一種用于檢測谷梅4號抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子標(biāo)記InDel587的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測谷梅4號抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子標(biāo)記InDel587，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記InDel587位于第6染色體10484756-10484985bp處，與抗稻瘟病基因Pigm(t)的定位區(qū)間10367733-1042226bp相距65.2kb，緊密連鎖，而且標(biāo)記InDel587多態(tài)率高，87.2％的受體親本與供體親本谷梅4號之間存在多態(tài)；InDel587的PCR產(chǎn)物差異大，能快速檢測出材料的標(biāo)記基因型。通過用分子標(biāo)記檢測待檢材料，可以判斷其是否攜帶抗病基因Pigm(t)。
【專利說明】—種用于檢測谷梅4號抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子標(biāo)記InDe I 587
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種用于檢測谷梅4號抗稻瘟病基因Pigm⑴的分子標(biāo)記InDel587。
【背景技術(shù)】
[0002]抗稻瘟病基因Pigm(t)文獻(xiàn)(TheorAppl Genet, 2006,113:705-713)中公布的分子標(biāo)記大多為CAPS標(biāo)記，不適合分子標(biāo)記輔助選擇，還有SSR和InDel標(biāo)記主要是用于遺傳定位的，在育種中存在多態(tài)率較低，差異較小的缺點。傳統(tǒng)的水稻抗病育種是通過抗性鑒定對植株進(jìn)行表型選擇，耗費時間長，且易受環(huán)境條件的限制，鑒定結(jié)果容易造成誤差，選擇效率較低。
[0003]稻瘟病是危害我國水稻生產(chǎn)的三大主要病害之一，通過分子標(biāo)記輔助選擇抗病基因是培育抗病品種的有效途徑之一。谷梅4號具有廣譜稻瘟病抗性，Pigm(t)定位于第6染色體分子標(biāo)記C5483和C0428之間約70kb的范圍內(nèi)，文獻(xiàn)中公布的用于遺傳定位的分子標(biāo)記，不太適用于標(biāo)記輔助育種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種用于檢測谷梅4號抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子標(biāo)記InDel587。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]—種用于檢測谷梅4號抗稻痕病基因Pigm(t)的分子標(biāo)記InDel587,上游引物為5’ -AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3’，下游引物為 5’ -GAGTTCGTACTITTCAGGCTT-3 ’。
[0007]本發(fā)明提供的分子標(biāo)記InDel587位于第6染色體10484756_10484985bp處，與抗稻瘟病基因Pigm(t)的的定位區(qū)間10367733-1042226bp相距65.2kb，緊密連鎖，而且標(biāo)記InDel587多態(tài)率高，87.2%的受體親本與供體親本谷梅4號之間存在多態(tài)；InDel587的PCR產(chǎn)物差異大，能快速檢測出材料的標(biāo)記基因型。通過用分子標(biāo)記檢測待檢材料，可以判斷其是否攜帶抗病基因Pigm(t)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為標(biāo)記InDel587檢測谷梅4號和46個水稻親本的電泳圖。
[0009]圖2為標(biāo)記InDel587檢測揚稻6號//揚稻6號/谷梅4號雜交后代的電泳圖；
[0010]圖3為標(biāo)記InDel587檢測徐稻3號//徐稻3號/谷梅4號雜交后代的電泳圖；
【具體實施方式】
[0011]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0012]在基因Pigm(t)定位區(qū)間附近找到日本晴BAC AP005659，在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)用BLAST程序?qū)P005659與秈稻品種93-11的序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AP005659在133714-133742bp與93-11存在差異，以AP005659在133714-133742bp為中心，向上下游各取500bp的序列，用軟件Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計，得到了一對引物序列，上游引物為5 ’ -AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3 ’，下游引物為5’ -GAGTTCGTACTTTTCAGGCTT-3’，將這對引物進(jìn)行標(biāo)記多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)品種在此位點與谷梅4號存在多態(tài)性，將此引物命名為InDel587。
[0013]InDe1587:上游引物為 5 ’-AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3 ’，下游引物為5’ -GAGTTCGTACTTTTCAGGCTT-3’。
