一種產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用。該內(nèi)生菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）HB1310，該枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）HB1310的保藏號(hào)為CGMCCNo.7874。本發(fā)明利用該核桃內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、木糖混合糖液及秸稈水解糖液生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的應(yīng)用，該菌種生長迅速、發(fā)酵周期短，能有效利用葡萄糖和木糖快速生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，并且本發(fā)明所使用的核桃內(nèi)生產(chǎn)油細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油過程中，產(chǎn)油率、葡萄糖和木糖利用率高，加之較短的發(fā)酵周期，填補(bǔ)了利用核桃內(nèi)生細(xì)菌生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的技術(shù)空白，開辟了內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油的新途徑，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，本發(fā)明具體涉及一種生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的核桃內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]進(jìn)入21世紀(jì)，石油資源日趨緊缺，環(huán)境問題日漸凸顯，開發(fā)新的油脂資源作為備用能源已成為全球的研究熱點(diǎn)之一，尤其是生物柴油。國內(nèi)外用于生產(chǎn)生物柴油的原料主要是植物油，但原料成本占到總成本的70%-80%，經(jīng)濟(jì)可行性較差。利用油脂積累量超過生物菌體總量的20%的產(chǎn)油微生物生產(chǎn)油脂制備生物柴油，以其低成本和規(guī)?；a(chǎn)的可行性，已逐漸得以應(yīng)用。
[0003]微生物生產(chǎn)的油脂又稱為單細(xì)胞油脂，是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚矗诰w內(nèi)產(chǎn)生油脂。微生物油脂不僅用于醫(yī)療、食品行業(yè)，更是第三代生物柴油的原料來源。自從20世紀(jì)40年代，人們發(fā)現(xiàn)了高產(chǎn)油脂的斯達(dá)凱依酵母{Lipomyces、粘紅酵母{Rhodotorula
、曲霉屬(Aspergillus)及毛霉屬(Mucor)以來,人們已開展大量工作進(jìn)行產(chǎn)油微生物的篩選，期待獲得高產(chǎn)油的微生物。迄今為止，大多數(shù)微生物油脂多為真菌和微藻所產(chǎn)生，細(xì)菌產(chǎn)油的研究相對(duì)較少。一方面，大多數(shù)細(xì)菌自身產(chǎn)油率較真菌和微藻的低；另一方面，自然界中高產(chǎn)油的細(xì)菌分布也較少。然而，細(xì)菌具有生長速度快、發(fā)酵周期短的特性，能否從高油環(huán)境中分離獲得高產(chǎn)油細(xì)菌具有重要的意義。劉曄等(2008)發(fā)現(xiàn)一株分枝桿菌可利用多種碳源在細(xì)胞內(nèi)積累脂質(zhì)，這些脂質(zhì)的脂肪酸以棕櫚酸和油酸為主，含量分別高達(dá)35%和44%，這一實(shí)例預(yù)示著細(xì)菌在一定代謝途徑調(diào)控下，也可以有效地積累脂質(zhì)。
[0004]核桃是一種油脂含量較高的植物，尤其是新疆薄皮核桃，其脂肪含量可達(dá)60.84%，核桃仁油含較高的多不飽和脂 肪酸，總含量為75.05%，其中亞油酸含量高達(dá)64.03%,亞麻酸達(dá)11.02%，從中分離獲得的內(nèi)生微生物有望獲得高的產(chǎn)油率。目前，在核桃內(nèi)生微生物研究方面的報(bào)道并不多，多集中在內(nèi)生真菌產(chǎn)生抗病物質(zhì)的研究，對(duì)于分離自新疆薄皮核桃的內(nèi)生微生物，尚未有研究報(bào)道。因此，從高含油量的新疆薄皮核桃果實(shí)中分離、篩選高產(chǎn)油內(nèi)生微生物，通過利用廉價(jià)的纖維素水解糖生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，將為開辟內(nèi)生微生物低成本、高效率發(fā)酵產(chǎn)油提供技術(shù)參考，對(duì)于新能源的開發(fā)利用具有重要的社會(huì)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)目前國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)中，未見專門針對(duì)利用核桃內(nèi)生細(xì)菌生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種產(chǎn)單細(xì)胞油脂的核桃內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用，填補(bǔ)了利用核桃內(nèi)生細(xì)菌生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的技術(shù)空白，開辟了內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油的新途徑，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案:
本發(fā)明從新疆主栽核桃產(chǎn)區(qū)薄皮核桃的成熟果實(shí)中取樣,篩選出一批生長良好的微生物菌株，從中優(yōu)選出一株編號(hào)為HB1310的菌株，具有發(fā)酵葡萄糖、木糖混合糖液生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的功能，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定為枯草芽孢桿菌(Mcillus利用該核桃
