一種運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因方法。不進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，將沾有外源基因的根癌農(nóng)桿菌菌液的接種針直接侵染受體水稻種子的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)，完成轉(zhuǎn)基因操作。分別選用含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBI121-GUS的農(nóng)桿菌和pCDMARUBA-Hyg的農(nóng)桿菌為轉(zhuǎn)化載體菌株，以粳稻南粳45與南粳47和秈稻9311為轉(zhuǎn)基因受體水稻品種驗(yàn)證了本發(fā)明。本方法與傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不同的是，本方法不需誘導(dǎo)愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，節(jié)省了大量的人力和財(cái)力，且時(shí)間比較短；克服了在其它方法中秈稻品種難以轉(zhuǎn)化的問題；轉(zhuǎn)化載體可不必插入標(biāo)記基因，具有簡(jiǎn)單、快速、高效、通用、安全的優(yōu)點(diǎn)，是一種改良的水稻轉(zhuǎn)基因新技術(shù)。
【專利說明】一種運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的簡(jiǎn)單、快速、高效的水稻轉(zhuǎn)化方法的建立，屬于水稻遺傳改良與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人口、資源、環(huán)境一直是人類生存與發(fā)展所面臨的主要問題。近年來，由于人口增長(zhǎng)、氣候變化等因素，出現(xiàn)了全球性的糧食短缺，主要農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格快速上漲，在世界范圍內(nèi)造成了糧食危機(jī)與恐慌。而水稻作為世界上最重要的糧食作物之一，進(jìn)一步提高水稻產(chǎn)量具有極其重要的意義。但是，可利用的耕地和淡水資源逐年減少，大量使用農(nóng)藥、化肥導(dǎo)致環(huán)境嚴(yán)重污染同時(shí)增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本和農(nóng)民負(fù)擔(dān)，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)遭受嚴(yán)重破壞，因此，確保糧食安全的根本途徑在于提高作物單產(chǎn)。依靠慣有方法很難培育出在產(chǎn)量潛力上有大突破的新品種。近二十幾年來，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)作物不斷傳出佳訊。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種可持續(xù)發(fā)展的方式，可提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，具有良好的發(fā)展?jié)摿颓熬?，將為世界農(nóng)業(yè)發(fā)展注入新的動(dòng)力[1]。
[0003]目前，在水稻育種上相繼開發(fā)研究的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有以農(nóng)桿菌為主導(dǎo)的載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)；以基因槍、PEG等介導(dǎo)的基因直接導(dǎo)入技術(shù)和以花粉管通道轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡吸收為主的種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，尤以農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)、基因槍導(dǎo)入技術(shù)和花粉管通道技術(shù)的研究報(bào)道最多，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)占64%[2]。
[0004]以載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，即利用另一種生物來實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)入和整合，主要的方法就是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒具有一段T-DNA，可通過農(nóng)桿菌侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞，并插入到植物基因組中。通過將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染，可實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株[3]。自`從1978年Chilton等M第一次利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒為載體將T-DNA上的胭脂堿基因轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞以來，根癌農(nóng)桿菌在雙子葉植物轉(zhuǎn)化中得到了廣泛應(yīng)用。1986年，Baba等[5]通過PEG法將農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體融合，獲得了能夠合成胭脂堿的水稻轉(zhuǎn)化組織。之后，科學(xué)界開始對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化進(jìn)行了廣泛的研究，試圖通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高水稻產(chǎn)量、改良品質(zhì)和增強(qiáng)抗性[6_8]。但是，由于國內(nèi)外各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所使用的基因型、外植體的不同和培養(yǎng)環(huán)境條件的差異，造成了各個(gè)轉(zhuǎn)化體系中的結(jié)果不盡相同，轉(zhuǎn)化率也普遍不高。