龜紋瓢蟲特異性coi引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及龜紋瓢蟲特異性COI引物以及含有該引物的檢測試劑盒，根據(jù)龜紋瓢蟲特有的mtDNA序列，設(shè)計了一對龜紋瓢蟲特異性COI引物PjF1和PjR1（SEQ?ID?No.1和2），該對引物僅對龜紋瓢蟲具有特異性擴增能力，擴增產(chǎn)物大小為256bp，質(zhì)粒濃度檢出限為1.205943134E+04，DNA濃度檢出限為0.00585938ng/μL。本發(fā)明采用PCR技術(shù)，提高了檢測準確性，節(jié)約了檢測時間，適于基層推廣應(yīng)用。
【專利說明】龜紋瓢蟲特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體地說，涉及龜紋瓢蟲特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]龜紋瓢蟲Propylea japonica (Thunberg)是鞘翅目瓢蟲科的捕食性天敵昆蟲,常見于農(nóng)田雜草以及果園樹叢，分布廣泛。龜紋瓢蟲能捕食瓢蟲、葉蟬、飛虱等多種(類)害蟲，捕食量大；而且龜紋瓢蟲在田間的種群發(fā)生密度高，是我國農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢捕食性瓢蟲，在農(nóng)作物害蟲種群的自然控制中發(fā)揮著重要作用。
[0003]隨著對瓢蟲捕食行為的深入研究，發(fā)現(xiàn)瓢蟲間普遍存在集團內(nèi)捕食現(xiàn)象，且該現(xiàn)象對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中不同物種的種群動態(tài)以及對害蟲生物防治效果產(chǎn)生復(fù)雜而巨大的影響。由于瓢蟲種類繁多，常規(guī)的腸道解剖、行為觀察等傳統(tǒng)研究方法無法準確評估瓢蟲間集團內(nèi)捕食作用。為了準確鑒定瓢蟲種類及科學評估瓢蟲的集團內(nèi)捕食作用，需要建立一套快速而準確的分子檢測方法，但目前還沒有針對龜紋瓢蟲的標準檢測方法。聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、簡便快速等特點,可根據(jù)物種特異性引物清楚區(qū)分至種，在物種種類鑒定中占據(jù)重要地位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供龜紋瓢蟲特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)龜紋瓢蟲的線粒體DNA序列，設(shè)計一對龜紋瓢蟲特異性COI引物，其包括:
[0006]正向引物PjFl:5’-AAATGACCAAATTTATAATGTT-3’
[0007]反向引物PjRl:5’-TGATGATAAAGGAGGATAAACT-3’。
[0008]本發(fā)明還提供含有引物PjFl和PjRl的用于檢測龜紋瓢蟲的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0009]本發(fā)明還提供所述引物PjFl和PjRl，以及含有引物PjFl和PjRl的試劑盒在檢測
龜紋瓢蟲中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供一種龜紋瓢蟲的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0011]1)提取樣品DNA;
[0012]2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物PjFl和PjRl進行PCR擴增反應(yīng)；
[0013]3)分析PCR產(chǎn)物。
[0014]PCR反應(yīng)體系以20 μ L計為:[0015]
【權(quán)利要求】
1.龜紋瓢蟲特異性COI引物，其特征在于，其包括: 正向引物 PjFl:5’ -AAATGACCAAATTTATAATGTT-3’ 反向引物 PjRl:5’ -TGATGATAAAGGAGGATAAACT-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測龜紋瓢蟲的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測龜紋瓢蟲中的應(yīng)用。
6.龜紋瓢蟲的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品DNA； 2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物PjFl和PjRl進行PCR擴增反應(yīng)； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6 所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以20μ L計為:
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:94°C4分鐘；94°C30秒，540C 30秒，72 0C 30秒，共40個循環(huán)。
【文檔編號】C12N15/11GK103451185SQ201310428805
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】楊帆, 王倩, 陸宴輝, 徐建祥 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所