內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、木糖混合糖液生及秸桿水解糖液產(chǎn)單細(xì)胞油脂的應(yīng)用，該菌種生長迅速、發(fā)酵周期短，能有效利用葡萄糖和木糖快速生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，并且本發(fā)明所使用的核桃內(nèi)生產(chǎn)油細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油過程中，產(chǎn)油率、葡萄糖和木糖利用率高,加之較短的發(fā)酵周期，填補(bǔ)了利用核桃內(nèi)生細(xì)菌生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的技術(shù)空白，開辟了內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油的新途徑，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0007]本發(fā)明具體提供了一種生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的核桃內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)為HB1310，參照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定·手冊(cè)》(ABergeys Manual of Systematic Bacterio logyY)和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)HB1310菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，生理生化鑒定。HB1310菌株于申請(qǐng)日前已保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101,保藏日期是2013年07月02日，保藏號(hào)是CGMCC N0.7874。經(jīng)微生物學(xué)鑒定歸屬為枯草芽孢桿菌subtilis、。該內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)LB培養(yǎng)基和WA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再經(jīng)G4培養(yǎng)基初步篩選，將其初步界定為葡萄糖、木糖利用率高的菌株；該菌株在G4培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)24 h，能形成直徑0.6-0.8 cm的菌落，菌落污白色、不透明，培養(yǎng)24-48h，菌落表面開始形成皺褶，表現(xiàn)出一定的粗糙感；將獲得的核桃內(nèi)生產(chǎn)油細(xì)菌HB1310，用其培養(yǎng)18-24 h的斜面菌種，進(jìn)行革蘭氏染色，染色鑒定結(jié)果為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌。該內(nèi)生產(chǎn)油細(xì)菌能夠在以葡萄糖、乳糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中生長，其發(fā)酵葡萄糖能產(chǎn)酸產(chǎn)氣、發(fā)酵乳糖不產(chǎn)酸和氣，發(fā)酵蔗糖能產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；經(jīng)生理生化反應(yīng)鑒定，該菌株在淀粉水解、明膠液化、吲哚、伏-普、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)中為陽性反應(yīng)，在脂肪水解、石蕊牛奶、尿素、硫化氫、甲基紅實(shí)驗(yàn)中為陰性反應(yīng)。通過上述結(jié)果及經(jīng)過16S rDNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌種編號(hào)為HB1310菌株鑒定為枯草芽孢桿菌subti I is),將純化的菌株枯草芽孢桿菌UaciBm subti I is)進(jìn)行蘇丹黑染色，依據(jù)蘇丹黑染色強(qiáng)度初步確定菌株的產(chǎn)油潛能，進(jìn)而將該菌種按10%接種量接種于純糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過發(fā)酵培養(yǎng)，檢測菌體干質(zhì)量，并通過酸熱法檢測油脂產(chǎn)量，菌株HB1310能有效發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，且發(fā)酵速度較快，并能有效利用秸桿水解糖液中的木糖和葡萄糖生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，從而確定本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌subti I is) HB1310 CGMCCN0.7874是一種優(yōu)良的生產(chǎn)單細(xì)胞油脂菌種。
[0008]本發(fā)明進(jìn)而提供核桃內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌心subtilis)m\?>lQ CGMCCN0.7874的分離和培養(yǎng)方法。
[0009]( I)分離和篩選培養(yǎng)基:
分離培養(yǎng)基采用:LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂22 g，pH7.0，水 1000 mL，12rC滅菌 30 min ;WA 培養(yǎng)基:瓊脂 22-25 g，水 1000 mL，121°C滅菌 30 min，此兩種培養(yǎng)基采用常見的培養(yǎng)基。
[0010]篩選培養(yǎng)基采用G4培養(yǎng)基:D_木糖5 g,葡萄糖5 g,酵母粉5 g,蛋白胨2.5 g,NaCl 5 g，瓊脂22 g，ρΗ7.0，水1000 mL，110°C滅菌30 min，此培養(yǎng)基為本發(fā)明根據(jù)核桃內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌心subti I is) CGMCC N0.7874的屬性自主設(shè)計(jì)。
[0011](2)分離和篩選條件:將核桃果實(shí)洗滌干凈，于75%乙醇中消毒5 min，用無菌水沖洗3_4次，1%H202消毒2min,無菌水沖洗3-4次，切成長寬高均為0.2 cm的小塊，均勻接種于LB培養(yǎng)基和WA培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種3皿，于30-35°C條件下培養(yǎng)。最后一次洗漆無菌水0.1 mL，涂布，進(jìn)行無菌檢查。分離獲得的菌株枯草芽孢桿菌subti I is) CGMCCN0.7874于G4培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，經(jīng)反復(fù)劃線純化，挑取生長良好的單菌落接種于斜面上保藏備用。純化的菌株進(jìn)行蘇丹黑染色，依據(jù)蘇丹黑染色強(qiáng)度初步確定菌株的產(chǎn)油潛倉泛。
