一次性發(fā)酵制備高純度賴氨酸硫酸鹽的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括向產(chǎn)L-賴氨酸的菌導(dǎo)入一個(gè)被認(rèn)為與賴氨酸代謝無(wú)關(guān)的基因，而且產(chǎn)品中賴氨酸含量達(dá)到了市售產(chǎn)品的純度。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品，該產(chǎn)品相對(duì)于現(xiàn)有含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品，能夠顯著提高抗吸濕性，從而適宜長(zhǎng)期保存。
【專利說(shuō)明】一次性發(fā)酵制備高純度賴氨酸硫酸鹽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括創(chuàng)新地向產(chǎn)L-賴氨酸的菌導(dǎo)入一個(gè)通常被認(rèn)為與賴氨酸代謝無(wú)關(guān)的基因，而且產(chǎn)品中賴氨酸含量達(dá)到了市售產(chǎn)品的純度。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品和應(yīng)用等。
【背景技術(shù)】
[0002]L-賴氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調(diào)味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)、制藥業(yè)及其他化學(xué)工業(yè)中，尤其是含有雜質(zhì)的賴氨酸鹽(如，硫酸鹽、鹽酸鹽)，一般也可以直接作為飼料添加劑使用。當(dāng)前，L-賴氨酸的生產(chǎn)主要是通過(guò)微生物的發(fā)酵生產(chǎn)的，如可以利用棒狀桿菌生產(chǎn)。
[0003]在賴氨酸鹽的各類產(chǎn)品中，尤其是賴氨酸硫酸鹽，具有非常大的缺點(diǎn)，即具有較大的吸濕性，由此使得其中的含水量過(guò)高(如，大于3%)，這樣過(guò)高的產(chǎn)品濕度容易導(dǎo)致產(chǎn)品結(jié)塊，不易保存，尤其長(zhǎng)期保存時(shí)容易發(fā)霉，這即使在作為安全要求較低的飼料使用時(shí)，也是不容許的。尤其是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，我國(guó)廣大農(nóng)戶，牲畜飼養(yǎng)規(guī)模不大，賴氨酸鹽作為飼料添加劑用量不大，因此整包購(gòu)進(jìn)(往往單價(jià)更為便宜)的賴氨酸鹽產(chǎn)品，因此會(huì)有較多留存，長(zhǎng)期保存時(shí)產(chǎn)品的吸濕性對(duì)他們的影響更大。
[0004]為此，日本味之素公司采用調(diào)節(jié)酸根陰離子與賴氨酸的當(dāng)量比來(lái)克服這一缺陷，將酸根陰離子與賴氨酸的當(dāng)量比調(diào)節(jié)為0.68、.95之 間，即酸根陰離子的當(dāng)量小于賴氨酸的當(dāng)量，這樣可以在一定程度上降低產(chǎn)品的平衡濕度(參見(jiàn)中國(guó)專利第03120099號(hào))。上述方法對(duì)于賴氨酸鹽酸鹽來(lái)說(shuō)，會(huì)帶來(lái)比較良好的抗吸濕性，在相對(duì)濕度為33飛8%的常規(guī)保存環(huán)境下，基本能使得產(chǎn)品的平衡濕度控制在3%以下；然而，對(duì)于賴氨酸硫酸鹽來(lái)說(shuō)，在此保存環(huán)境下，平衡濕度基本都會(huì)超過(guò)3%，甚至?xí)^(guò)5%。
[0005]經(jīng)本發(fā)明人長(zhǎng)期研究和實(shí)驗(yàn)，令人意外地發(fā)現(xiàn)了，在抗吸濕性差的賴氨酸硫酸鹽中添加一定比例的其它類型的氨基酸，盡管會(huì)降低產(chǎn)品中賴氨酸硫酸鹽的純度，但是會(huì)使得賴氨酸硫酸鹽產(chǎn)品的抗吸濕性得到顯著提升，而且該純度的產(chǎn)品并不影響其作為賴氨酸飼料添加劑的效用。
[0006]而且，本發(fā)明人還研究出了一種新的發(fā)酵方法，與現(xiàn)有技術(shù)的不斷加強(qiáng)生成賴氨酸的代謝途徑的思路相反，打開(kāi)非賴氨酸代謝的其他旁路，尤其是在十分復(fù)雜的代謝通路中令人意外地尋找到了一種酶，打開(kāi)的程度非常適中，從而能一次性發(fā)酵得到賴氨酸和其它類型氨基酸配比適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，無(wú)需過(guò)多的制備工藝步驟，得到的產(chǎn)品仍舊能夠作為賴氨酸飼料添加劑，而且抗吸濕性得到顯著提升。
