與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記，采用標記引物Xbarc192和Xbarc253對小麥品種京411的DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴增產(chǎn)物的分子量分別為200bp和186bp，即為小麥小穗數(shù)主效基因位點QTss.cas-7A的分子標記。本發(fā)明所提供的小麥小穗數(shù)主效基因位點的分子標記可用于檢測小麥品種或品系中是否含有增加小穗數(shù)的主效基因位點QTss.cas-7A，以便快速篩選出具有該基因位點的小麥品種或品系用于育種，可大大加快小麥高產(chǎn)品種的選育進程。
【專利說明】與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及小麥分子生物技術(shù)與育種應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說是一種與增加小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥是世界上最主要的糧食作物之一，也是我國第二大糧食作物，其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)直接影響到我國人們生活水平和國家糧食安全。提高小麥單產(chǎn)、培育高產(chǎn)新品種是確保我國小麥總產(chǎn)水平、保障糧食安全的根本出路。小麥產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多個數(shù)量性狀基因位點(Quantitative trait locus, QTL)控制,具有遺傳力低、受環(huán)境影響大、選擇難度高的特性，所以在選育高產(chǎn)小麥品種時，傳統(tǒng)的育種方法常存在時間長、耗費大、成本高、成果小的問題。分子標記輔助育種是一種采用與特定性狀相關(guān)聯(lián)的分子標記作為輔助手段進行育種的有效方法，具有不受環(huán)境條件限制、在植物發(fā)育的各個組織和生育時期均可檢測、選擇效率高的優(yōu)勢。
[0003]穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重是小麥產(chǎn)量構(gòu)成的三要素。數(shù)十年來，在提高小麥產(chǎn)量方面，通過增加穗數(shù)和千粒重來提高小麥產(chǎn)量已經(jīng)取得較大進展，目前較難取得進一步突破；而通過增加穗粒數(shù)仍能繼續(xù)提高產(chǎn)量潛力(何中虎等，作物學報，2011，37:202-215)。小穗數(shù)是穗粒數(shù)的重要構(gòu)成因素，提高小穗數(shù)可以有效增加穗粒數(shù)進而提高小麥產(chǎn)量。因此，研究小穗數(shù)基因，通過分子標記技術(shù)，提高小麥穗粒數(shù)獲得高產(chǎn)小麥新品種，在育種工作中具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是提供一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應(yīng)用，通過發(fā)明獲得的與小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記，來檢測小麥品種或品系中是否具有增加小穗數(shù)的基因位點，以加快小麥高產(chǎn)品種的選育進程。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明所提供的一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記，該分子標記為油似和油arc為?，其所述分子標記油似的左端引物序列如SEQ ID NO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標記油ardM的左端引物序列如SEQ ID NO: 3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
[0006]一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記的獲取方法，它包括以下步驟:米用分子標記Xbarcl似的引物，
左端引物序列 GCGAATAGCACTATGGTAAACATTGAGGTAC (如 SEQ ID 勵:1所述)、
右端引物序列 GCGGGTTCAATTATCAAAAGGCACAG (如 SEQ ID NO:2 所述)
和分子標記Xbarc253的引物，
左端引物序列 GGGAAGACACGACACGACTC (如SEQ ID勵:3所述)、右端引物序列 TCGTAAGATTACCTCGGATGAAGAA (如 SEQ ID NO:4 所述)
對小麥品種京411的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 4 11101/1)各1.0 μ I, IOXBuffer 2.0 μ I,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 yl，Taq 酶(5 U/μ 1)0.2 μ l,dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ I,DNA (30 ng/μ I) 2.0 口1，其余用(1(1!120補足；PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性7 min;94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s,34個循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；擴增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即得到與小麥小穗數(shù)主效基因位點QTss.cas~7A緊密連鎖的分子標記。
[0007]本發(fā)明所述的與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記在選育高產(chǎn)小麥中的應(yīng)用，即為將與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記用于檢測小麥品種或品系的方法，該方法它包括以下步驟:
a.用Xbarc192和Xbarc253的標記引物對小麥品種或品系的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 μ mol/L)各1.0 μ 1，IOXBuffer 2.0μ 1，Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ I,DNA (30 ng/μ 1)2.0 μ 1，其余用ddH20補足;PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性7 min ;94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；
