一種檢測(cè)cyp3a5基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的試劑盒及方法，屬于熒光定量PCR領(lǐng)域。所述試劑盒包括檢測(cè)用引物以及檢測(cè)用熒光探針，所述檢測(cè)用引物和檢測(cè)用熒光探針包括：CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性上下游引物及Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP2C19*4多態(tài)性的特異性上下游引物及Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP2C19*6多態(tài)性的特異性上下游引物及Taqman熒光探針、和CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性上下游引物及Taqman熒光探針中的至少一組。所述試劑盒檢測(cè)敏感度及特異性均顯著提高，檢測(cè)時(shí)間短，有利于預(yù)測(cè)藥物劑量及療效。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光定量PCR領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]CYP3A5基因位于人類第7號(hào)染色體，全長(zhǎng)31.8kb，有13個(gè)外顯子，編碼502個(gè)氨基酸。它是CYP3A亞家族主要的肝外表達(dá)形式，在肺、腎、乳腺、前列腺以及多形核白細(xì)胞中顯現(xiàn)出比CYP3A4基因更高的表達(dá)水平，卻與CYP3A4基因擁有相似的編碼氨基酸序列、相似的作用底物及相同的調(diào)控途徑。CYP3A5野生型定義為CYP3A5*1，攜帶至少一個(gè)CYP3A5*1等位基因的個(gè)體才可正常表達(dá)CYP3A5蛋白，CYP3A5基因多態(tài)性具體詳見(jiàn)CYP等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cypalleles.k1.se)。CYP3A5 的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms, SNPs)最早于1996年由Jounaidi等發(fā)現(xiàn)。隨后更多SNP位點(diǎn)被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，這些位點(diǎn)包括:位于編碼區(qū)，特別是位于第7和11號(hào)外顯子上的位點(diǎn)CYP3A5*2、*4、*6、*7、*8、*9和*10以及位于非編碼區(qū)的位點(diǎn)，如CYP3A5*3和*5等。其中，CYP3A5*3是導(dǎo)致個(gè)體間CYP3A5蛋白差異表達(dá)的主要原因而成為研究的焦點(diǎn)。Busi等研究發(fā)，突變型CYP3A5*3等位基因的6986位點(diǎn)存在A > G 的變化，從而在第3內(nèi)含子中創(chuàng)造了一個(gè)隱含的受體剪接位點(diǎn)。該位點(diǎn)促使基因內(nèi)類外顯子序列(假外顯子)插入成熟mRNA并包括隨后外顯子的缺失和/或其他基因內(nèi)序列的插入。這些異常的剪接導(dǎo)致若干框內(nèi)提前終止密碼子的出現(xiàn)。突變型CYP3A5的mRNA比野生型降解更迅速、更不穩(wěn)定，這種機(jī)制稱為無(wú)義密碼子介導(dǎo)的mRNA 降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD),促使含 PTC (premature translationtermination condon,翻譯提前終止密碼子)的mRNA降解,是機(jī)體細(xì)胞的一種保護(hù)性措施。因此，突變純合型攜帶者的總mRNA水平比另兩種攜帶者顯著減少，最終導(dǎo)致CYP3A5蛋白的不表達(dá)，使CYP3A5酶活性明顯降低甚至消失。CYP3A5*3等位基因在各種族中的發(fā)生頻率均為最高，頻率差異也很大。黑種人和白種人中發(fā)生頻率分別為27%?50%和85%?95%。西班牙人、南亞人、韓國(guó)人、亞洲美國(guó)人、高加索人中的發(fā)生頻率分別為62%?83%、59%?61%、70%,55%和90%。Liu等對(duì)1382名漢族健康人的CYP3A5*3基因型進(jìn)行分析，結(jié)果中國(guó)漢族人群的野生、雜合和純合突變基因型頻率分別為8.4%, 34.3%和57.3%。CYP3A5的表達(dá)亦呈高度多態(tài)性，不同種族人群中CYP3A5酶活性可相差10?40倍。Kueh等認(rèn)為，基因突變是CYP3A5表達(dá)的主要調(diào)控方式，也是導(dǎo)致CYP3A的藥物清除及用藥過(guò)程中出現(xiàn)個(gè)人、種族間差異最重要的原因?；蛲蛔兛梢鹈傅幕钚院蛿?shù)量的變異，表現(xiàn)為代謝相應(yīng)底物的能力和速率減慢或減弱。因此，導(dǎo)致個(gè)體反應(yīng)性差異最重要的因素是CYP3A5，而不是CYP3A4。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，一般采用直接測(cè)序或定性PCR技術(shù)檢測(cè)CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性、CYP3A5*4 多態(tài)性、CYP3A5*6 和 CYP3A5*7 多態(tài)性。
[0004]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，采用直接測(cè)序或定性PCR技術(shù)檢測(cè)CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性、CYP3A5*4多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7多態(tài)性，其檢測(cè)的靈敏度和特異性均不高，且耗時(shí)耗力，所以，不能準(zhǔn)確的檢測(cè)出CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性、CYP3A5*4多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7多態(tài)性，不利于預(yù)測(cè)藥物療效及指導(dǎo)藥物的選擇性用藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)CYP3A5 基因 CYP3A5*3、CYP3A5*4、CYP3A5*6 和 CYP3A5*7多態(tài)性的靈敏度和特異性均不高、而且耗時(shí)耗力等問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的試劑盒。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的方法。
[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性、CYP3A5*4多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7多態(tài)性多態(tài)性的靈敏度和特異性均不高且耗時(shí)耗力等問(wèn)題，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0008]一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的試劑盒，包括檢測(cè)用引物以及檢測(cè)用熒光探針，所述檢測(cè)用引物和檢測(cè)用熒光探針包括:CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、和CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針中的至少一組，其中:
[0009]所述CYP3A5基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:1所示；
[0010]所述CYP3A5基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDN0:2所示；
[0011]所述CYP3A5 基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