所以，近二十幾年來，不同研究人員分別從Ti質(zhì)粒的改造、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建和組織培養(yǎng)方面入手，不斷優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法，以期提高轉(zhuǎn)化效率。一是選擇最適農(nóng)桿菌及優(yōu)化載體。由于不同基因型水稻接受農(nóng)桿菌菌株的親和性不同，所以選取合適的農(nóng)桿菌菌株和優(yōu)良的質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)化來說非常重要。用于水稻轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株較為普遍的有A281、A656、LBA4404、EHAlOl、EHA105、AGLl。李雙成等[9]以3個(gè)秈稻品種和2個(gè)粳稻品種為對(duì)象，對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻過程中影響轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株AGLl和EHA105按一定比例混合共轉(zhuǎn)化，對(duì)抗性愈傷率有顯著影響?，F(xiàn)在水稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)應(yīng)用最多的是EHA105菌株。[0005]對(duì)天然Ti質(zhì)粒的改造，最初只有共整合載體到現(xiàn)在的共整合載體、雙T-DNA載體、雙元載體、超級(jí)雙元載體都可利用；在轉(zhuǎn)化頻率不斷提高的同時(shí)，在去選擇標(biāo)記上也不斷取得進(jìn)步。1996年，Komari等[1°]構(gòu)建了所謂的“超級(jí)雙元載體”，以該載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌株，陽性菌液侵染水稻愈傷組織，共轉(zhuǎn)化率可達(dá)47%，轉(zhuǎn)化植株自交后代中，約65%的植株只含報(bào)告基因而不含標(biāo)記基因。2004年，殷麗青等[11]運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙T-DNA法培育含反義蠟質(zhì)基因的無選擇標(biāo)記水稻，獲得了 55.4%的共轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化植株自交后代有29.2%的植株中只含有目的基因而不含選擇標(biāo)記基因。夏志輝[12]利用DRB雙元載體培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻。2005年，朱禎、李旭剛發(fā)明了一種利用雙T 一 DNA載體培育無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的方法，單子葉植物表達(dá)載體中含兩個(gè)獨(dú)立T - DNA結(jié)構(gòu)域且?guī)AR(matrix attachment region)序列,提高了獲得穩(wěn)定的無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻的比率，并將該體系申請(qǐng)了專利[13]。2007年，朱麗等M嘗試?yán)霉厕D(zhuǎn)化和花藥培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，快速獲得了純合的無選擇標(biāo)記的三價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻。這種方法僅需要一代即可獲得純合的目的植株，大大加快了研究進(jìn)程。[0006]二是優(yōu)化組織培養(yǎng)因素。1996年，Rashid等[15]利用Hiei等[16]的轉(zhuǎn)化體系得到了較多的轉(zhuǎn)基因水稻植株。Aldemita等[17]報(bào)道，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化秈稻品種IR72和TCS10，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率為1%-5%。1999年，Khanna等[18]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，來源于根尖、芽尖、幼苗以及成熟胚盾片的愈傷組織都表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化頻率。2001年，陳秀花等[19]以GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)為依據(jù)，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的影響因素，指出預(yù)培養(yǎng)4-5天的幼胚是較為理想的轉(zhuǎn)化受體材料；在共培養(yǎng)基中添加較高濃度的乙酰丁香酮可提高GUS基因的瞬間表達(dá)頻率，按此條件進(jìn)行雙菌共轉(zhuǎn)化，抗性愈傷組織的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)70%。2004年，夏志輝[12]利用DRB雙元載體培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻，并對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響因素做了研究，(I)確定了轉(zhuǎn)化過程中的最佳侵染濃度為0D600=0.2 ； (2)MS培養(yǎng)基比CC培養(yǎng)基更適合水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)，但CC培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更適合成熟胚愈傷組織的繼代培養(yǎng)；(3)水稻尤其是秈稻在分化過程中對(duì)潮霉素(Hyg)最為敏感，在分化培養(yǎng)基中添加20mg/L Hyg就足以將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開。