基于膠原水凝膠構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于可注射型膠原水凝膠復(fù)合人卵巢癌細(xì)胞于裸鼠皮下以注射形式無創(chuàng)性構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型的應(yīng)用研究。首次以可注射型膠原水凝膠支架為基底材料，復(fù)合人卵巢癌細(xì)胞SKOV3于裸鼠皮下無創(chuàng)性構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型，并與傳統(tǒng)的無支架材料條件下單獨注射細(xì)胞方式構(gòu)建的人卵巢癌腫瘤模型對比，通過對腫瘤模型進行檢測，結(jié)果表明，基于可注射型膠原水凝膠構(gòu)建的人卵巢癌腫瘤惡性程度更高，與人體卵巢癌腫瘤更為接近，且這種方式構(gòu)建的體內(nèi)腫瘤模型創(chuàng)傷性小。采用該法構(gòu)建的腫瘤模型成瘤性好，成瘤率達到95%，相比于傳統(tǒng)的方式提高了15%左右，對于進一步的研究提供更為可靠的腫瘤模型。
【專利說明】基于膠原水凝膠構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)腫瘤模型一基于膠原水凝膠構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型，具體地說是以可注射型膠原水凝膠為三維支架材料利用腫瘤工程技術(shù)于裸鼠體內(nèi)構(gòu)建人卵巢癌模型的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有的腫瘤模型研究主要基于兩種，一是體外模型，即建立二維腫瘤模型；二是建立動物模型，主要是人腫瘤載荷瘤裸鼠模型。
[0003]就動物模型而言，傳統(tǒng)建模方式是將人腫瘤細(xì)胞直接注入裸鼠皮下，這種方法容易造成細(xì)胞的流失，而且由于無基質(zhì)的支持，細(xì)胞間的連接不緊密，因此成瘤性較差，成瘤存在著一定的幾率。究其原因，可能是由于忽視了細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用這一重要環(huán)節(jié)，難以提供與人體內(nèi)腫瘤相仿的微環(huán)境。這對于重現(xiàn)人體腫瘤細(xì)胞局部黏附、侵襲以及遠處轉(zhuǎn)移有很大的影響。另一方面，體外模型研究也證明材料的引入，為腫瘤細(xì)胞提供了三維環(huán)境，與體內(nèi)環(huán)境更為接近，但是體外培養(yǎng)缺乏體內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞的支撐，且空間有限，難以重現(xiàn)體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。因此，需要進一步的改進體內(nèi)模型的構(gòu)建方式，以便模擬更為接近腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，構(gòu)建更為真實可靠的腫瘤模型，為腫瘤的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是以可注射型膠原水凝膠支架為基底材料，復(fù)合人卵巢癌細(xì)胞SK0V3于裸鼠皮下無創(chuàng)性構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型，對于進一步的醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用提供更為可靠的腫瘤模型。
[0005]本發(fā)明引入了腫瘤`工程技術(shù)，利用腫瘤工程技術(shù)構(gòu)建體內(nèi)腫瘤模型主要是將腫瘤細(xì)胞接種于膠原水凝膠支架材料上，然后直接注入動物體內(nèi)構(gòu)建腫瘤模型。體內(nèi)構(gòu)建的重點在于選擇可降解性支架材料，一方面為細(xì)胞提供暫時支持物，隨著支架的降解吸收，可產(chǎn)生新的組織，這相當(dāng)于重現(xiàn)體內(nèi)腫瘤的形成過程；另一方面，基于凝膠的可注射性，不會對動物造成創(chuàng)傷，因此這項技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