[0012]所述CYP3A5基因CYP2C19*4多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所示；
[0013]所述CYP3A5基因CYP2C19*4多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDN0:5所示；
[0014]所述CYP3A5基因CYP2C19*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；
[0015]所述CYP3A5基因CYP2C19*6多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:7所示；
[0016]所述CYP3A5基因CYP2C19*6多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:8所示；
[0017]所述CYP3A5基因CYP2C19*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；
[0018]所述CYP3A5基因CYP2C19*7多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO: 10所示；
[0019]所述CYP3A5基因CYP2C19*7多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO: 11所示；[0020]所述CYP3A5基因CYP2C19*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示。
[0021]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括內(nèi)參基因GPADH、所述內(nèi)參基因GAPDH的上下游引物及所述內(nèi)參基因GAPDH的Taqman熒光探針，其中，
[0022]所述內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0023]所述內(nèi)參基因GAPDH的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0024]所述內(nèi)參基因GAPDH的Taqman突光探針的喊基序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示；
[0025]所述內(nèi)參基因GAPDH的序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
[0026]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探 針、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針和所述內(nèi)參基GAPDH的Taqman熒光探針的5’端均連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA-MGB。
[0027]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括各種熒光定量PCR反應(yīng)試劑或者各種熒光定量PCR反應(yīng)試劑的混合物，優(yōu)選地，所述各種熒光定量PCR反應(yīng)試劑包括PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和無(wú)RNase去離子水。
[0028]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上下游引物和Taqman熒光探針，其中:
[0029]所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 17所示；
[0030]所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 18所示；
[0031]所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 19所示；
[0032]所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:20所示。更優(yōu)選地，所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
[0033]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽(yáng)性對(duì)照為含有CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性和所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的基因組DNA樣品。
[0034]一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的方法，采用熒光定量PCR法，包括如下步驟:
[0035]步驟一，提取受檢者基因組DNA ；
[0036]步驟二，以稀釋成不同濃度的如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 13所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 14所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO: 15所示的Taqman熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)以制作內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0037]步驟三，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID N0:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID N0:3所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:4所示的上游引物、如序列表中SEQ IDN0:5所示的下游引物和如序列表中SEQ ID N0:6所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 7所示的上游引物、如序列表中SEQ ID N0:8所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:9所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 10所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 11所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO: 12所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；其中所述步驟三中的熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件與步驟二的熒光定量PCR反應(yīng)條件相同；
[0038]步驟四，數(shù)據(jù)收集處理和分析。
[0039]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應(yīng)中均加入了如序列表中SEQ ID N0:17所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、如序列表中SEQ ID NO: 18所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 19所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的下游引物以及如序列表中SEQ ID N0:20所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman突光探針。
[0040]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應(yīng)的條件為:先經(jīng)過(guò)50°C 10s，95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s,60°C lmin,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。更優(yōu)選地，熒光定量PCR的反應(yīng)液中部分組分及終濃度為:1 X的PCR預(yù)混合液、2.5-4.0mM 的 Mg2+、0.2-0.4mM 的 dNTPs、0.3-0.6mM 的 dUTP、0.2U/ μ L 的 Taq 酶、