[0012]進(jìn)一步，本發(fā)明提供核桃內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌(Macillus sub tilis ) CGMCCN0.7874的發(fā)酵方法。
[0013](I)使用的培養(yǎng)基。
[0014]斜面活化培養(yǎng)基采用G4培養(yǎng)基:D_木糖5 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，蛋白胨2.5g, NaCl 5 g，瓊脂 22 g，ρΗ7.0，水 1000 mL，110°C滅菌 30 min。
[0015]種子培養(yǎng)基:D-木糖5 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g,蛋白胨2.5 g, NaCl 5 g, MgSO40.5 g, KH2PO4 0.25 g, ρΗ7.0，水 1000 mL, 110°C滅菌 30 min。
[0016]純糖發(fā)酵培養(yǎng)基1:葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g, KH2PO4 0.5 g，MgSO4.7H20 I g, ρΗ6.5-7.0，水 1000 mL, 110°C滅菌 30 min。
[0017]純糖發(fā)酵培養(yǎng)基I1: D-木糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g, KH2PO4 0.5 g，MgSO4.7H20 I g, ρΗ6.5-7.0，水 1000 mL, 110°C滅菌 30 min。
[0018]純糖發(fā)酵培養(yǎng)基II1:葡萄糖10 g，D-木糖10 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，KH2PO40.5 g, MgSO4.7H20 I g, ρΗ6.5-7.0，水 1000 mL, 110°C滅菌 30 min。
[0019]秸桿水解糖液發(fā)酵培養(yǎng)基:按w/v糖濃度為5%_7%的水解糖液1000 mL,(NH4)2SO4I g,MgSO4 I g, KH2PO4 0.5 g，酵母粉 3 g, ρΗ6.5-7.0，110°C滅菌 30 min ;秸桿水解糖液的制備采用1%_4%(WZV)H2SO4于110-121 °C水解粉碎的秸桿，糖液經(jīng)Ca(OH)2沉淀和大孔吸附樹脂脫色后調(diào)節(jié)還原糖濃度為5%-7%(w/v)后用于上述秸桿水解糖液發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0020]其中，菌種斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和秸桿水解糖液發(fā)酵培養(yǎng)基為本發(fā)明自主設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，純糖發(fā)酵培養(yǎng)基1、I1、III為 申請(qǐng)人:參考一些產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基后改進(jìn)
的培養(yǎng)基。
[0021](2)發(fā)酵條件:
將菌種枯草芽孢桿菌UaciBm si//?tiJis)HB1310 CGMCC N0.7874經(jīng)過斜面活化培養(yǎng)基G4培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48 h，挑取斜面活化的菌種3-5環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝液量 100 mL，于 30°C、120-150 r/min 振蕩培養(yǎng) 18-24 h，調(diào)節(jié) 0D_ = 0.8-1.0，按 10%接種量接種于純糖發(fā)酵培養(yǎng)基1、I1、III和秸桿水解糖液發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C、120-150r/min振蕩培養(yǎng)120 h，每24 h取樣檢測產(chǎn)油率和還原糖利用率。
[0022]本發(fā)明提供的內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌sub tilis ) HB1310 CGMCCN0.7874分離采用LB培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基，篩選采`用G4培養(yǎng)基，發(fā)酵產(chǎn)油過程采用斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、純糖發(fā)酵培養(yǎng)基和秸桿糖液發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0023]同時(shí)，本發(fā)明提供一種產(chǎn)單細(xì)胞油脂的核桃內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌
subti I is) muio CGMCC N0.7874在生產(chǎn)單細(xì)胞油脂中應(yīng)用。利用該菌種具有發(fā)酵葡萄糖、木糖混合糖液生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的功能，將該核桃內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、木糖混合糖液及秸桿水解糖液生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的應(yīng)用，該菌種生長迅速、發(fā)酵周期短，能有效利用葡萄糖和木糖快速生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，并且本發(fā)明所使用的核桃內(nèi)生產(chǎn)油細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油過程中，產(chǎn)油率、葡萄糖和木糖利用率高，發(fā)酵周期短，填補(bǔ)了利用核桃內(nèi)生細(xì)菌生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的技術(shù)空白，開辟了內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油的新途徑。