在壯苗生根培養(yǎng)階段，需要15mg/L的Hyg ； (4)出愈率與甘露醇的濃度密切相關(guān)，出愈率隨著甘露醇的減少而增加。2005年，PutuSupartana等[2°]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接侵染粳稻品種越光的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)40%。2010年，Kenjirou Ozawa等[21]發(fā)現(xiàn)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，在共培養(yǎng)過程中，用N6液體培養(yǎng)基比用N6固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率提高了 10倍。2011年，李笑寒等_通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，建立了一個(gè)高效的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。他們的研究結(jié)果表明，相比較于暗培養(yǎng)，光照培養(yǎng)進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)可以使誘導(dǎo)天數(shù)縮短4-5d;誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入適量的激素可以使秈稻愈傷誘導(dǎo)提高25%-30% ;分化培養(yǎng)基中加入適量的氨基酸和甘露醇可以使植株再生頻率提高15%_20%。AlagarsamyKarthikeyan等[23]利用農(nóng)桿菌侵染秈稻ADT43葉片來源的愈傷獲得轉(zhuǎn)基因植株，將秈稻的轉(zhuǎn)化率提高到9.33%，且在Ttl與T1代植株中，目的基因拷貝數(shù)為I或2。2012年，牟晨等[24]通過對(duì)經(jīng)典水稻轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)化和改進(jìn)，使用成熟胚，采取升汞滅菌，侵染時(shí)農(nóng)桿菌的0D_值為0.1時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較原方法提聞約23%。
[0007]綜上所述，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)過近二十幾年的發(fā)展和優(yōu)化，轉(zhuǎn)化條件、轉(zhuǎn)化效率等都得到了長(zhǎng)足的改進(jìn)和提高，但與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)形勢(shì)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的需求相比，其步伐仍然不夠快，仍存在許多障礙和安全隱患，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)的研發(fā)，突破核心技術(shù)，以培育滿足人們需求的轉(zhuǎn)基因水稻新品種。
[0008]利用植物生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化的原理可能是外源DNA通過細(xì)胞間隙進(jìn)入莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞部位，并轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。近年來，有一些關(guān)于植物生長(zhǎng)點(diǎn)用于轉(zhuǎn)化的報(bào)道，特別是在小麥、玉米上。1996年，杜立群等[25]用小麥的生長(zhǎng)點(diǎn)作為外源基因的直接受體，利用基因槍轟擊小麥生長(zhǎng)點(diǎn)獲得轉(zhuǎn)基因小麥。2005年，RAZZAQ Abdul等[26]以小麥為材料，嘗試了一種對(duì)生長(zhǎng)點(diǎn)直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法，并初步證明了這一方法的可行性。2009年，董福雙等[27]以小麥品種石4185為對(duì)象，建立了“用解剖刀去除種子根、用鑷子把芽鞘掰去、用鑷尖掃去包蓋生長(zhǎng)點(diǎn)的未展開葉、將帶生長(zhǎng)點(diǎn)的部分與胚乳分離”為特點(diǎn)的受體制備方法，初步建立了基因槍法轉(zhuǎn)化小麥種子芽生長(zhǎng)點(diǎn)的技術(shù)，但到目前為止還未見利用該技術(shù)在水稻轉(zhuǎn)基因操作相關(guān)的報(bào)道。2011年，孫傳波等[28]以玉米自交系鄭58的莖尖為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗草甘膦EPSPS基因轉(zhuǎn)入玉米中，初步證明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，以玉米莖尖作為受體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用于基因轉(zhuǎn)化是可行、高效的。在水稻上，2001年，林擁軍利用農(nóng)桿菌浸種法將反義Wx基因?qū)胨酒贩N珍汕978[29]。2005年，PutuSupartana等[2°]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接侵染粳稻品種越光胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)獲得轉(zhuǎn)基因植株。但是，該文獻(xiàn)沒有提及在秈稻品種上成功轉(zhuǎn)化，不但所用的質(zhì)粒載體偏小，而且只包含了 I個(gè)外源基因。本技術(shù)方案不但在秈稻上獲得成功轉(zhuǎn)化，而且還成功將2個(gè)抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入水稻中。