b.將上述擴增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如油似的擴增產(chǎn)物分子量大小為200 bp的分子標記和油的擴增產(chǎn)物分子量大小為186 bp的分子標記同時出現(xiàn)，則該小麥品種或品系為具有增加小穗數(shù)的基因位點cas~7A的品種或品系，否則，該小麥品種或品系屬于不具有該基因位點的品種或品系。
[0008]本發(fā)明提供的與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記的篩選方法，它包括以下步驟:
(i)以小麥品種小偃54為母本、京411為父本進行雜交得到FnF1自交產(chǎn)生F2，采用單粒傳法獲得含有182個株系的F7代RIL群體；
(ii)用SDS法(Sharpet al.，1989)提取所述RIL群體各株系的DNA，采用簡單重復(fù)序列標記(SSR標記)、基于表達序列標簽的SSR標記(EST-SSR)和Glu標記對所述株系進行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
(iii)利用MAPMAKER3.0作圖軟件將獲得的所述RIL群體的基因型資料構(gòu)建小麥的分子遺傳圖譜，其LOD 3.0 ；
(iv)將所述RIL群體進行田間種植，并對RIL群體的各株系分別進行表型調(diào)查，獲得各株系的小穗數(shù)的特征數(shù)據(jù)；
(v)利用基于混合線性模型的QTLNetwork2.1作圖軟件對每個分子標記的群體基因型資料與對應(yīng)每個株系的小穗數(shù)進行連鎖分析，在/7 ( 0.001時，染色體7A上的小穗數(shù)QTL的峰值均在區(qū)間；
(vi)其油似和油ardM標記引物在小麥品種京411的DNA中獲得的擴增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即為與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記。
[0009]本發(fā)明所述小麥品種京411的DNA是指對小麥品種京411植株的葉片分離提取后獲得的DNA。
[0010]本發(fā)明所述小麥品種京411和小偃54均為審定品種。其中京411于1991年通過北京市品種審定；1992年通過天津市、山西省和全國品種審定；京411可以從國家農(nóng)作物種質(zhì)資源庫索取，全國統(tǒng)一編號為ZM020984。小偃54于2000年通過陜西省品種審定，該品種可以從江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用研究中心索取，編號為蘇4394。
[0011]本發(fā)明所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8 g丙烯酰胺和0.2 g的甲叉丙烯酰胺。
[0012]本發(fā)明公開的小麥小穗數(shù)緊密連鎖的分子標記Xbarc 192和Xbarc253充分體現(xiàn)了小麥品種或品系的小穗數(shù)的主效基因位點，通過該分子標記對小麥衍生品種或品系PCR擴增，可以很快捷地對小麥品種或品系是否具有小穗數(shù)主效基因位點QTss.cas-7A進行判斷，從而快速篩選出具有該基因位點的小麥品種或品系，加快高產(chǎn)小麥品種的選育進程。
[0013]將本發(fā)明提供的與小麥小穗數(shù)主效基因位點QTss.cas-7A緊密連鎖的分子標記方法用于小麥育種，不僅篩選快速精準，不受環(huán)境影響，選擇目標明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提聞了聞廣小麥品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為小麥小穗數(shù)主效基因位點QTss.cas-7A在染色體7A上的作圖區(qū)間。[0015]圖1中:空心長方形代表染色體，右側(cè)是分子標記的名稱，左側(cè)數(shù)字是標記之間的遺傳距離，單位是CM ;標有黑色下劃線的標記為尬似和尬;染色體左下方的灰色填充的長方形表示QTL作圖區(qū)間，TSS代表小麥小穗數(shù)。
[0016]圖2為小麥品種京411為親本的F7代RIL群體的10個衍生品系用Xbarc 192標記引物進行PCR擴增的電泳條帶圖。
[0017]圖3為小麥品種京411為親本的F7代RIL群體的10個衍生品系用Xbarc253標記引物進行PCR擴增的電泳條帶圖。
【具體實施方式】
[0018]下面實施例用于進一步詳細說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0019]實施例1
一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點緊密連鎖的分子標記，
采用標記引物Xbarc 192,
左端引物序列 GCGAATAGCACTATGGTAAACATTGAGGTAC (如 SEQ ID NO:1 所述)
右端引物序列 GCGGGTTCAATTATCAAAAGGCACAG (如 SEQ ID NO:2 所述)
和標記引物油
左端引物序列 GGGAAGACACGACACGACTC (如 SEQ ID NO:3 所述)
右端引物序列 TCGTAAGATTACCTCGGATGAAGAA (如 SEQ ID NO:4 所述)
對小麥品種京411的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 μ mol/L)各 1.0 μ I, IOXBuffer 2.0 μ I,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 yl，Taq 酶(5U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ 1，DNA (30 ng/μ I) 2.0 口1，其余用(1(1!120補足；PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性7 min;94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；所使用的PCR儀型號為:Applied BiosystemsVeriti Thermal Cycler (本發(fā)明中所有PCR擴增均采用該型號PCR儀)；擴增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即為小麥小穗數(shù)主效QTL的分子標記。
[0020]本發(fā)明提供的與小麥小穗數(shù)主效基因位點QTss.cas~7A緊密連鎖的分子標記的篩選方法，它包括以下步驟:
(i)以小麥品種小偃54為母本、京411為父本進行雜交得到雜種FnF1自交產(chǎn)生F2，采用單粒傳法獲得含有182個株系的F7代RIL群體；
(ii)用SDS法(Sharpet al.，1989)提取上述RIL群體各株系的DNA，采用簡單重復(fù)序列標記(SSR標記)和基于表達序列標簽的簡單重復(fù)序列標記(EST-SSR標記)對所述株系進行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