[0024]通過實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下有益效果。
[0025](I)本發(fā)明提供核桃內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌(feci77心subti I is) mniQ CGMCCN0.7874，利用該菌種具有發(fā)酵葡萄糖、木糖混合糖液生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的功能，將該核桃內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、木糖混合糖液生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的應(yīng)用，填補(bǔ)了利用核桃內(nèi)生細(xì)菌生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的技術(shù)空白，開辟了內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)油的新途徑。
[0026](2 )本發(fā)明提供的的核桃內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌(Macillus sub tilis ) HB1310CGMCC N0.7874生長迅速、發(fā)酵周期短，能有效利用葡萄糖和木糖快速生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，能有效利用來源于秸桿水解液中的還原糖積累單細(xì)胞油脂，這種以纖維素類物質(zhì)為底物的發(fā)酵產(chǎn)油方式能有效降低油脂生產(chǎn)成本。
[0027](3 )本發(fā)明所使用的核桃內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌(Macillus sub tilis ) HB1310CGMCC N0.7874發(fā)酵產(chǎn)油過程中，產(chǎn)油率、葡萄糖和木糖利用率高，加之較短的發(fā)酵周期，本發(fā)明可提供一種高效率低成本的細(xì)菌生產(chǎn)單細(xì)胞油脂的方式。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1所示為枯草芽孢桿菌subtilis)mUlQ CGMCC N0.7874的菌落形態(tài)圖。
[0029]圖2所示為枯草芽孢桿菌subtilis)mUlQ CGMCC N0.7874的細(xì)胞革蘭氏染色圖。
[0030]圖3所示為枯草芽孢桿菌subtilis)mUlQ CGMCC N0.7874的進(jìn)化樹圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，當(dāng)然，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0032]本發(fā)明采用主要儀器設(shè)備:DK_8D數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠);可見分光光度計(jì)7230G (上海菁華科技有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-S II上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電子天平(AR1140奧克斯國際貿(mào)易(上海)有限公司)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-5205上海亞榮生化儀器廠)；多功能水浴恒溫振蕩器(SHZ-B型江蘇金壇市正基儀器有限公司)；低速離心機(jī)(TD6M湖南凱達(dá)儀器科學(xué)儀器公司)；精密pH計(jì)(PHS-3C上海虹益儀器儀表有限公司)；恒溫磁力攪拌器(國華)；渦旋混合器；超凈工作臺(tái)(SW-CT-CF上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備)；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(HPX-9272MBE上海博訊實(shí)業(yè)有限公司設(shè)備廠)。
[0033]本發(fā)明使用的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海源葉生物科技有限公司，3，5 一二硝基水楊酸、地衣酚等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。[0034]本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0035]實(shí)施例一:枯草芽孢桿菌UaciJJw1Ssubtilis) Em310CGMCC N0.7874 的分離、篩選和鑒定
Cl)核桃內(nèi)生菌HB1310的的分離和篩選
將核桃果實(shí)洗滌干凈，于75%乙醇中消毒5 min，用無菌水沖洗3_4次，1%H202消毒2min，無菌水沖洗3-4次，切成長寬高均為0.2 cm的小塊，均勻接種于LB培養(yǎng)基和WA培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種3皿,于30-35°C條件下培養(yǎng)。最后一次洗漆無菌水0.1mL，涂布，進(jìn)行無菌檢查。分離獲得的菌株于G4培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，并在該平板上反復(fù)劃線純化，挑取生長良好的單菌落接種于斜面上保藏備用。該內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)LB培養(yǎng)基和WA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再經(jīng)G4培養(yǎng)基初步篩選，將其初步界定為葡萄糖、木糖利用率高的菌株；該菌株在G4培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)24 h，能形成直徑0.6-0.8 cm的菌落，菌落污白色、不透明，參見附圖1所示，培養(yǎng)24-48 h，菌落表面開始形成皺褶，表現(xiàn)出一定的粗糙感；將純化的菌株進(jìn)行蘇丹黑染色，依據(jù)蘇丹黑染色強(qiáng)度初步確定菌株的產(chǎn)油潛能，篩選獲得一株內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌心subti I is) CGMCC N0.7874在G4平板上生長最旺，蘇丹黑染色強(qiáng)度最強(qiáng)。