[0007]進(jìn)一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在該一次性發(fā)酵所得到的產(chǎn)物中的賴氨酸含量在添加了硫酸成鹽后很難逾越55%，而目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品中以高濃度產(chǎn)品為主(一般賴氨酸含量為55%或以上)，因此將產(chǎn)品中賴氨酸含量提升到至少55%，才能比較容易進(jìn)行市場(chǎng)推廣。為此，本發(fā)明人還提供了一種步驟簡(jiǎn)便的發(fā)酵生產(chǎn)高純度賴氨酸硫酸鹽的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供新的發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括創(chuàng)新地向產(chǎn)L-賴氨酸的菌導(dǎo)入一個(gè)通常被認(rèn)為與賴氨酸代謝無(wú)關(guān)的基因。另外，本發(fā)明還提供了該方法生產(chǎn)的產(chǎn)品和應(yīng)用等。
[0009]具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括:
(1)將編碼氨基酸序列如SEQID No:1所示的蛋白或其變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌；
(2)在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng)步驟(I)獲得的菌，收集培養(yǎng)的上清液，并讓該上清液通過(guò)濾膜，保留濾液，所述濾液中包含如下重量配比的氨基酸:
賴氨酸54-60份，優(yōu)選為55~57份，更優(yōu)選為55.7份；
天冬氨酸1.3^1.9份，優(yōu)選為1.5^1.65份，更優(yōu)選為1.61份；
蘇氨酸0.8^1.2份，優(yōu)選為0.9^1.1份，更優(yōu)選為I份；
絲氨酸0.45~0.7份，優(yōu)選為0.55~0.65份，更優(yōu)選為0.6份;
谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.3^2.8份，更優(yōu)選為2.56份；
甘氨酸0.8^1.1份，優(yōu)選為0.85^1.05份，更優(yōu)選為0.96份；
丙氨酸1.3^1.7份，優(yōu)選為1.4-1.6份，更優(yōu)選為1.5份；
纈氨酸0.8~1.2份，優(yōu)選為0.9^1.1份，更優(yōu)選為0.99份；
甲硫氨酸0.35~0.55份，優(yōu)選為0.4~0.5份，更優(yōu)選為0.44份；
異亮氨酸0.5^0.8份，優(yōu)選為0.6^0.7份，更優(yōu)選為0.63份；
亮氨酸1.1-1.6份，優(yōu)選為1.25~1.45份，更優(yōu)選為1.36份；
酪氨酸0.55、.9份，優(yōu)選為0.65、.8份，更優(yōu)選為0.72份；
苯丙氨酸0.5^0.85份，優(yōu)選為0.6^0.75份，更優(yōu)選為0.67份；
組氨酸0.8^1.2份，優(yōu)選為0.9^1.1份，更優(yōu)選為1.02份；和，
精氨酸1-1.5份，優(yōu)選為1.1-1.3份，更優(yōu)選為1.18份；
(3)向步驟(2)獲得的濾液，加入硫酸并濃縮干燥至含水率小于3%(w/w)0
[0010]在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述多核苷酸編碼氨基酸序列如SEQ ID No:l所示的蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)的不斷加強(qiáng)生成賴氨酸的代謝途徑的思路相反，本發(fā)明第一方面的方法通過(guò)引入RNA聚合酶sigma-32因子來(lái)適中地打開(kāi)非賴氨酸代謝的其他旁路，從而能一次性發(fā)酵得到賴氨酸和其它類型氨基酸配比適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，無(wú)需過(guò)多的制備工藝步驟。RNA聚合酶sigma-32因子通過(guò)特異性地對(duì)熱休克啟動(dòng)子起作用，而參與熱休克過(guò)程，影響熱休克相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)谷氨酸發(fā)酵中的微生物克服代謝產(chǎn)生的毒物產(chǎn)生影響。