基于膠原水凝膠構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型，所述的體內(nèi)工程化人卵巢癌腫瘤是按照以下方法構(gòu)建的:
1、人卵巢癌腫瘤細(xì)胞的獲取:人卵巢癌腫瘤細(xì)胞株SK0V3購置于ATCC；SK0V3復(fù)蘇后，加入含有10%的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液(Gibco公司)，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代4-6次擴增細(xì)胞數(shù)量；
2、材料配制:1型膠原水凝膠(由四川大學(xué)生物材料工程研究中心饋贈)，用0.5M的冰
乙酸，4°C緩慢溶解配制成7mg/mL，使用時用IM的NaOH調(diào)成pH值為中性，37°C條件下放置4^5分鐘以上由液相變?yōu)楣滔嗄z；3、將細(xì)胞接種于支架材料:把已經(jīng)擴增的SK0V3細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化下來，離心去上清，再加入液狀膠原水凝膠，濃度為IO7個細(xì)胞/mL ；
4、裸鼠移植瘤的構(gòu)建:把細(xì)胞一材料復(fù)合體以200uL量注射于6-8周大的裸鼠左右側(cè)腋部皮下，形成一小丘表示接種成功，體內(nèi)植入30天，構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化卵巢癌腫瘤模型。
[0007]本發(fā)明是基于發(fā)明人的實驗研究而完成的。研究分三大部分:
一、卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)
人卵巢癌細(xì)胞SK0V3購買于ATCC (美國菌種保藏中心)，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加10%胎牛血清。細(xì)胞長至融合度80%以上進行傳代。每兩天換液一次。細(xì)胞放置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0008]二、可注射型膠原水凝膠的制備
膠原水凝膠的制備方法:從新生牛皮中通過梯度法提取I型膠原，用0.5M的冰乙酸溶
解，配制成7mg/mL溶液放置于4°C，使用時IM的NaOH (氫氧化鈉)調(diào)成pH值為中性。在37°C條件下放置4飛分鐘以上可完成液固相轉(zhuǎn)變，成為固體狀水凝膠。
[0009]三、體內(nèi)腫瘤工程化卵巢癌腫瘤模型的構(gòu)建實驗
把已經(jīng)擴增的對數(shù)期腫瘤細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化下來，離心去上清，再接種于膠原水凝膠材料中，濃度為IO7個細(xì)胞/mL。然后將細(xì)胞——材料復(fù)合體以200uL量分別注射于6-8周大的裸鼠左右側(cè)腋部皮下，形成一小丘表示接種成功，構(gòu)建6只裸鼠腫瘤模型，體內(nèi)植入30天，構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化卵巢癌腫瘤模型。對照組為傳統(tǒng)方式構(gòu)建的腫瘤模型，即直接將濃度為IO7個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液200uL注入裸鼠皮下。
[0010]裸鼠皮下原位種植2周后，可觸及到實體腫塊，瘤塊生長30天，猝死裸鼠，取出完整腫瘤，可見膠原水凝膠條件下形成腫瘤的組織不規(guī)則，質(zhì)韌，相比于傳統(tǒng)構(gòu)建的卵巢癌腫瘤更大。通過病理學(xué)檢查顯示，見細(xì)胞核大深染、多形性，核仁明顯，并見有大面積腫瘤壞死灶和新生的腫瘤血管，這符合實體腫瘤的病理組織學(xué)特征。采用免疫組化和WB法(蛋白質(zhì)印跡法)檢測與腫瘤組織惡性程度相關(guān)的蛋白一MMp2 (基質(zhì)金屬蛋白酶2)，MMp9 (基質(zhì)金屬蛋白酶9)，Iaminin (層粘連蛋白)和fibronectin (纖維連接蛋白)的表達,Real-timePCR (實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢查缺氧相關(guān)指標(biāo)HIF-1 α (缺氧誘導(dǎo)因子-1 α )和腫瘤血管生成相關(guān)因子VEGF-A (血管內(nèi)皮生長因子-A)的表達。