[0036]將獲得的核桃內(nèi)生產(chǎn)油細(xì)菌HB1310，用其培養(yǎng)18_24h的斜面菌種，進(jìn)行革蘭氏染色，染色后于IOX 100倍顯微鏡下檢測，可見菌株形態(tài)為桿狀，并染上均一的藍(lán)紫色，鑒定結(jié)果為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，參見附圖2，菌株大小約為0.7-0.8X2-3 ym ;培養(yǎng)24小時(shí)后，菌株開始產(chǎn)生芽孢，在顯微鏡10X100倍下清晰可見該菌株的芽孢為橢圓形，大小約為
0.6-0.9X1.0-1.5 結(jié)合細(xì)菌ΗΒ1310生理生化特征，依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》(JiBergeys Manual of Systematic Bacterio 70#》)和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)枯草芽孢桿菌(feci77心subtil is) CGMCC N0.7874的進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的HB1310菌株的生理生化特性如表I所示。
[0037]表I核桃內(nèi)生產(chǎn)油細(xì)菌HB1310的生理生化反應(yīng)特性
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)HB1310，該枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) HB1310 的保藏號(hào)為 CGMCC N0.7874。
2.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)HB1310，其特征在于，篩選核桃內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)HB1310的培養(yǎng)基采用G4培養(yǎng)基:D-木糖5g，葡萄糖5g，酵母粉5g，蛋白胨2.5g，NaCl 5g，瓊脂22 g，ρΗ7.0，水 1000 mL，110°C滅菌 30 min。
3.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)HB1310的發(fā)酵方法，其特征在于，將菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)Em310CGMCCN0.7874經(jīng)過斜面活化培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48 h，挑取斜面活化的菌種3_5環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，500 mL 三角瓶裝液量 100 mL，于 30°C、120-150 r/min 振蕩培養(yǎng) 18-24 h，調(diào)節(jié) OD6tltl =0.8-1.0，按10%接種量接種于純糖發(fā)酵培養(yǎng)基1、I1、III和秸桿水解糖液發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C、120-150 r/min振蕩培養(yǎng)120 h，每24 h取樣檢測產(chǎn)油率和還原糖利用率； 上述使用的培養(yǎng)基分別為: 斜面活化培養(yǎng)基采用G4培養(yǎng)基:D-木糖5 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，蛋白胨2.5 g，NaCl 5 g，瓊脂 22 g，ρΗ7.0，水 1000 mL，110°C滅菌 30 min ； 種子培養(yǎng)基:D-木糖5 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，蛋白胨2.5 g, NaCl 5 g，MgSO4 0.5g, KH2PO4 0.25 g, ρΗ7.0，水 1000 mL, 110°C滅菌 30 min ； 純糖發(fā)酵培養(yǎng)基1:葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 0.5 g, MgSO4.7Η20I g，ρΗ6.5-7.0，水 1000 mL，110°C滅菌 30 min ； 純糖發(fā)酵培養(yǎng)基I1: D-木糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g, KH2PO4 0.5 g，MgSO4.7H20 I g, ρΗ6.5-7.0，水 1000 mL, 110°C滅菌 30 min ； 純糖發(fā)酵培養(yǎng)基II1:葡萄糖10 g，D-木糖10 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g,KH2PO4 0.5g, MgSO4.7H20 I g, ρΗ6.5-7.0，水 1000 mL, 110°C滅菌 30 min。
4.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Macillus sub tilis )HB1310的發(fā)酵方法，其特征在于，所述的秸桿水解糖液發(fā)酵培養(yǎng)基按糖濃度為5%-7%的水解糖液 1000 mL, (NH4)2SO4I g，MgSO4 I g，KH2PO4 0.5 g，酵母粉 3 g, ρΗ6.5_7.0，110°C滅菌30 min ;秸桿水解糖液的制備采用1%_4%H2S04于110_121°C水解粉碎的秸桿，糖液經(jīng)Ca(OH)2沉淀和大孔吸附樹脂脫色后調(diào)節(jié)還原糖濃度為5%-7%，所涉及到的％按w/v計(jì)。
5.—種如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)油脂的內(nèi)生細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(feci77w5.subti I is)HB1310在生產(chǎn)單細(xì)胞油脂中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103436474SQ201310424132
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】張琴, 李艷賓 申請(qǐng)人:塔里木大學(xué)