[0009]本技術(shù)建立了一套利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，直接以水稻胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)為轉(zhuǎn)化受體而不需誘導(dǎo)愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，避免對(duì)組織培養(yǎng)的過分依賴的高效、簡(jiǎn)單、快速的水稻轉(zhuǎn)化體系；克服了在其它方法中基因型為秈稻品種難以轉(zhuǎn)化的問題；可以不需在質(zhì)粒載體上插入選擇標(biāo)記基因，直接對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行目的基因的檢測(cè)，減輕人們對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全性的擔(dān)憂，為轉(zhuǎn)化水稻提供一種簡(jiǎn)單、快速、高效、安全的方法，從而為滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)形勢(shì)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的需求增添一份力量。
[0010]主要參考文獻(xiàn):
[0011]I)楊長(zhǎng)青，王凌健，毛`穎波，等.植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)[J].科學(xué)，2011，63(3): 21 -24.[0012]2) James C.2009年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2010，30(2):1 - 22.[0013]3)萬建民.我國轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)形勢(shì)及發(fā)展戰(zhàn)略[J].生命科學(xué)，2011，23⑵:157 -167.[0014]4)Chilton M D, Saikir K.Highly conserved DNA of Ti plasmids overlapsT - DNA maintained plant tumours[J].Nature, 1978, 275:147 - 149.[0015]5) Baba A, Hasezawa S, Syono K.Cultivation of rice protoplasts andtheir transformation mediated by Agrobacterium protoplasts[J].Plant CellPhysio, 1986，27:463 - 468.[0016]6)鄭騰，陸承平.轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)糧食生產(chǎn)的影響[J].生物學(xué)通報(bào)，2004，39⑴:6 -9.[0017]7)寧約瑟，劉雄倫.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展及展望[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23(3):47 - 51.[0018]8)李衛(wèi)，郭光沁，鄭鎦.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化研究的若干新進(jìn)展[J].科學(xué)通報(bào)，2000，45(8):798 - 807.[0019]9)李雙成，王世全，尹福強(qiáng)，等.提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻效率的因素[J].中國水稻科學(xué)，2005，19(3):231 - 237.[0020]10)Komari Tj Hiei Y，Satito Y，et al.Vectors carrying two separateT - DNAs for cotransformation of higher plants mediated by Agrobacteriumtumefiens and segregation of transformants free from selection markers[J].PlantJj 1996，10(1):165 - 174.[0021]11)殷麗青，王新其，沈革志.去除標(biāo)記基因的水稻轉(zhuǎn)基因研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，20(1):33 - 36.[0022]12)夏志輝.利用雙右邊界(DRB)雙元載體系統(tǒng)獲得無標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因水稻的研究[D].海南:華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.[0023]13)朱禎，李旭剛.一種利用雙T - DNA載體培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻的方法[P].中國專利:02107429, 200508 - 10.[0024]14)朱麗，傅亞萍，劉文真.利用共轉(zhuǎn)化和花藥培養(yǎng)技術(shù)快速獲得無選擇標(biāo)記的三價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻[J].中國水稻科學(xué)，2007，21 (5):475 - 481.[0025]15)Rashid H, YokoiSj ToriyamaKj et al.Transgenic plant productionmediated by Agrobacterium in Indica rice [J].Plant Cell Repj 1996, 15:727 - 730.[0026]16) Hiei Y，OhtaS，Toshi lhroK，et al.Efficient transformation ofrice (OryzasativaL.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T - DNA[J].Plant J，1994, 6:271 - 282.[0027]17)Aldemita R R，Hodges T K.Agrobacterium tumefaciens - mediatedtransformation of Japonica and Indica rice varieties[J].Plantaj 1996，199:612 - 617.