其中SSR、EST-SSR和Glu標記標記分析是將篩選株系的DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在所述8%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，根據(jù)分子標記篩選結(jié)果，篩選出親本間有多態(tài)的引物，親本間有多態(tài)的引物在所選RIL群體的株系中進行分析，獲得所述RIL群體的基因型資料
(iii)利用MAPMAKER3.0作圖軟件，將獲得的RIL群體的基因型資料構(gòu)建具有555個標記的小麥的分子遺傳圖譜，以LOD ^3.0為標準；其中555個標記是由523個SSR、18個EST-SSR和14個Glu位點組成；
(iv)將RIL群體進行了兩年共六個試驗環(huán)境的田間種植及表型鑒定，分別考查不同年份和不同環(huán)境條件下的各個株系的小穗數(shù)，其中兩年六個試驗環(huán)境即2006年對照處理、2006年低氮處理、2006年低磷處理、2007年對照處理、2007年低氮處理和2007年低磷處理。
[0021]其中小麥種植方法:RIL群體中每個株系種植4行，行長1.5 m、行間距0.25 m、每行種植30粒種子，正常生長及收獲；小穗數(shù)測定方法:將收獲后各株系的小麥穗子取10穗調(diào)查小穗數(shù)，重復(fù)3次，取平均值計算小穗數(shù)。
[0022](V)利用基于混合線性模型的QTLNetwork 2.1作圖軟件，以/7 ( 0.001為標準對每個分子標記的群體基因型資料與對應(yīng)每個株系的小穗數(shù)進行連鎖分析并作圖；
(vi)由QTL分析可得:在染色體7A上分別發(fā)現(xiàn)5個環(huán)境條件下重復(fù)出現(xiàn)小穗數(shù)QTL峰值的區(qū)間為Xbarc 192-Xbarc253,如圖1、表I所示。
[0023]表I小穗數(shù)基因位點QTss.cas~7A的定位結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點吸ks.cas~7A緊密連鎖的分子標記，其特征在于該分子標記為Xbarc 192和Xbarc253，其所述分子標記Xbarc 192的左端引物序列如SEQ IDNO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標記油的左端引物序列如SEQ ID NO:3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
2.一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點cas~7A緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特征在于它包括以下步驟: 以Xbarc 192 MXbarc253標記引物對小麥品種京411的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為 20 μ 1，包括:左、右端引物(10 ymol/L)各 1.0 μ I, IOXBuffer 2.0 μ l,Mg2+(25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ 1，DNA (30ng/μ 1)2.0 μ 1，其余用ddH20補足；PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性7 min ;94°C變性30 s,50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；擴增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得對應(yīng)的擴增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即為小麥小穗數(shù)主效基因位點吸ks.cas~7A的分子標記；其中油似標記左端引物序列如SEQ ID NO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述標記左端引物序列如SEQ ID NO:3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
3.—種檢測小麥品種或品系的方法，其特征在于它包括以下步驟: a.用Xbarc192和油ardM的標記引物對待測小麥品種或品系的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 ymol/L-l.0 μ I, IOXBuffer2.0 μ 1，Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6μ 1，DNA (30 ng/μ 1)2.0 μ 1，其余用 ddH20 補足;PCR 擴增程序為:94°C預(yù)變性 7 min ；94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)； b.將上述擴增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如油似的擴增產(chǎn)物中分子量大小為200 bp的擴增片段的擴增產(chǎn)物中分子量大小為186 bp的擴增片段同時出現(xiàn)，則該待測小麥品種或品系為具有增加小穗數(shù)的主效基因位點的品種或品系，否則，該待測小麥品種或品系屬于不具有該位點的品種或品系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與小麥小穗數(shù)主效基因位點吸ks.緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特征在于所述小麥品種京411的DNA是指對小麥品種京411植株的葉片分離提取后獲得的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與小麥小穗數(shù)主效基因位點QTss.cas~7A緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特征在于所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8 g丙烯酰胺和0.2 g的甲叉丙烯酰胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測小麥品種或品系的方法，其特征在于所述的小麥的品種或品系為以小麥品種京411為親本，通過采用常規(guī)雜交并繁衍至F2代以上獲得的小麥品種或品系。
【文檔編號】C12N15/11GK103451183SQ201310427312
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】安調(diào)過, 許云峰, 王瑞芳, 童依平, 劉冬成, 張愛民, 李濱 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所