盡管RNA聚合酶sigma-32因子已經(jīng)被公開(kāi)(可參見(jiàn)NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)蛋白和基因登錄號(hào)AAB18436.1 ;也可參見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)第96193336號(hào))，但是RNA聚合酶sigma-32對(duì)賴氨酸發(fā)酵以及對(duì)其中的氨基酸產(chǎn)生分布的影響卻沒(méi)有任何啟示。因此，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，所述變體的氨基酸序列為對(duì)如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列添加、缺失或取代一個(gè)和幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的氨基酸序列。
[0011]更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，所述變體的氨基酸序列為對(duì)如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列添加、缺失或取代一個(gè)和幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的氨基酸序列，而且編碼該變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌后在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng),培養(yǎng)的上清液包含如本發(fā)明第一方面中所述重量配比的氨基酸。
[0012]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)RNA聚合酶sigma-32因子的氨基酸序列推導(dǎo)出其編碼的核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子改造的核苷酸序列，以調(diào)節(jié)該代謝途徑打開(kāi)的程度。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所不。
[0013]所述多核苷酸可以通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式被導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，只要能夠使產(chǎn)L-賴氨酸的菌表達(dá)所述RNA聚合酶sigma-32因子即可。所述多核苷酸可以直接被導(dǎo)入，例如利用微粒體、基因槍等導(dǎo)入細(xì)胞；也可以間接被導(dǎo)入，例如可以通過(guò)構(gòu)建在質(zhì)粒等載體上導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的所述多核苷酸可以整合在細(xì)胞的基因組上表達(dá)，也可以游離表達(dá)。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，工程菌是大腸桿菌，更優(yōu)選是對(duì)L-賴氨酸反饋抑制脫敏的大腸桿菌，最優(yōu)選是表達(dá)對(duì)L-賴氨酸反饋抑制脫敏的二氫吡啶二羧酸合成酶的大腸桿菌(參見(jiàn)中國(guó)專利第94194962號(hào))。由于大腸桿菌本身適合作為克隆宿主菌，因此優(yōu)選所述多核苷酸是通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入大腸桿菌的。
[0014]在本文中，在表示配比時(shí)所用的“份”，是為了表示在所述組合物中，各成分的重量配比，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是能夠理解的。重量“份”在對(duì)組合物中一種以上的成分進(jìn)行限定時(shí)，可以看作是這些成分在該組合物中的比例。
[0015]在本文中，接種量具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能常規(guī)理解的含義，具體在以體積百分比表示的時(shí)候，指的是菌體培養(yǎng)液(接入的菌液)體積相對(duì)于被接入的培養(yǎng)基體積的百分比量。
