的糖蜜。
[0009]上述利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，包括以下步驟:
[0010](I)米曲霉孢子的制備；
[0011](2)米曲霉孢子懸浮液的制備；
[0012](3)將米曲霉孢子固定到聚氨酯泡沫(低密度海綿)載體上；
[0013](4)固定化米曲霉的準(zhǔn)備；
[0014](5)糖蜜的酸處理；
[0015](6)固定化米曲霉接種到以糖蜜為原料的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。
[0016]步驟(I)按以下操作進(jìn)行:將米曲霉孢子劃線接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C條件下培養(yǎng)4天，再將米曲霉孢子劃線接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同法反復(fù)傳代3?4代活化菌種，待孢子完全覆蓋菌絲表面，即得。
[0017]步驟(2)按以.下操作進(jìn)行:用無(wú)菌生理鹽水將步驟(I)獲得的米曲霉孢子洗脫下來，孢子洗脫液在超聲清洗儀中處理10s，充分打散孢子，再經(jīng)4層紗布過濾除去菌絲體，將種子培養(yǎng)基緩慢加入到經(jīng)過濾的孢子懸浮液中，使最終的孢子濃度為IO7?IO6個(gè)/mL，即得。
[0018]步驟(3)按以下操作進(jìn)行:采用邊長(zhǎng)為2?6_的正方體聚氨酯泡沫載體，高溫高壓滅菌，冷卻；將步驟(2)獲得的孢子懸浮液按體積比1: 2與固定化載體混合，反復(fù)按壓載體，使懸浮液填充載體內(nèi)部；30°C條件靜置下培養(yǎng)24h，待孢子萌發(fā)、生長(zhǎng)并纏繞在載體上后，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗3?4次，除去未固定的菌絲體，即得。
[0019]步驟(4)按以下操作進(jìn)行:按照體積比2: 5的接種量將步驟(3)獲得的固定化米曲霉添加到種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基裝液量為100mL/250mL三角瓶，30°C條件下，200rpm搖瓶培養(yǎng)3?4d，形成固定化菌體，過濾，保留固定化菌體，即得。
[0020]步驟(5)按以下操作進(jìn)行:糖蜜與水按照體積比1:1進(jìn)行混合稀釋稀釋，再用質(zhì)量濃度為10%的稀硫酸調(diào)節(jié)糖蜜稀釋液pH至3.0,95?100°C保溫lOmin，靜置過夜，取上清液；用質(zhì)量濃度為15%的石灰乳回調(diào)上清液pH至6.0，40°C保溫10min，4000rpm離心lOmin，取上清液，備用。
[0021]步驟(6)按以下操作進(jìn)行:在三角搖瓶中進(jìn)行曲酸發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為40?60mL/250mL，固定化菌體按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5?15% (V/V)添加，發(fā)酵溫度為28?30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180?220rpm，發(fā)酵10天；發(fā)酵培養(yǎng)基為用水稀釋過的步驟(5)獲得的酸處理過的糖蜜，調(diào)節(jié)糖蜜中總糖濃度為60?100g/L，調(diào)節(jié)pH4.0?6.0，高溫高壓滅菌，菌體接種前，向無(wú)菌培養(yǎng)基中添加一定體積的無(wú)水乙醇，發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙醇濃度控制在 20mL/L。
[0022]種子培養(yǎng)基含有蔗糖60g/L、酵母膏 5g/L、KH2P04lg/L、KC10.5g/L、MgSO4 ? 7H200.5g/L、乙醇 20mL/L, pH6.0。
[0023]針對(duì)目前曲酸需求增加而產(chǎn)量低、成本高的問題，發(fā)明人建立了一種利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法:以糖蜜為原料，采用固定化米曲霉發(fā)酵經(jīng)酸解預(yù)處理的糖蜜。本發(fā)明通過前期對(duì)糖蜜進(jìn)行酸處理，一方面可除掉糖蜜中不利于微生物生長(zhǎng)代謝的膠體、重金屬、亞硝酸鹽等雜質(zhì)，另一方面可促使糖蜜中的蔗糖轉(zhuǎn)化為易于被微生物利用的葡萄糖、果糖等單糖。采用固定化米曲霉進(jìn)行發(fā)酵，提供一種新的固定化方法和發(fā)酵條件，以縮短發(fā)酵周期、提高菌種發(fā)酵能力，一定程度上控制了菌體的過度生長(zhǎng)，也可以重復(fù)利用，并且還具有抗雜菌能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)?？傊景l(fā)明綜合利用甘蔗糖業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)曲酸，具有成本低廉、步驟簡(jiǎn)單、容易掌控等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)驗(yàn)材料
[0026]PDA試管斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200，蔗糖20，瓊脂粉20。