[0028]18)Khanna H K，Raina S K.Agrobacterium - mediated transformationof Indica rice cultivars using binary and superbinary vectors[J].PlantPhysio,1999，26:311 - 324.[0029]19)陳秀花，劉巧泉，王宗陽，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化秈稻影響因素的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)研究，2001，22 (I): 1- 6.[0030]20) Putu S，Tsutomu s, Hidenari S，et al.Development of simple andefficient in plantatransformationmethod for rice (Oryza sativa L.) usingAgrobacterium tumefaciens[J].Bioscience and Bioengineering, 2005，100(4):391 - 397.[0031]21) Ken j irou 0，F(xiàn)umio T.Highly eff icientAgrobacterium - mediatedtransformation ofsuspension - culturedceIlclustersofrice(Oryza sativa L) [J].Plant Science,2010， 179:333 - 337.[0032]22)李笑寒，李莉，宋風(fēng)順，倪大虎，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)體`系的優(yōu)化[J].生物學(xué)雜志，2011，28(2): 13 - 16.[0033]23)Alagarsamy K，Shunmugiah K P，Manikandan R.Agrobacterium - mediatedtransformation of leaf base derived callus tissues ofpopularindica rice (Oryzasativa Lsub sp.1ndica cv.ADT43) [J].Plant Science，2011，181:258 - 268.[0034]24)牟晨，金菁，石金磊.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40 (7): 3867 - 3880.[0035]25)杜立群，李銀心，麻密，等.小麥生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化法初報(bào)[J].植物學(xué)報(bào)，1996，38(11):921 - 924.[0036]26) RazzaqAbdul,張艷敏，楊帆，等.小麥莖生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化研究初報(bào)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20(1):17 - 22.[0037]27)董福雙，張艷敏，楊帆，等.小麥芽生長(zhǎng)點(diǎn)的基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24(5): 1- 6.[0038]28)孫傳波，李海華，郭嘉，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法向玉米莖尖導(dǎo)入抗草甘膦EPSPS基因的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011，3:91 -93.[0039]29)林擁軍.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0040]本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法過度依賴一系列的組織培養(yǎng)過程，而組織培養(yǎng)篩選周期較長(zhǎng)，耗時(shí)耗費(fèi)，對(duì)受體愈傷狀態(tài)要求高，基因型依賴強(qiáng)的技術(shù)難題，以水稻胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)為轉(zhuǎn)化受體，建立了優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化法，規(guī)避了傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)組織培養(yǎng)的過度依賴性，是本發(fā)明的宗旨。
[0041]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法，不進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，而是將沾有外源基因的根癌農(nóng)桿菌菌液的接種針直接侵染受體水稻種子的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)，完成轉(zhuǎn)基因操作。
[0042]本發(fā)明方法中所述受體水稻種子的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)是切除種根和幼芽后的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)，或者是未去殼萌發(fā)后的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)。
[0043]本發(fā)明的方法既適用于粳稻品種也適用于秈稻品種。
[0044]本發(fā)明方法所述受體水稻種子可選自用成熟水稻種子浸泡24-36h后的材料。
[0045]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，其主要步驟包括:
[0046]I)選用南粳45(粳稻)和9311 (秈稻)的成熟胚作為轉(zhuǎn)基因受體。
[0047]2)選用的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體pBI121-GUS含gus基因；質(zhì)粒載體pCDMARUBA_Hyg含sbk、sck和hpt基因。
[0048]3)將未去殼的水稻種子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞殺菌18min，無菌水沖洗3-4次，消毒后的種子浸放在無菌水中，置于26-28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I-3d。