[0014]擴增日本晴的PCR產(chǎn)物大小為230bp，擴增序列為:
[0015]5，-AACTTGCTGGGAGAAGGATTGCCGTACATACCACGTGACAGAAACATGACAAATCGCCTTGAAAGAGGAAAAAAACAATTGGGGGGGGGGGGGGGGTTCTAGATCTTTTGAGATAGAGATTGGTACATTACTGTGATGTAAGGTCTGATTGTCATATGCTGATCACATGTATAAACATCTTTTTCTTGCTATTGTGATTTATTTGGTATAAGCCTGAAAAGTACGAACTC-3，。
[0016]DNA 的提取米用常規(guī)的 CTAB 法(Murray&Thompson, 1980Rapid isolation ofhigh-moIecuIar-weight plant DNA.Nucleic Acids Res8:4321-4325)。
[0017]PCR反應(yīng)在EPPEND0RF梯度PCR儀(型號:Mastercycler Pro)上進(jìn)行，擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙淀(EB)染色后，BIO-RAD凝膠成像儀(型號:GelDoc XR)紫外燈下掃描拍照和分析。
[0018]所述PCR擴增體系(20ul)為:0.2μπιο1 l-1的正、反向引物各1.5 μ L，200 μ mo IL-1 的 dNTPs2 μ L，10 X PCR buffer2 μ L，50 ~IOOng 的 DNA 模板 2 μ L, IU μ L-1 的 Tag 酶0.3 μ L, ddH2010.7 μ L。
[0019]所述PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性45秒，58°C復(fù)性45秒，72°C延伸I分鐘，32個循環(huán)，72 °C延伸5分鐘。
[0020]于幼苗期取47個親本材料的少量嫩葉(47個親本材料，編號為1:谷梅4號，2:K17B，3:中健2號，4:珍珠糯，5:鄂中4號，6:廣超921，7:廣超922，8:粵抗924，9:農(nóng)香18，10:農(nóng)香21，11:玉針香，12:培矮64，13:美雅占，14:協(xié)青早B，15:珍汕97B，16:天豐B，17:廣占 63S，18:豐源 B，19:I1-32B,20:明恢 63，21:明恢 86，22:R527,23:R838,24:特青，25:R13，26:揚稻4號，27:揚稻6號，28:揚稻8號，29:津稻1007，30:圣稻15，31 圣稻16，32:新稻20號，33:寧粳4號，34:蘇秀10號，35:徐稻6號，36:華粳7號，37:武運粳21，38:鎮(zhèn)稻88，39:鎮(zhèn)稻99，40:武運粳24，41:淮稻5號，42:淮稻13，43:揚粳4038，44:揚粳4227，45:鎮(zhèn)稻15號,46:鎮(zhèn)稻16號,47:武香粳14,48:谷梅4號。以上材料由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供)，利用CTAB法提取基因組DNA ;按順序取47個親本材料的DNA2uL，依次加入 0.2 μ mol-1 的 InDel587 正、反向引物各 1.5 μ L，200 μ mo I l-1 的 dNTPs2 μ L, 10XPCRbuffer2 μ L，IU μl-1的Tag酶0.3 μ L，ddH2010.7 μ L ;放入PCR儀中進(jìn)行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94 V預(yù)變性5分鐘，94 V變性45秒，58 V復(fù)性45秒，72 °C延伸I分鐘，32個循環(huán)，72 °C延伸5分鐘；PCR反應(yīng)結(jié)束后，按順序取IOuL產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，120V恒定電壓下電泳30分鐘，關(guān)閉電泳儀電源，將凝膠在BIO-RAD凝膠成像儀(型號:Gel DocXR)紫外燈下掃描拍照和分析，參考圖1。
[0021]取揚稻6號//揚稻6號/谷梅4號群體20個單株葉片用InDel587進(jìn)行檢測，實驗過程同上。順序為1:谷梅4號，2:揚稻6號，3-22為20個回交單株后代，其中5、6、9、11、14、16、19、22攜帶基因Pigm(t)，結(jié)果如圖2。
[0022]取徐稻3號Il徐稻3號/谷梅4號群體23個單株葉片用InDel587進(jìn)行檢測。實驗過程同上。順序為1:谷梅4號，2:徐稻3號，3-25為23個回交單株后代，其中5、6、10、12、14、17、20、21、25 攜帶基因 Pigm(t)，結(jié)果如圖 3。
[0023]應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬`于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測谷梅4號抗稻瘟病基因Pigm(t)的分子標(biāo)記InDel587，上游引物為5’ -AACTTGCTGGGAGAAGGATTG-3’，下游引物為 5’ -GAGTTCGTACTTTTCAGGCTT-3 ’。
【文檔編號】C12Q1/68GK103497996SQ201310428162
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】潘存紅, 李愛宏, 戴正元, 朱俊凱, 余玲, 肖寧, 李育紅, 張小祥, 劉廣青, 趙步洪, 王寶和, 黃年生, 周長海, 譚長樂, 季紅娟, 劉曉靜 申請人:江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所