[0027]種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖60，酵母膏 5，KH2PO4I，KC10.5,MgSO4 *7H200.5 ;乙醇 20mL/L, pH6.00
[0028]發(fā)酵培養(yǎng)基:用水稀釋酸處理過糖蜜，調(diào)節(jié)糖蜜中總糖濃度60?100g/L，調(diào)節(jié)pH4.0?6.0，高溫高壓滅菌。菌體接種前，向無(wú)菌培養(yǎng)基中添加一定體積的無(wú)水乙醇，培養(yǎng)基中的乙醇濃度控制在20ml/L。
[0029]菌種:米曲霉(Aspergill`us oryzae) GIM3.423,購(gòu)自廣州微生物研究所。
[0030]糖蜜:取自南寧糖業(yè)股份有限公司明陽(yáng)糖廠。
[0031]以250mL三角瓶搖瓶發(fā)酵為例，參考圖1的工藝流程圖，具體說明本發(fā)明固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜制備曲酸工藝。
[0032]實(shí)施例1
[0033](I)米曲霉孢子的制備
[0034]將冷凍保藏的米曲霉孢子劃線接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C條件下培養(yǎng)4天，再將米曲霉孢子劃線接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同法反復(fù)傳代3?4代活化菌種，待孢子完全覆蓋菌絲表面。
[0035](2)米曲霉孢子懸浮液的制備
[0036]用無(wú)菌生理鹽水將步驟(I)獲得的生長(zhǎng)成熟的米曲霉孢子洗脫下來，孢子洗脫液在超聲清洗儀中處理10s，充分打散孢子，再經(jīng)4層紗布過濾除去菌絲體，將種子培養(yǎng)基緩慢加入到經(jīng)過濾的孢子懸浮液中，使最終的孢子濃度為IO7?IO6個(gè)/mL。
[0037](3)將米曲霉孢子固定到聚氨酯泡沫(低密度海綿)載體上
[0038]采用邊長(zhǎng)為2mm的正方體聚氨酯泡沫載體，高溫高壓滅菌，冷卻；將步驟(2)獲得的孢子懸浮液按體積比1: 2與固定化載體混合，反復(fù)按壓載體，使懸浮液填充載體內(nèi)部；30°C條件靜置下培養(yǎng)24h，待孢子萌發(fā)、生長(zhǎng)并纏繞在載體上后，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗3?4次，除去未固定的菌絲體。[0039](4)固定化米曲霉的準(zhǔn)備
[0040]按照體積比2: 5的接種量將步驟(3)獲得的固定化米曲霉添加到種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基裝液量為100mL/250mL三角瓶，30°C條件下，200rpm搖瓶培養(yǎng)3?4d，形成固定化菌體，呈球形，嫩白色，表面光滑，且已具備產(chǎn)酸能力，過濾，保留固定化菌體。
[0041](5)糖蜜的酸處理
[0042]糖蜜與水按照體積比1:1進(jìn)行混合稀釋，再用質(zhì)量濃度為10%的稀硫酸調(diào)節(jié)糖蜜稀釋液pH至3.0，95?100°C保溫lOmin，靜置過夜，取上清液；用質(zhì)量濃度為15%的石灰乳回調(diào)上清液pH至6.0,40°C保溫lOmin, 4000rpm離心IOmin,取上清液,備用。
[0043](6)固定化米曲霉接種到以糖蜜為原料的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸
[0044]發(fā)酵培養(yǎng)基:用水稀釋酸處理過糖蜜，調(diào)節(jié)糖蜜中總糖濃度60g/L，調(diào)節(jié)pH4.0，高溫高壓滅菌，按照20mL/L濃度添加乙醇。
[0045]在三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為40mL/250mL，固定化菌體按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%添加，發(fā)酵溫度為28°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，發(fā)酵10天。
[0046]經(jīng)三氯化鐵比色法測(cè)定，發(fā)酵液中曲酸濃度為6.183g/L。
[0047]實(shí)施例2
[0048]其它同實(shí)施例1，聚氨酯泡沫(低密度海綿)載體的邊長(zhǎng)改為4mm，用水稀釋酸處理過的糖蜜，使糖蜜總糖濃度降至80g/L，調(diào)節(jié)pH5.0，高溫高壓滅菌。發(fā)酵液裝液量為50mL/250mL三角瓶，固定化菌體接種量為10% (V/V)，溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min，發(fā)酵10天。`
[0049]經(jīng)三氯化鐵比色法測(cè)定，發(fā)酵液中曲酸濃度為8.387g/L。
[0050]實(shí)施例3
[0051]其它同實(shí)施例1，聚氨酯泡沫(低密度海綿)載體的邊長(zhǎng)改為6mm，用水稀釋酸處理過的糖蜜，使糖蜜總糖濃度降至100g/L，調(diào)節(jié)pH6.0，高溫高壓滅菌。發(fā)酵液裝液量為60mL/250mL三角瓶，固定化菌體接種量為15% (V/V)，溫度32°C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm，發(fā)酵10天。
[0052]經(jīng)三氯化鐵比色法測(cè)定，發(fā)酵液中曲酸濃度為7.795g/L。