[0049]4)用沾有擴(kuò)大培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌液的接種針直接侵染已經(jīng)處理過水稻種子的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)(或者已切除種根和幼芽的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn))，然后將侵染后的水稻種子放入植物培養(yǎng)瓶中(植物培養(yǎng)瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上鋪有一張濕潤(rùn)的濾紙)；22-24°C暗培養(yǎng)9-14d。
[0050]5)將暗培養(yǎng)后苗長(zhǎng)為IOcm左右的轉(zhuǎn)化苗浸泡在濃度為lmg/mL的頭孢霉素溶液中l(wèi)h，之后將苗移到網(wǎng)室中種在盆缽中，盆缽直徑30cm，5棵/盆[0051]6)在水稻長(zhǎng)至7、8葉期，對(duì)轉(zhuǎn)pBI121-GUS載體的植株取葉片進(jìn)行DNA檢測(cè)和⑶S組織化學(xué)檢測(cè)，對(duì)轉(zhuǎn)pCDMARUBA-Hyg載體的植株取葉片進(jìn)行外源基因DNA檢測(cè)和抗蟲試紙條檢測(cè)。[0052]本發(fā)明的水稻轉(zhuǎn)化方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0053]I)本發(fā)明方法不需誘導(dǎo)愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，即不須配制各種培養(yǎng)基、控制各種培養(yǎng)條件并對(duì)其不斷進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，利用傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期至少為2-4個(gè)月，而應(yīng)用本方法只需10-15d，由此可見，本發(fā)明技術(shù)在大大縮短培養(yǎng)周期的同時(shí)節(jié)省了大量的財(cái)力物力，極大的簡(jiǎn)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的流程，提高了轉(zhuǎn)化的工作效率。
[0054]2)本發(fā)明方法克服了在其它方法中基因型為秈稻品種難以轉(zhuǎn)化的問題，不僅將基因成功的導(dǎo)入粳稻品種南粳45中，而且也成功導(dǎo)入秈稻品種9311中。
[0055]3)本發(fā)明方法所用的轉(zhuǎn)化載體可以不須插入標(biāo)記基因或報(bào)告基因，轉(zhuǎn)化載體只需攜帶目的基因和基本構(gòu)件，在進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化后待轉(zhuǎn)化植株成苗，直接對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行目的基因的檢測(cè)，提高了轉(zhuǎn)基因水稻的安全性，減輕了人們對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全性的擔(dān)憂。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1質(zhì)粒PBI121-GUS結(jié)構(gòu)示意圖。
[0057]圖2質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg結(jié)構(gòu)不意圖。
[0058]圖3轉(zhuǎn)gus基因Ttl代植株的PCR檢測(cè)(M:DL2000DNA Marker ；ck:未轉(zhuǎn)化植株DNA ；
[0059]P:陽性質(zhì)粒DNA ；1-26:轉(zhuǎn)gus基因植株)。
[0060]圖4?；轉(zhuǎn)化植株的抗蟲基因sbk檢測(cè)(注:CK:未轉(zhuǎn)化植株；P:陽性質(zhì)粒DNA;M:DL2000Marker ；9:9311 ；45:南粳 45 ；83:南粳 47)
[0061]圖5部分轉(zhuǎn)基因Ttl代`植株gus基因的組織化學(xué)檢測(cè)(ck-:未轉(zhuǎn)化植株葉片)。
[0062]圖6部分轉(zhuǎn)基因T1代植株群體的PCR檢測(cè)(注:ck:未轉(zhuǎn)化植株DNA ；P:陽性質(zhì)粒DNA ；
[0063]M:DL2000Marker ;其余為轉(zhuǎn)基因T1代植株)。
[0064]圖7部分轉(zhuǎn)基因T1代植株gus基因的組織化學(xué)檢測(cè)(注:ck:未轉(zhuǎn)化植株)
[0065]圖STci轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)(注:CK:未轉(zhuǎn)化植株;P:陽性質(zhì)粒DNA ；M:DL2000Marker ；41-49:南粳 45)。
【具體實(shí)施方式】
[0066]質(zhì)粒載體pBI121-GUS (Plant Cell R印orts, 2009，28 (9): 1319-1327)攜帶有PBI121-GUS質(zhì)粒的EHA105菌株，南京曉莊學(xué)院蔡小寧教授實(shí)驗(yàn)室提供；
[0067]質(zhì)粒載體pCDMARUBA-Hyg (ZL02107429.1,朱禎李旭剛，一種利用雙T-DNA載體培育無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的方法)引自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所朱禎研究員項(xiàng)目組。
[0068]實(shí)施例1—胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)直接侵染法
[0069]1.選用水稻(Oryza sativa L.)品種南粳45 (粳稻)、南粳47 (粳稻)和9311 (秈稻)成熟種子作為轉(zhuǎn)基因受體，其種子均已商品化，來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所。