0.01-0.05U/ μ L 的 UNG 酶。
[0041]本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和效果如下: [0042](I)敏感性高:可重復(fù)敏感度為0.01%,即10000個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)含CYP3A5基因CYP3A5*3 多態(tài)性、CYP3A 5 基因 CYP3A5*4 多態(tài)性、CYP3A5 基因 CYP3A5*6 多態(tài)性或 CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性就可以被檢測(cè)出。
[0043](2)特異性強(qiáng):使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，準(zhǔn)確性高。同時(shí)，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。
[0044](3)簡(jiǎn)便安全:操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高而且防止污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)檢測(cè)，不需要開蓋，不易被污染；同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)一步完成，不需要后期處理，無(wú)需要擔(dān)心放射性污染。
[0045](4)全程監(jiān)控:本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽(yáng)性控制質(zhì)量控制體系，對(duì)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽(yáng)性或者假陰性。
[0046](5)快速:速度快、高通量，可在3-4小時(shí)完成。
[0047]本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法能快速、準(zhǔn)確、定量檢測(cè)CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性、CYP3A5 基因 CYP3A5*4 多態(tài)性、CYP3A5 基因 CYP3A5*6 多態(tài)性或 CYP3A5 基因 CYP3A5*7多態(tài)性，有效杜絕了假陽(yáng)性和假陰性的發(fā)生，用于經(jīng)CYP3A5代謝的藥物使用劑量的預(yù)測(cè)并為藥物的選擇提供了重要的技術(shù)手段。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0049]圖1是本發(fā)明實(shí)施例2提供的采用實(shí)施例1試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性陽(yáng)性的受檢者外周血的熒光曲線圖，及內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光曲線圖和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光曲線圖，其橫坐標(biāo)為Cycle Number (循環(huán)數(shù)，個(gè))，其縱坐標(biāo)為FL U0RESCENCE (熒光強(qiáng)度，a.u.)；
[0050]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的采用實(shí)施例1試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性陽(yáng)性的受檢者外周血的熒光曲線圖，及內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光曲線圖和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光曲線圖，其橫坐標(biāo)為Cycle Number (循環(huán)數(shù)，個(gè))，其縱坐標(biāo)為FLUORESCENCE (熒光強(qiáng)度，a.u.)；
[0051]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2提供的采用實(shí)施例1試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性陽(yáng)性的受檢者外周血的熒光曲線圖，及內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒 光曲線圖和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光曲線圖，其橫坐標(biāo)為Cycle Number (循環(huán)數(shù)，個(gè))，其縱坐標(biāo)為FLUORESCENCE (熒光強(qiáng)度，a.u.)；
[0052]圖4是本發(fā)明實(shí)施例2提供的采用實(shí)施例1試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性陽(yáng)性的受檢者外周血的熒光曲線圖，及內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光曲線圖和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的熒光曲線圖，其橫坐標(biāo)為Cycle Number (循環(huán)數(shù)，個(gè))，其縱坐標(biāo)為FLUORESCENCE (熒光強(qiáng)度，a.U.)。
[0053]圖中:1_CYP3A5*3多態(tài)性的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線、2-內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線、3-內(nèi)部陽(yáng)性控制品擴(kuò)增曲線、4-CYP3A5*4多態(tài)性的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線、5_CYP3A5*6多態(tài)性的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線、6-CYP3A5*7多態(tài)性的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0054]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件如SambiOOk等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。
[0055]實(shí)施例1.試劑盒的制備
[0056]1、內(nèi)參基因GAPDH以及檢測(cè)用引物和熒光探針的設(shè)計(jì)
[0057]根據(jù)基因序列分別設(shè)計(jì)對(duì)上述各基因序列特異的引物和熒光探針，其中，GAPDH基因序列和CYP3A5基因序列來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)，GAPDH基因ID分別為2597，參考序列號(hào)為NG_007073.2，也可參見(jiàn)本發(fā)明序列表中SEQ ID NO: 16 ；CYP3A5基因ID分別為1577，參考序列號(hào)為NC_000007.13。采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)如下引物:CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、內(nèi)參基因GAPDH的上下游引物及內(nèi)參基因GAPDH的Taqman熒光探針。
[0058]CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性上游引物序列:5’ -AAGAGCTCTTTTGTCTTTCGA-3’(序列表中 SEQ ID NO:1 所示)。