[0011]結(jié)果表明，與對照組比較，采用膠原水凝膠材料構(gòu)建的腫瘤工程化模型惡性程度更高，與人體腫瘤更為接近；采用膠原水凝膠植入構(gòu)建體內(nèi)腫瘤模型創(chuàng)傷性小，具有較好的應(yīng)用前景?？傊?，本發(fā)明首次采用膠原水凝膠材料構(gòu)建的腫瘤工程化人卵巢癌模型進行了研究，實驗表明，與未加材料的對照組比較，采用膠原水凝膠材料構(gòu)建的腫瘤工程化模型與人體腫瘤更為接近，且創(chuàng)傷性小，具有較好的應(yīng)用前景。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點:
1、方法簡便，重復(fù)性好，成瘤率高；以可注射型膠原水凝膠為介質(zhì)將腫瘤細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)，操作方法與傳統(tǒng)方法一樣，簡便易行，獲得的腫瘤成瘤率在95%以上(50只裸鼠，成瘤47只)，相比于傳統(tǒng)的僅注射細(xì)胞(50只裸鼠，成瘤41只)的方式提高了 15%左右，對于進一步的研究可提供更為可靠的腫瘤模型。[0013]2、安全性好；膠原水凝膠生物安全性已得到普遍認(rèn)可，裸鼠的存活主要與接種的腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)有關(guān)，與膠原水凝膠關(guān)系不大。基于可注射型膠原水凝膠構(gòu)建的人卵巢癌腫瘤惡性程度更高，與人體卵巢癌腫瘤更為接近，且這種方式構(gòu)建的體內(nèi)腫瘤模型創(chuàng)傷性小。
[0014]3、來源豐富；膠原可從市場上購買。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1體內(nèi)卵巢癌腫瘤模型的大體觀察圖(A:膠原水凝膠復(fù)合SK0V3構(gòu)建的模型；B:單純SK0V3構(gòu)建的模型)
圖2體內(nèi)卵巢癌腫瘤模型組織學(xué)圖片(HE染色)
(A，C:膠原水凝膠復(fù)合SK0V3構(gòu)建的模型；B，D:單純SK0V3構(gòu)建的模型，40X為放大40倍下觀察，100X為放大100倍下觀察)
圖3腫瘤壞死灶面積比及新生的腫瘤血管數(shù)(*p〈0.05, **p〈0.01)
圖 4WB 檢測 MMp2、 MMp9、 1aminin 和 fibronectin 表達(*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，***ρ〈0.001)
圖 5Real-time pCR 檢測 HIF-1 α 和 VEGF-A 的表達(*ρ〈0.05，*ρ〈0.01，***ρ〈0.001)。
【具體實施方式】
[0016]一、卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)
人卵巢癌細(xì)胞SK0V3購買于ATCC，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加10%胎牛血清。細(xì)胞長至融合度80%以上進行傳代。每兩天換液一次。細(xì)胞放置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0017]二、可注射型膠原水凝膠的制備
膠原水凝膠的制備方法:1型膠原，從新生牛皮中通過梯度法提取，用0.5M的冰乙酸溶
解，配制成7mg/mL溶液放置于4°C，使用時IM的NaOH調(diào)成pH值為中性。在37°C條件下放置4飛分鐘以上可完成液固相轉(zhuǎn)變，成為固體狀水凝膠。
[0018]三、體內(nèi)腫瘤工程化卵巢癌腫瘤模型的構(gòu)建實驗 實驗方案:
(O實驗動物模型的體內(nèi)腫瘤工程化卵巢癌腫瘤模型制備
把已經(jīng)擴增的對數(shù)期腫瘤細(xì)胞接種于膠原水凝膠材料中，制成IO7個細(xì)胞/mL水凝膠復(fù)合體。然后將細(xì)胞——材料復(fù)合體以200uL量分別注射于6-8周大的裸鼠左右側(cè)腋部皮下，形成一小丘表示接種成功；對照組不加任何材料以相同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞注射于相同位置的裸鼠皮下，體內(nèi)植入30天，構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化卵巢癌腫瘤模型。