[0070]2.將未去殼的水稻種子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞殺菌18min，無菌水沖洗3-4次，消毒后的種子浸放在無菌水中，置于26-28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I-3d。[0071]3.植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與檢測(cè)
[0072]I)植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0073]A.分別取農(nóng)桿菌LBA4404菌液(帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBI121_⑶S，質(zhì)粒pBI121_GUS結(jié)構(gòu)如圖1)和農(nóng)桿菌EHA105菌液(帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg，質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg結(jié)構(gòu)如圖2)200 μ L于1.5ml離心管中，用接種環(huán)進(jìn)行平板劃線(培養(yǎng)皿中含卡那霉素，50ug/mL;利福平，50ug/mL)，28°C倒置培養(yǎng)48h，挑選單菌落接種于IOml的LB液體培養(yǎng)基中(含50mg
? L—1利福平和50mg.I/1卡那霉素)，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h。
[0074]B.取培養(yǎng)好的檢測(cè)有陽性質(zhì)粒的上述兩種菌液各1ml，分別放至IOOml液體LB培養(yǎng)基(含IOOuM乙酰丁香酮)中擴(kuò)大培養(yǎng)，28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6c?值為0.4。為了便于觀察和使菌狀態(tài)良好，擴(kuò)大培養(yǎng)液里不加抗生素。
[0075]2)植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌陰陽性的檢測(cè)
[0076]A.質(zhì)粒DNA的提 取
[0077]用BIOMIGA EZgene公司生產(chǎn)的Plasmid Miniprep Kit試劑盒對(duì)上述兩種質(zhì)粒DNA進(jìn)行微量提取，步驟如下:
[0078]①取I-4mL ( —般2mL)在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，室溫下10，OOOrpm離心lmin，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
[0079]②加入250 μ L已加入RNaseA的Bufffer Al，用渦流震蕩器震蕩重懸細(xì)菌沉淀，懸浮需充分，不應(yīng)留有小菌塊。
[0080]③加入250 μ L Bufffer BI，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合10次，然后靜置5min至
溶液粘稠而澄清。
[0081]④加入350 μ LBufffer NI，立即反轉(zhuǎn)多次，至溶液充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
[0082]⑤將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機(jī),在室溫下13000rpm離心lOmin。
[0083]⑥小心吸取離心后的上清液至帶有收集管的DNA柱中，室溫下13000rpm離心Imin，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
[0084]⑦向DNA柱中加入500 μ L Buffer KB,室溫下13000rpm離心lmin,倒掉收集管中
的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
[0085]⑧向離心柱中加500 μ L DNA Wash Buffer (確保已加入無水乙醇！)，室溫下13，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)該步驟I次。
[0086]⑨將離心柱放回高速離心機(jī)中開蓋，室溫下13000rpm離心2min，以徹底去除殘留的乙醇。
[0087]⑩將離心柱移入新的1.5mL離心管中，向DNA柱正中央加入50-100 μ L的ddH20或Elution Buffer,室溫靜置2min, 13000rpm離心lmin,洗脫質(zhì)粒DNA。將洗脫液再加入柱中，13000rpm離心lmin,收集洗脫液。
[0088]B.質(zhì)粒DNA檢測(cè)
[0089]①質(zhì)粒pBI121-GUS基因擴(kuò)增
[0090]目的基因gus。
[0091]PCR 擴(kuò)增體系:PCR buffer2.0yL, dNTP2.0μ L，引物 2.0 μ L (表 1)，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，DNA2.0 μ L，補(bǔ)充 ddH20 M 20 μ L0
[0092]PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C，5min ；94 °C, 30sec, 57 °C, 30sec, 72 °C，30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin0擴(kuò)增結(jié)果加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行110v、lh電泳后照相。
[0093]選取PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0094]②質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg基因擴(kuò)增
[0095]目的基因sbk、sck和標(biāo)記基因hpt的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序均一致。
[0096]PCR 擴(kuò)增體系:PCR buffer2.0 μ L，dNTP2.0 μ L，引物 2.0 μ L (表 1)，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，DNA2.0 μ L，補(bǔ)充 ddH20 M 20 μ L0