[0059]CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性下游引物序列:5’ -GACACACAGCAACCTTAGGT-3’(序列表中 SEQ ID NO:2 所示)。
[0060]CYP3A5 基因 CYP3A5*3 多態(tài)性的特異性 Taqman 熒光探針:FAM5’_TATCTCTTCCCTGTTT-3’ TAMRA-MGB (序列表中 SEQ ID NO:3 所示)。
[0061]CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性上游引物序列:5’ -TGCTCTCCACAAAGGGGTCGC-3，(序列表中 SEQ ID N0:4 所示)。
[0062]CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性下游引物序列:5’-TGATTTTAATTTTCCATATC-3’(序列表中 SEQ ID NO:5 所示)。
[0063]CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針:FAM5’ -TGTTGAGAGAGTCG-3’ TAMRA-MGB (序列表中 SEQ ID NO:6 所示)。
[0064]CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性上游引物序列:5’-AGATCCATTATTTCTCTCAATAGA-3’(序列表中 SEQ ID NO:7)。
[0065]CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性下游引物序列:5’-ATGGAATTGTACCTTTTAAGTG-3’(序列表中 SEQ ID NO:8)。
[0066]CYP3A5 基因 CYP3A5*6 多態(tài)性的特異性 Taqman 熒光探針:FAM5’_TATGTGGGCTATTATT-3’ TAMRA-MGB (序列表中 SEQ ID NO:9)。
[0067]CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性上游引物序列:5’-GTTTCTTTCCTTCCAGGCACCACGTT-3’(序列表中 SEQ ID NO: 10)。
[0068]CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性下游引物序列:5’-TCAACATCTTTCTTGCAAGT-3’ (序列表中 SEQ ID NO: 11)。
[0069]CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針:FAM5’ -CTATGATGCCGTG-3’ TAMRA-MGB (序列表中 SEQ ID NO: 12)。
[0070]內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列:5’-CCTTTTGCAGACCACAGTCCAT-3’(序列表中SEQID NO: 13 所示)。
[0071]內(nèi)參基因GAPDH的下游引物序列:5’-GGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(序列表中SEQ IDNO: 14 所示)。
[0072]內(nèi)參基因GAPDH 的 Taqman 熒光探針:FAM5’ -CCATCACTGCCACCC-3’ TAMRA-MGB (序列表中SEQ ID NO: 15所示)。
[0073]對(duì)于上述5個(gè)Taqman突光探針，均米用添加突光染料的方法在5’端標(biāo)記了 FAM,3’端標(biāo)記了 TAMRA-MGB。對(duì)于上述四個(gè)Taqman熒光探針，均采用添加熒光染料的方法分別在5’端標(biāo)記了 FAM，3’端標(biāo)記了 TAMRA-MGB。
[0074]2、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列及其引物和探針的設(shè)計(jì)
[0075]該內(nèi)部陽(yáng)性控制序列為人工合成序列，包含CYP3A5基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQ ID N0:17所示。
[0076]采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件并按照上述引物和探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出上述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上下游引物分別為:5’ -CGTATTGCACTCACTCAGAG-3’(序列表中序列18)、5’-ACAACAGCGTAAGATGATCACTATC-3’(序列表中序列19)，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針為:TET5’ -AATAAGTCCTCTACTATATTAGC-3’ TAMRA (序列表中序列 20)。對(duì)于該 Taqman熒光探針，采用添加熒光染料的方法在5’端標(biāo)記了 TET，3’端標(biāo)記了 TAMRA。
[0077]3、試劑盒的組成及制備
[0078]本發(fā)明試劑盒組成如下:
[0079]①基因組DNA提取試劑:該提取試劑為本領(lǐng)域常用試劑，本實(shí)施例采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號(hào):69504)中的試劑。
[0080]②引物、探針:上述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性上下游引物、上述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、上述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性上下游引物、上述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、上述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性上下游引物、上述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、上述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上下游引物、上述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針、上述內(nèi)參基因GAPDH的上下游引物以及上述內(nèi)參基因GAPDH的T aqman熒光探針。
[0081]③上述內(nèi)參基因GAPDH和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品。
[0082]上述引物序列、控制序列、內(nèi)參基因GAPDH序列和Taqman熒光探針序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0083]④陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照:以去離子水為陰性對(duì)照，以含有CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6基因多態(tài)性和CYP3A5*7基因多態(tài)性的基因組DNA樣品為陽(yáng)性對(duì)照。
[0084]陽(yáng)性對(duì)照的制 備方法:采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號(hào):69504)快速提取已經(jīng)確診的含有CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6基因多態(tài)性和CYP3A5*7基因多態(tài)性的0.5ml受檢者外周血基因組DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0085]⑤各種熒光定量PCR反應(yīng)試劑:PCR預(yù)混合液，本實(shí)施例中選用2XPCR Premix(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212) ；Mg2+ (本實(shí)例為氯化鎂)、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和無(wú)RNase去離子水。