[0019]瘤塊生長第30天，猝死裸鼠，取出完整腫瘤，腫瘤的組織不規(guī)則，質(zhì)韌。一部分-80°C保存用于WB和Real-time pCR檢測，另一部分用10%福爾馬林固定用于組織學(xué)切片。
[0020](2)檢測指標(biāo)
①腫瘤組織病理學(xué)觀察:常規(guī)病理檢察和統(tǒng)計腫瘤壞死面積比及腫瘤血管數(shù)；
②免疫組化檢測MMp2，MMp9,1aminin和fibronectin腫瘤組織惡性程度的蛋白表
達；③WB檢測MMp2,MMp9, Iaminin和fibronectin腫瘤組織惡性程度的蛋白表達；
④Real-time pCR 檢查 HIF-1 α 和 VEGF-A 的表達。
[0021](3)實驗結(jié)果:
①成瘤率及瘤體觀察
分兩次實驗，第一次裸鼠用量為10只，第二次裸鼠用量為40只，兩次結(jié)果表明膠原組成瘤率在95%以上(第一次成瘤10只，第二次成瘤37只)，而對照僅為80%左右(第一次成瘤7只，第二次成瘤34只)。
[0022]如圖1所示，結(jié)果可見采用可注射性膠原水凝膠構(gòu)建的卵巢癌腫瘤瘤體更大，更為堅韌，形狀不規(guī)則；而傳統(tǒng)的單純細(xì)胞構(gòu)建的腫瘤瘤體較小。膠原組構(gòu)建的腫瘤體積為167.6±46.8 mm2，對照組為72.35±28.7 mm2，可見膠原組形成的腫瘤比對照組大一倍以上。
[0023]②腫瘤組織病理檢查情況
如圖2 HE (蘇木精-伊紅染色法)染色所示，膠原組細(xì)胞核大深染、多形性，核仁明顯，并見有大面積腫瘤壞死灶及新生的腫瘤血管，這符合實體腫瘤的病理組織學(xué)特征。如圖3所示，腫瘤壞死灶面積比及新生的腫瘤血管經(jīng)統(tǒng)計分析膠原組明顯比其他材料組及對照組高，p<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0024]③腫瘤組織惡性程度相關(guān)蛋白MMp2, MMp9, Iaminin和fibronectin的蛋白表達 如圖4所示，經(jīng)WB檢測腫瘤組織惡性程度相關(guān)蛋白MMp2, MMp9, Iaminin和fibronectin在膠原組蛋白陽性表達率相比于對照組高，經(jīng)完全隨機方差分析p〈0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明基于膠原水凝膠構(gòu)建的體內(nèi)卵巢癌腫瘤惡性程度更高，成瘤性更好，與真實腫瘤更為接近。
[0025]④Real-time pCR檢查腫瘤生成相關(guān)基因HIF-1 α和VEGF-A的表達
如圖5 HIF-1 α和VEGF-A 的表達所示，膠原組明顯高于對照組(ρ〈0.05)。說明基于膠原水凝膠構(gòu)建的體內(nèi)卵巢癌腫瘤惡性程度更高，可達到與真實腫瘤更為接近的腫瘤微環(huán)境。
【權(quán)利要求】
1.基于膠原水凝膠構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化人卵巢癌腫瘤模型，其特征是:所述的體內(nèi)工程化人卵巢癌腫瘤是按照以下方法構(gòu)建的: 1)人卵巢癌腫瘤細(xì)胞的獲取:人卵巢癌腫瘤細(xì)胞SK0V3購置于ATCC；SK0V3復(fù)蘇后，加入含有10%的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代4-6次擴增細(xì)胞數(shù)量； 2)材料配制:1型膠原水凝膠，用0.5M的冰乙酸，4°C緩慢溶解配制成7mg/mL，使用時用IM的NaOH調(diào)成pH值為中性，37°C條件下放置4~5分鐘以上由液相變?yōu)楣滔嗄z； 3)將細(xì)胞接種于支架材料:把已經(jīng)擴增的SK0V3細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化下來，離心去上清，再加入液狀膠原水凝膠，濃度為IO7個細(xì)胞/mL ； 4)裸鼠移植瘤的構(gòu)建:把細(xì)胞一材料復(fù)合體以200uL量注射于6-8周大的裸鼠左右側(cè)腋部皮下，形成一小丘表示接種成功，體內(nèi)植入30天，構(gòu)建體內(nèi)腫瘤工程化卵巢癌腫瘤模型。
【文檔編號】C12N5/09GK103497931SQ201310427249
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】鄭立, 胡雪峰, 李力, 許國杰, 楊勁松 申請人:廣西醫(yī)科大學(xué)