[0097]PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C,5min ；94°C, 30sec, 56 °C, 30sec, 72 °C, 30sec, 35 個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin。擴(kuò)增結(jié)果加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳110v，Ih后照相。
[0098]選取PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0099]4.轉(zhuǎn)基因受體水稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化
[0100]以下操作均要求在無菌條件下進(jìn)行。
[0101]用沾有擴(kuò)大培養(yǎng)后的0D_值為0.4擴(kuò)大培養(yǎng)的農(nóng)桿菌液的接種針刺入胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)；將針刺后的種子放入植物培養(yǎng)瓶中(植物培養(yǎng)瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上鋪有一張濕潤(rùn)的濾紙)，10粒/瓶，22-24°C暗培養(yǎng)9-14d。
[0102]用含質(zhì)粒pBI121-GU`S的農(nóng)桿菌按照上述方法侵染90粒南粳45水稻種子；用含質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg的農(nóng)桿菌按照上述方法侵染98粒9311、100粒南粳45和100粒南粳47水稻種子。
[0103]5.水稻轉(zhuǎn)化苗的殺菌與移苗
[0104]將暗培養(yǎng)后苗長(zhǎng)為IOcm左右的轉(zhuǎn)化苗浸泡在lmg/ml的頭孢霉素溶液中Ih,之后將苗移到網(wǎng)室中種在盆缽中，盆缽半徑15cm，5棵/盆。
[0105]6.轉(zhuǎn)基因苗的PCR檢測(cè)
[0106]待處理后的苗長(zhǎng)至7、8葉，株高40cm以上，每株取200mg左右嫩葉(以未針刺水稻苗為陰性對(duì)照)進(jìn)行DNA檢測(cè)。
[0107]用SDS法從水稻(轉(zhuǎn)基因Ttl代與非轉(zhuǎn)基因)新鮮葉片中微量提取總DNA。
[0108](I)取約200mg新鮮的水稻葉片用液氮速凍后研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至2mL離心管中；
[0109](2)加入 650 μ L 經(jīng) 65°C預(yù)熱的 SDS 抽提緩沖液(0.1M Tris-HCl, ρΗ8.0 ；0.05ΜEDTA, ρΗ8.0 ；0.5Μ NaCl ；1.25%SDS)，65°C水浴 30min，每隔 IOmin 搖動(dòng)混勻；
[0110](3)加入 150μ L5M KAc (ρΗ5.2)搖勻，冰浴 30min ；
[0111](4)加入350 μ L24:1的氯仿異戊醇混合液，搖動(dòng)混勻，靜置3min ；
[0112](5) 12，OOOrpm離心lOmin，小心轉(zhuǎn)移上清于一潔凈的1.5mL離心管中；
[0113](6)加入800μ L-20°C預(yù)冷的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，在_20°C冰箱自由沉降20min ；
[0114](7) IOOOOrpm離心6min,棄上清收集沉淀；
[0115](8)加入400 μ L75%的乙醇洗滌沉淀；
[0116](9)倒掉乙醇，超凈臺(tái)上吹干沉淀后加入200μ LlXTE(pH8.0)溶解，_4°C保存?zhèn)溆谩0117]非轉(zhuǎn)基因單株設(shè)為陰性對(duì)照，上述質(zhì)粒DNA檢測(cè)為陽性的質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照。以水稻基因組DNA為模板，轉(zhuǎn)質(zhì)粒pBI121-GUS的水稻植株以GUS基因的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析；轉(zhuǎn)質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg的水稻植株分別以SBK、SCK、HPT基因的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析(表I)。
[0118]表I基因位點(diǎn)或連鎖標(biāo)記的引物序列
[0119]
【權(quán)利要求】
1.一種運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法，其特征在于該方法不進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，將沾有外源基因的根癌農(nóng)桿菌菌液的接種針直接侵染受體水稻種子的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)，完成轉(zhuǎn)基因操作。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述受體水稻種子的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)是切除種根和幼芽后的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)，或者是未去殼萌發(fā)后的胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的水稻是梗稻品種或軸稻品種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述受體水稻種子是用成 熟水稻種子浸泡24-36h后的材料。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103451230SQ201310434861
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】張啟軍, 顏文飛, 呂川根, 劉少奎, 賴東, 張斌, 秦海龍, 廖慧敏, 宗壽余, 夏士鍵, 虞德容 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院