[0086]實(shí)施例2.用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性
[0087]以隨機(jī)檢測(cè)30例受檢者外周血標(biāo)本結(jié)果為例。
[0088]用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)某一受檢者的CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多態(tài)性的檢測(cè)流程為:首先獲取臨床受檢者外周血樣本，快速提取基因組DNA ;其次，先配制內(nèi)參基因GAPDH和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的熒光定量PCR反應(yīng)液，將內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為
1.0xlO3U.0xlO4U.0xlO5和1.0xlO6，分別制作內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；接下來(lái)再配制CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多態(tài)性的熒光定量PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)樣品，在熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中讀出CT值結(jié)果。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，先分析各待檢測(cè)樣品的熒光定量PCR反應(yīng)中內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33;提示整個(gè)檢測(cè)過(guò)程有效；如果其Ct值大于35，提示檢測(cè)失敗，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)；如果其Ct值位于33?35之間，需要重復(fù)檢測(cè)。當(dāng)內(nèi)部陽(yáng)性控制序列Ct值小于33時(shí)，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算即分別計(jì)算如圖1所示的CYP3A5*3基因多態(tài)性、如圖2所示的CYP3A5*4基因多態(tài)性、如圖3所示的CYP3A5*6基因多態(tài)性、如圖4所示的CYP3A5*7基因多態(tài)性及內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，兩者之差即為A Ct值。最后，熒光定量PCR結(jié)果采用軟件分析，并標(biāo)化計(jì)算樣本數(shù)據(jù)。
[0089]各受檢者的CYP3A5基因多態(tài)性的具體檢測(cè)步驟如下:
[0090]①受檢者外周血基因組DNA的抽提:采用實(shí)施例1試劑盒中的基因組DNA提取試劑按DNA抽提純化的方法快速提取0.5ml受檢者外周血基因組DNA。
[0091]②將①中提取的受檢者外周血基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm與280nm光密度值計(jì)算DNA的純度與濃度，用無(wú)菌去離子水調(diào)節(jié)抽提的DNA至相同濃度，置冰箱_20°C保存。
[0092]③將實(shí)施例1試劑盒中的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為1.0xlO3U.0xlO4U.0xlO5和1.0xlO6，用本發(fā)明實(shí)施例1提供的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列和內(nèi)參基因GAPDH的熒光定量PCR反應(yīng)液按以下熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)以分別制作內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0093]稀釋成不同梯度濃度的內(nèi)參基因GAPDH的熒光定量PCR擴(kuò)增:
[0094]各PCR反應(yīng)體系為20 iiL，該反應(yīng)體系中各組分及其終濃度為:1 XPCR混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix, 10.0u L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs、0.5mM的dUTP、0.2U/ y L的Taq酶、0.04U/ y L的UNG酶，內(nèi)參基因GAPDH的上、下游引物的終濃度均為0.2 ii mol/L,內(nèi)參基因GAPDH的Taqman熒光探針的終濃度為0.2 y mo I/L ;另夕卜，各稀釋梯度濃度的內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品用量為1.0ii L，其余為無(wú)RNase去離子水。
[0095]稀釋成不同濃度的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的熒光定量PCR擴(kuò)增: [0096]各PCR反應(yīng)體系為20 iiL，該反應(yīng)體系中各組分及其終濃度為:1 XPCR混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix, 10.0u L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs、0.5mM的dUTP、0.2U/ y L的Taq酶、0.04U/ y L的UNG酶，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上、下游引物的終濃度均為0.25pmol/uL,內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3pmol/U L ;另外，各稀釋梯度的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品用量為1.0 u L，其余為無(wú)RNase去離子水。
[0097]將上述各PCR反應(yīng)體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR:先經(jīng)過(guò)50°C 10s、95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)，并讀取Ct值。
[0098]④CYP3A5*3基因多態(tài)性熒光定量PCR擴(kuò)增:
[0099]PCR反應(yīng)體系為20 ii L,該反應(yīng)體系中各組分及終濃度為:I X PCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix, 10.0u L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs 和
0.5mM的dUTP、0.2U/ y L的Taq酶和0.04U/ y L的UNG酶，CYP3A5*3基因多態(tài)性特異性上、下游引物終濃度均為0.2 u mol/L, CYP3A5*3基因多態(tài)性特異性Taqman熒光探針終濃度為0.3 iimol/L，同時(shí)加入內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上、下游引物的終濃度均為0.2iimol/L，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3 U mol/L,內(nèi)部陽(yáng)性控制序列終濃度為
0.2 u mol/L ;另外，被提取的受檢者外周血基因組DNA用量為2.0 y L，余量為無(wú)RNase去離子水。[0100]將上述PCR反應(yīng)體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)，擴(kuò)增條件:先經(jīng)過(guò)500C 10s，95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自