【權(quán)利要求】
1.一種利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于以糖蜜為原料，采用固定化米曲霉發(fā)酵經(jīng)酸解預(yù)處理的糖蜜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)米曲霉抱子的制備； (2)米曲霉孢子懸浮液的制備； (3)將米曲霉孢子固定到聚氨酯泡沫載體上； (4)固定化米曲霉的準(zhǔn)備； (5)糖蜜的酸處理； (6)固定化米曲霉接種到以糖蜜為原料的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于步驟(I)按以下操作進(jìn)行:將米曲霉孢子劃線接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度為30°C條件下培養(yǎng)4天，再將米曲霉孢子劃線接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同法反復(fù)傳代3?4代活化菌種，待孢子完全覆蓋菌絲表面，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于步驟(2)按以下操作進(jìn)行:用無(wú)菌生理鹽水將步驟(I)獲得的米曲霉孢子洗脫下來，孢子洗脫液在超聲清洗儀中處理10s，充分打散孢子，再經(jīng)4層紗布過濾除去菌絲體，將種子培養(yǎng)基緩慢加入到經(jīng)過濾的孢子懸浮液中，使最終的孢子濃度為IO7?IO6個(gè)/mL，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求 4所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于步驟(3)按以下操作進(jìn)行:采用邊長(zhǎng)為2?6mm的正方體聚氨酯泡沫載體，高溫高壓滅菌，冷卻；將步驟(2)獲得的孢子懸浮液按體積比1: 2與固定化載體混合，反復(fù)按壓載體，使懸浮液填充載體內(nèi)部；30°C條件靜置下培養(yǎng)24h，待孢子萌發(fā)、生長(zhǎng)并纏繞在載體上后，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗3?4次，除去未固定的菌絲體，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于步驟(4)按以下操作進(jìn)行:按照體積比2: 5的接種量將步驟(3)獲得的固定化米曲霉添加到種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基裝液量為100mL/250mL三角瓶，30°C條件下，200rpm搖瓶培養(yǎng)3?4d，形成固定化菌體，過濾，保留固定化菌體，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于步驟(5)按以下操作進(jìn)行:糖蜜與水按照體積比1:1進(jìn)行混合稀釋，再用質(zhì)量濃度為10%的稀硫酸調(diào)節(jié)糖蜜稀釋液PH至3.0，95?100°C保溫lOmin，靜置過夜，取上清液；用質(zhì)量濃度為15%的石灰乳回調(diào)上清液pH至6.0,40°C保溫lOmin, 4000rpm離心IOmin,取上清液,備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于步驟(6)按以下操作進(jìn)行:在三角搖瓶中進(jìn)行曲酸發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為40?60mL/250mL,固定化菌體按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5?15%添加，發(fā)酵溫度為28?30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180?220rpm，發(fā)酵10天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為用水稀釋過的步驟(5)獲得的酸處理過的糖蜜，調(diào)節(jié)糖蜜中總糖濃度為60?100g/L，調(diào)節(jié)pH4.0?6.0，高溫高壓滅菌，菌體接種前，向培養(yǎng)基中添加一定體積的無(wú)水乙醇，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的乙醇濃度達(dá)到20mL/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用固定化米曲霉發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)曲酸的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基含有蔗糖 60g/L、酵母膏 5g/L、KH2P04lg/L、KC10.5g/L、MgSO4 ? 7H200.5g/L、乙醇 20mL/L, pH6.0 。
【文檔編號(hào)】C12P17/06GK103436567SQ201310423387
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】孫衛(wèi)東, 李軍委, 唐艷瓊, 戴莉, 唐湘毅 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)