一種草魚(yú)呼腸孤病毒ⅰ型和ⅱ型的雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)待測(cè)樣本中同時(shí)檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的存在，并能對(duì)兩種病毒的負(fù)載水平進(jìn)行定量。本發(fā)明還提供了一種用于草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確率高、可靠，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步涉及了一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤病毒科一新成員，是中國(guó)大陸分離的第一株魚(yú)類(lèi)病毒。該病毒主要引起中國(guó)、越南、緬甸等亞洲國(guó)家淡水養(yǎng)殖中的草魚(yú)品種在魚(yú)種階段發(fā)生出血病，死亡率可高達(dá)60%以上。該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅漁業(yè)生產(chǎn)。草魚(yú)呼腸孤病毒具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60 nm~70nm，二十面體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜，基因組由11條分節(jié)段的雙鏈RNA組成。目前己經(jīng)報(bào)道了 20多個(gè)分離株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02, GCRV⑶10、GCRV GCRV104株等，不同分離株在基因組序列、基因組帶型、細(xì)胞病變、對(duì)草魚(yú)的致病力等方面差異較大。到目前為止，已完成全基因組序列分析的毒株有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV⑶10、GCRV 104等，也有比較多的毒株只完成了部分節(jié)段或者部分序列的測(cè)序工作。草魚(yú)呼腸孤病毒比較復(fù)雜，不同分離株的各基因節(jié)段存在重配和抗原漂移現(xiàn)象，使得目前還沒(méi)在血清學(xué)或者基因型上對(duì)其進(jìn)行亞型分類(lèi)。但是通過(guò)現(xiàn)有的分離株序列信息來(lái)看，至少應(yīng)該有三類(lèi)，各類(lèi)的代表株分別是:第一類(lèi)為873株和JX09-01株，第二類(lèi)為HZ08株和⑶10株，第三類(lèi)型為104株。在相關(guān)的研究報(bào)道中已有提到將其進(jìn)行基因分型的探討，即分別把一、二和三類(lèi)按照基因序列差異分為1、II和III型(曾偉偉，王慶，劉永奎等.一株草魚(yú)呼腸孤病毒弱毒株的分離、鑒定及免疫原性初步分析.水生生物學(xué)報(bào)，2011.35 (5):790-795 ;曾偉偉，王慶，王英英，張樂(lè)生，劉寶芹，石存斌，吳淑勤.草魚(yú)呼腸孤病毒三`重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué).2013，20(2): 329-335)。同一亞型的毒株，其對(duì)應(yīng)各節(jié)段基因同源性均在95%以上。
[0003]當(dāng)前，全國(guó)各地分離到的流行株中，三類(lèi)亞型均有報(bào)道，有的單獨(dú)感染，也有混合感染。根據(jù)近幾年的草魚(yú)出血病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查分析表明，目前導(dǎo)致草魚(yú)出血病流行和爆發(fā)的最主要為GCRV II型，其次是GCRV I型，而GCRV III型幾乎沒(méi)有檢測(cè)和分離到因此，根據(jù)草魚(yú)出血病的流行特點(diǎn)和草魚(yú)呼腸孤病毒分子生物學(xué)特性，根據(jù)同一亞型不同毒株之間共有的保守序列分別設(shè)計(jì)引物，建立針對(duì)目前主要流行基因型的草魚(yú)呼腸孤病毒均能同時(shí)作診斷，并且可以鑒定其亞型的雙重?zé)晒舛縍T-PCR快速、特異檢測(cè)技術(shù)。
[0004]草魚(yú)呼腸孤病毒的檢測(cè)方法有多種，各具優(yōu)勢(shì)和缺陷，病毒分離、電鏡觀(guān)察、核酸帶型分析至今仍是檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒普遍采用的方法，但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作比較復(fù)雜，不能對(duì)病毒進(jìn)行快速診斷，不利于草魚(yú)出血病的流行病學(xué)調(diào)查工作。全病毒診斷涉及病毒培養(yǎng)、純化及濃縮等過(guò)程，不僅制作過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)，成本較高，而且還潛在散毒危險(xiǎn)，因此不利于推廣使用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)某片段基因進(jìn)行擴(kuò)大數(shù)百萬(wàn)倍。該技術(shù)特異性強(qiáng)，敏感性高、檢測(cè)快速，已被廣泛用于醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等學(xué)科的各領(lǐng)域。草魚(yú)呼腸孤病毒不同毒株的RT-PCR檢測(cè)方法已經(jīng)廣泛建立起來(lái)，該方法具有快速性、準(zhǔn)確性和高靈敏性等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)Σ蒴~(yú)呼腸孤病毒感染作出早期診斷，給疫情的快速分析和控制提供有力的技術(shù)支撐。其中的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)平臺(tái)作為簡(jiǎn)捷和可靠的草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)方法，不僅可以定性檢測(cè)病毒的有無(wú)，而且可以定量分析病毒含量的多少，對(duì)于草魚(yú)出血病的診斷和草魚(yú)呼腸孤病毒的基礎(chǔ)研究均具有重要的意義。多重?zé)晒舛縋CR是一種特殊熒光定量PCR形式，其最突出特點(diǎn)是一次PCR可同時(shí)檢測(cè)多種病原，尤其適用于病原復(fù)雜或基因型較多的病原檢測(cè)。
[0005]因此，建立能夠同時(shí)對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù)，不僅可以做到對(duì)不同亞型的草魚(yú)呼腸孤病毒進(jìn)行鑒別診斷和定量分析，而且可以簡(jiǎn)化操作程序、節(jié)約成本，對(duì)草魚(yú)出血病的流行病學(xué)調(diào)查、病原監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警都具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)待測(cè)樣本中同時(shí)檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的存在，并能對(duì)兩種病毒的負(fù)載水平進(jìn)行定量。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，包括如下成分:雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性質(zhì)控品和無(wú)RNA酶去離子水，所述雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液中含有草魚(yú)呼腸 孤病毒I型和II型特異性引物及雙重探針，序列分別為:草魚(yú)呼腸孤病毒I型:
上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ (SEQ ID N0.2)；
熒光探針:GCRV-1 -P:5，-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3，(SEQ IDN0.3)
草魚(yú)呼腸孤病毒II型:
上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ (SEQ ID N0.4)；
下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)；
熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)草魚(yú)呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM，草魚(yú)呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQl。
[0009]進(jìn)一步的,所述雙重突光定量反應(yīng)液的組成如下:
GCRV-1 -F (100 μ Μ)5μ L
GCRV-1 -R (100 μ Μ)5 μ L
GCRV-1 -P (100 μ Μ)4μ L
GCRV-11-F (100 μ Μ)6 μ LGCRV-11-R (100 μ Μ)6 μ L
GCRV-11-P (100 μ Μ)5 μ L
無(wú)RNA酶去離子水169 μ L
Total200 μ L。
[0010]進(jìn)一步的,所述酶混合液包括逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶。
[0011]進(jìn)一步的，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為滅活的草魚(yú)呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液。
[0012]一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，包括如下步驟:
1)提取待測(cè)樣品中的病毒RNA；
2)以提取的RNA為模板，使用草魚(yú)呼腸孤病毒I型的
上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ (SEQ ID N0.2)；
熒光探針:GCRV-1 -P:5，-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3，(SEQ IDN0.3)和草魚(yú)呼腸孤病毒II型的
上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ (SEQ ID N0.4)；
下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)；
熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)，其中，草魚(yú)呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM，草魚(yú)呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQl ；
3)結(jié)果分析:反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)待測(cè)樣品的熒光Ct值判斷待測(cè)樣品是否為草魚(yú)呼腸孤病毒I型、草魚(yú)呼腸孤病毒II型陽(yáng)性。
[0013]進(jìn)一步的，所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系包括病毒RNA模板、雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液、無(wú)RNA酶去離子水。
[0014]進(jìn)一步的，所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)條件為42 °C 30min，94~96°C 3~8min，然后經(jīng)94~96°C 7~IOs和58~62°C 32~38s采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明提供的試劑盒可同時(shí)對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型兩種病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，并能夠?qū)悠分胁≡w的核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)精確檢測(cè)和定量分析，準(zhǔn)確率高，操作簡(jiǎn)便，成本低，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0016]本發(fā)明提供的試劑盒引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測(cè)的靈敏度和特異性得到很大程度的提高，從而避免了其他檢測(cè)方法特異性不高容易漏診和誤診的問(wèn)題，基于上述優(yōu)點(diǎn)，該草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II檢測(cè)試劑盒對(duì)草魚(yú)出血病的流行病學(xué)調(diào)查、病原監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警都具有重要的意義。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為GCRV I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)草魚(yú)出血病臨床樣品的結(jié)果圖；
圖2為雙重?zé)晒釶CR體系中檢測(cè)I型 草魚(yú)呼腸孤病毒的靈敏度實(shí)驗(yàn)圖，從左到右依次為 I X 108、I X 107、I X 106、I X 105、I X IO4、I X 103、IXlO2、I X 10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果;
圖3為雙重?zé)晒釶CR體系中檢測(cè)II型草魚(yú)呼腸孤病毒的靈敏度實(shí)驗(yàn)圖，從左到右依次為 1X108、1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、、1X10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果；圖4為雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中GCRV I型病毒的特異性實(shí)驗(yàn)圖；
圖5為雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中GCRV II型病毒的特異性實(shí)驗(yàn)圖；
圖6為雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法中GCRV I型和II型病毒的特異性實(shí)驗(yàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具本實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但并不局限于此。
[0019]實(shí)施例1:
1、特異性引物及探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)從Genbank上檢索到的草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的核酸序列，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的引物和探針，其序列如下:
魚(yú)呼腸孤病毒I型:
上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ (SEQ ID N0.2)；
熒光探針:GCRV-1 -P:5，-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3，(SEQ IDN0.3)，擴(kuò)增片段159bp ；
草魚(yú)呼腸孤病毒II型:
上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ (SEQ ID N0.4)；
下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)；
熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)擴(kuò)增片段198bp。
[0020]用于檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM，用于檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQl。
[0021]2、陽(yáng)性質(zhì)控品的制備
將草魚(yú)呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液進(jìn)行沸水浴30min，進(jìn)行滅活處理，滅活后的草魚(yú)呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液即為陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0022]3、病毒RNA的提取
按Trizol試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司，貨號(hào):15596-026)的說(shuō)明書(shū)或按照QiagenRNA提取試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司，貨號(hào):74104)的說(shuō)明書(shū)步驟，從感染相應(yīng)病毒的魚(yú)體內(nèi)臟組織中提取RNA，作為RT-PCR反應(yīng)的模板。
[0023]4、雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增
每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下，RT-PCR反應(yīng)液12.5 μ L、待檢測(cè)樣品的RNA模板5 μ L、雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液4 μ L、酶混合液I μ L、無(wú)RNA酶去離子水2.5 μ L，同樣按照上述體系設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，加入陽(yáng)性質(zhì)控品或無(wú)RNA的去離子水 5μ L進(jìn)行擴(kuò)增。其中RT-PCR反應(yīng)液包括 500mmol/L KC1、100mmol/L Tris-HCl、1.5mmol/L MgCl2、lOmmol/L dNTPs 和 l%(v/v)TritonX-1OO0[0024]將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測(cè)的名稱(chēng)和熒光基團(tuán)種類(lèi)(檢測(cè)GCRV-1的報(bào)告基團(tuán)選擇FAM，檢測(cè)GCRV-1I的報(bào)告基團(tuán)選擇CY5，淬滅基團(tuán)選擇BHQ1)，設(shè)定反應(yīng)條件為42°C 30min,95°C 5min，然后經(jīng)95°C 8s和60°C 35s采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。
[0025]5、結(jié)果分析和判定
反應(yīng)結(jié)束后，在FAM通道內(nèi)，熒光曲線(xiàn)呈S型曲線(xiàn)且Ct值< 34.0，判定為草魚(yú)呼腸孤病毒I型陽(yáng)性；若無(wú)典型S型曲線(xiàn)或以值> 34.0，判定為草魚(yú)呼腸孤病毒I型陰性。在CY5通道內(nèi)，熒光曲線(xiàn)呈S型曲線(xiàn)且Ct值< 34.0，判定為草魚(yú)呼腸孤病毒II型陽(yáng)性；若無(wú)典型S型曲線(xiàn)或Ct值> 34.0，判定為草魚(yú)呼腸孤病毒II型陰性。二者均為陽(yáng)性，則判斷為型草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II共陽(yáng)型。
[0026]根據(jù)上述檢測(cè)方法，取15份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖1中可以看出，15份樣品中，檢測(cè)到I型信號(hào)的有2份，檢測(cè)到II型信號(hào)的有5份。另外，所有參與檢測(cè)的臨床樣品同時(shí)分別通過(guò)細(xì)胞分離和常規(guī)的RT-PCR方法檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與本發(fā)明的雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)結(jié)果一致。
[0027]6、靈敏度實(shí)驗(yàn)
分別提取I型和II型草魚(yú)呼腸孤病毒RNA (1.0X IO8拷貝/ μ L)，依次稀釋為IX 108、I X 107、1Χ 106、1Χ 105、1Χ 104、1Χ103、1.0Χ102、1Χ10 拷貝 / μ L，進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。
[0028]雙重?zé)晒舛縋CR體系中I型草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)見(jiàn)圖2，從左到右依次為 I X 108、1Χ 107、1Χ 106、1Χ 105、1Χ104、1 Χ103、1.0Χ102、1Χ10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。雙重?zé)晒舛縋CR體系中II型草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)見(jiàn)圖3，從左到右依次為 I X 108、1Χ 107、1Χ 106、1Χ 105、1Χ104、1 Χ103、1.0Χ102、1Χ10 拷貝 / μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
[0029]檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)1.0X 10拷貝/μ L，并且Ct值隨濃度減少呈梯度改變，精確性?xún)?yōu)于普通PCR方法，表明本發(fā)明試劑盒和檢測(cè)方法對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒I型/ II型的診斷具有高度的靈敏性。
[0030]7、特異性實(shí)驗(yàn)
為了檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的特異性，用本發(fā)明的草魚(yú)呼腸孤病毒I型/ II型雙重?zé)晒舛?RT-PCR 檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè) KHV、IHNV, LMBV, ISKNV, GCRV ΗΖ08 株、GCRV JX09-01 株和陰性對(duì)照組(無(wú)RNA去離子水)，分析本試劑盒對(duì)魚(yú)類(lèi)其它常見(jiàn)病毒和草魚(yú)呼腸孤病毒的檢測(cè)情況。