動(dòng)收集熒光信號(hào)。
[0101]⑤CYP3A5*4基因多態(tài)性熒光定量PCR擴(kuò)增:
[0102]PCR反應(yīng)體系為20iiL,該反應(yīng)體系中各組分及終濃度為:1XPCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix, 10.0u L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs和0.5mM的dUTP、0.2U/ y L的Taq酶和0.04U/ y L的UNG酶，CYP3A5*4基因多態(tài)性特異性上、下游引物終濃度均為0.2 u mol/L, CYP3A5*4基因多態(tài)性特異性Taqman熒光探針終濃度為0.mol/L，同時(shí)加入內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上、下游引物的終濃度均為0.mol/L，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3 U mol/L,內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的終濃度為0.2 u mol/L ;另外，被提取的受檢者外周血基因組DNA用量為2.0 y L，余量為無(wú)RNase去離子水。
[0103]將上述PCR反應(yīng)體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)，擴(kuò)增條件:先經(jīng)過(guò)500C 10s，95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自
動(dòng)收集熒光信號(hào)。
[0104]⑥CYP3A5*6基因多態(tài)性熒光定量PCR擴(kuò)增:
[0105]PCR反應(yīng)體系為20iiL,該反應(yīng)體系中各組分及終濃度為:1XPCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix, 10.0u L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs 和0.5mM的dUTP、0.2U/ y L的Taq酶和004U/ y L的UNG酶，CYP3A5*6基因多態(tài)性特異性上、下游引物的終濃度均為0.2 u mol/L, CYP3A5*6基因多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針終濃度為0.3iimol/L，同時(shí)加入內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上、下游引物的終濃度均為0.2iimol/L，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3 U mol/L,內(nèi)部陽(yáng)性控制序列終濃度為0.2 u mol/L ;另外，被提取的受檢者外周血基因組DNA用量為2.0 y L，余量為無(wú)RNase去離子水。
[0106]將上述PCR反應(yīng)體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)，擴(kuò)增條件:先經(jīng)過(guò)500C 10s，95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自
動(dòng)收集熒光信號(hào)。
[0107]⑦CYP3A5*7基因多態(tài)性熒光定量PCR擴(kuò)增:
[0108]PCR反應(yīng)體系為20iiL,該反應(yīng)體系中各組分及終濃度為:1XPCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2 XPCR Premix, 10.0u L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs 和0.5mM的dUTP、0.2U/ y L的Taq酶和0.04U/ y L的UNG酶，CYP3A5*7基因多態(tài)性特異性上、下游引物的終濃度均為0.2 u mol/L, CYP3A5*7基因多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針終濃度為0.3iimol/L，同時(shí)加入內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上、下游引物的終濃度均為0.2iimol/L，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3 U mol/L,內(nèi)部陽(yáng)性控制序列終濃度為0.2 u mol/L ;另外，被提取的受檢者外周血基因組DNA用量為2.0 y L，余量為無(wú)RNase去離子水。
[0109]將上述PCR反應(yīng)體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)。擴(kuò)增條件:先經(jīng)過(guò)50°C 10s，95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。在CYP3A5*3、CYP3A5*4、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多態(tài)性的熒光定量PCR擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照熒光定量PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為20 iiL，該反應(yīng)體系中各組分及終濃度為=IXPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212，2 XPCR Premix, 10.0u L),，3M 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs 和 0.5mM 的 dUTP、0.2U/u L的Taq酶和0.04U/ y L的UNG酶，CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多態(tài)性的特異性上、下游引物的終濃度均為0.2 ii mol/L, CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的終濃度均為0.3 u mol/L ;另外，陽(yáng)性對(duì)照的基因組DNA樣品的用量為L(zhǎng)OyL或者陰性對(duì)照去離子水的用量為1.0ii L，余量為無(wú)RNase去離子水。
[0110]將該陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也置于Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)，擴(kuò)增條件為:先經(jīng)過(guò)500C 10s，95。。IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60。。Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。
[0111]⑨數(shù)據(jù)收集處理和分析:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析各反應(yīng)體系中的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個(gè)檢測(cè)過(guò)程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)內(nèi)部陽(yáng)性控制序列Ct值小于33時(shí)，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出，·CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多態(tài)性相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的相對(duì)表達(dá)量后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以比值大于或等于0.0001為陽(yáng)性表達(dá)，
[0112]小于0.0001為陰性表達(dá)，具體參見(jiàn)表I。