[0031]檢測(cè)結(jié)果表明:
FAM通道僅對(duì)I型草魚(yú)呼腸孤病毒進(jìn)行擴(kuò)增(如圖4所示)，從圖4中可以看出，GCRVJX09-01株為陽(yáng)性，KHV、IHNV, LMBV, ISKNV和陰性對(duì)照組均為陰性。
[0032]CY5通道僅對(duì)II型草魚(yú)呼腸孤病毒進(jìn)行擴(kuò)增(如圖5所示)，從圖5中可以看出，GCRV ΗΖ08株為陽(yáng)性，KHV、IHNV, LMBV, ISKNV和陰性對(duì)照組均為陰性。
[0033]當(dāng)樣本中存在草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型兩類(lèi)病毒時(shí)，F(xiàn)AM通道和CY5通道均能進(jìn)行擴(kuò)增(如圖6所示)。從圖6中可以看出，GCRV JX09-01株和GCRV ΗΖ08株為陽(yáng)性，KHV、IHNV, LMBV, ISKNV和陰性對(duì)照組均為陰性。
[0034]上述結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明檢測(cè)試劑盒能特異性擴(kuò)增出相對(duì)應(yīng)基因型的一種或兩種草魚(yú)呼腸孤病毒，而不與其它病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。說(shuō)明本發(fā)明方法及試劑盒特異性好，未出現(xiàn)假陽(yáng)性。
[0035]本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過(guò)多次不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
【權(quán)利要求】
1.一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒包括如下成分--雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性質(zhì)控品和無(wú)RNA酶去離子水，其特征在于:所述雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液中含有草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型特異性引物及雙重探針，序列分別為: 草魚(yú)呼腸孤病毒I型:
上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ ； 下游引物:GCRV-1 -R:5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ ； 熒光探針:
GCRV-1 -P:5’ -FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3’ ； 草魚(yú)呼腸孤病毒II型:
上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ ；
下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ ； 熒光探針:
GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ ； 草魚(yú)呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM，草魚(yú)呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQl。`
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液的組成如下: GCRV-1 -F (100 μ Μ)5μ L GCRV-1 -R (100 μ Μ)5 μ L GCRV-1 -P (100 μ Μ)4μ L GCRV-11-F (100 μ Μ)6 μ L GCRV-11-R (100 μ Μ)6 μ L GCRV-11-P (100 μ Μ)5 μ L 無(wú)RNA酶去離子水169 μ L Total200 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述酶混合液包括逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述陽(yáng)性質(zhì)控品為滅活的草魚(yú)呼腸孤病毒I型GCRV09-01株和II型GCRV-HZ08株的培養(yǎng)液。
5.一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)提取待測(cè)樣品中的病毒RNA； 2)以提取的RNA為模板，使用草魚(yú)呼腸孤病毒I型的 上游引物:GCRV-1 -F:5’ -CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’ ；
下游引物:GCRV-1 -R:5’ -CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ ； 熒光探針:GCRV-1 -P:5’ -FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3’ 和草魚(yú)呼腸孤病毒II型的上游引物:GCRV-11-F:5’ -TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’ ； 下游引物:GCRV-11-R:5’ -GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’ ； 熒光探針:GCRV-11-P:5’ -CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ 進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)，其中，草魚(yú)呼腸孤病毒I型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為FAM，草魚(yú)呼腸孤病毒II型的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQl ； 3)結(jié)果分析:反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)待測(cè)樣品的熒光Ct值判斷待測(cè)樣品是否為草魚(yú)呼腸孤病毒I型、草魚(yú)呼腸孤病毒II型陽(yáng)性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于:所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系包括病毒RNA模板、雙重?zé)晒舛糠磻?yīng)液、酶混合液、RT-PCR反應(yīng)液和無(wú)RNA酶去離子水。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種草魚(yú)呼腸孤病毒I型和II型的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于:所述雙重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)條件為42°C 30min, 94~96°C 3~8min，然后經(jīng)94~96°C 7~IOs和58 ~62°C 32~38s采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103484568SQ201310430466
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】曾偉偉, 王慶, 吳淑勤, 王英英, 劉春 , 梁紅茹, 石存斌, 李瑩瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所