[0113]表I為熒光定量PCR分析CYP3A5*3基因多態(tài)性、CYP3A5*4基因多態(tài)性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多態(tài)性在受檢者外周血標(biāo)本中的表達(dá)數(shù)據(jù)
[0114]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的試劑盒，包括檢測(cè)用引物以及檢測(cè)用熒光探針，其特征在于，所述檢測(cè)用引物和檢測(cè)用熒光探針包括:CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、和CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針中的至少一組，其中: 所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:3 所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6 所示 ； 所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:9 所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示； 所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO: 12 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)參基因GPADH、所述內(nèi)參基因GAPDH的上下游引物及所述內(nèi)參基因GAPDH的Taqman熒光探針，其中， 所述內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； 所述內(nèi)參基因GAPDH的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示； 所述內(nèi)參基因GAPDH的Taqman突光探針的喊基序列如序列表中SEQ ID NO: 15所不； 所述內(nèi)參基因GAPDH的序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針和所述內(nèi)參基GAPDH的Taqman熒光探針的5’端均連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA-MGB。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括各種熒光定量PCR反應(yīng)試劑或者各種熒光定量PCR反應(yīng)試劑的混合物，優(yōu)選地，所述各種熒光定量PCR反應(yīng)試劑包括PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和無(wú)RNase去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上下游引物和Taqman熒光探針，其中: 所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 17所示； 所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 18所示； 所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的下游引物如序列表中 SEQ ID NO: 19所示； 所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID N0:20所/Jn ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽(yáng)性對(duì)照為含有所述CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性和所述CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性的基因組DNA樣品。
8.一種檢測(cè)CYP3A5基因多態(tài)性的方法，采用熒光定量PCR法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，提取受檢者基因組DNA ； 步驟二，以稀釋成不同濃度的如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 13所示的上游引物、如序列表中SEQ ID N0:14所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO: 15所示的Taqman熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)以制作內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 步驟三，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID N0:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:3所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*3多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:4所示的上游引物、如序列表中SEQ ID N0:5所示的下游引物和如序列表中SEQ ID N0:6所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*4多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQID N0:7所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:8所示的下游引物和如序列表中SEQ IDNO: 9所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*6多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 10所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 11所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO: 12所示的Taqman熒光探針，對(duì)CYP3A5基因CYP3A5*7多態(tài)性進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；其中所述步驟三中的熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件與步驟二的熒光定量PCR反應(yīng)條件相同；步驟四，數(shù)據(jù)收集處理和分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應(yīng)中均加入了如序列表中SEQ ID N0:17所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、如序列表中SEQ ID NO: 18所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 19所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的下游引物以及如序列表中SEQ ID N0:20所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman突光探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應(yīng)的條件為:先經(jīng)過(guò)500C 10s，95。。IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60。。lmin，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)?！?br> 【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103436631SQ201310436834
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】劉輝 申請(qǐng)人:劉輝