[0016]使用濾膜可以去除雜質(zhì)，尤其是高分子量雜質(zhì)，富集賴氨酸，從而提高賴氨酸純度。濾膜可以是超濾膜，也可以是納濾膜，優(yōu)選是超濾膜。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用截留分子量為IOOODa的濾膜，可以一次性將最終產(chǎn)品中的賴氨酸含量提高到55%以上，達(dá)到適合市場(chǎng)推廣的需要，而且操作步驟簡(jiǎn)便。因此，優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，濾膜是截留分子量為50(T5000Da的濾膜，優(yōu)選是截留分子量為80(T3000Da的濾膜，更優(yōu)選是截留分子量為90(T2000Da的濾膜，最優(yōu)選是截留分子量為IOOODa的濾膜。
[0017]本發(fā)明第一方面的方法中加入硫酸，從而可以和賴氨酸這一堿性氨基酸成鹽，更易于在干燥過(guò)程中凝結(jié)成顆粒。硫酸的加入量與上清液中賴氨酸的比例可以是恒定的。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，賴氨酸與硫酸的摩爾比為廣3:0.5~1.5，更優(yōu)選為1.5~2.5:0.75~1.25，最優(yōu)選為 2:1。
[0018]液體的濃縮和干燥可以通過(guò)本領(lǐng)域常用的設(shè)備，如，蒸發(fā)器、干燥機(jī)和/或烘箱，來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，上清液依次經(jīng)蒸發(fā)器濃縮，噴入流化床干燥機(jī)內(nèi)造粒，并于烘箱干燥。
[0019]在第二方面，本發(fā)明提供了含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品(其優(yōu)選是飼料添加劑)，其中賴氨酸含量大于54% (w/w)，優(yōu)選大于55% (w/w)，也優(yōu)選含量為54~60% (w/w)，更優(yōu)選為55~57% (w/w)，最優(yōu)選為55.7% (w/w)0這樣的賴氨酸含量便于市場(chǎng)推廣。
[0020]優(yōu)選本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品包含賴氨酸硫酸鹽72.4-80.1份，優(yōu)選為73.5-76.1份，更優(yōu)選為74.4份；天冬氨酸1.3-1.9份，優(yōu)選為1.5-1.65份，更優(yōu)選為1.61份；和，谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.3-2.8份，更優(yōu)選為2.56份。[0021]更優(yōu)選本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品包含如下重量配比的氨基酸:
賴氨酸硫酸鹽72.1-80.1份，優(yōu)選為73.5-76.1份，更優(yōu)選為74.4份；
天冬氨酸1.3-1.9份，優(yōu)選為1.5-1.65份，更優(yōu)選為1.61份；
蘇氨酸0.8-1.2份，優(yōu)選為0.9-1.1份，更優(yōu)選為1份；
絲氨酸0.45-0.7份，優(yōu)選為0.55-0.65份，更優(yōu)選為0.6份;
谷氨酸2-3份，優(yōu)選為2.3-2.8份，更優(yōu)選為2.56份；
甘氨酸0.8-1.1份，優(yōu)選為0.85-1.05份，更優(yōu)選為0.96份；
丙氨酸1.3-1.7份，優(yōu)選為1.4-1.6份，更優(yōu)選為1.5份；
纈氨酸0.8-1.2份，優(yōu)選為0.9-1.1份，更優(yōu)選為0.99份；
甲硫氨酸0.35-0.55份，優(yōu)選為0.4-0.5份，更優(yōu)選為0.44份；
異亮氨酸0.5-0.8份，優(yōu)選為0.6-0.7份，更優(yōu)選為0.63份；
亮氨酸1.1-1.6份，優(yōu)選為1.25-1.45份，更優(yōu)選為1.36份；
酪氨酸0.55-0.9份，優(yōu)選為0.65-0.8份，更優(yōu)選為0.72份；
苯丙氨酸0.5-0.85份，優(yōu)選為0.6-0.75份，更優(yōu)選為0.67份；
組氨酸0.8-1.2份，優(yōu)選為0.9-1.1份，更優(yōu)選為1.02份；和，
精氨酸，1-1.5份，優(yōu)選為1.1-1.3份，更優(yōu)選為1.18份。
[0022]經(jīng)動(dòng)物證實(shí)，即使進(jìn)一步包含發(fā)酵雜質(zhì)，本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品在對(duì)動(dòng)物喂飼中使用仍舊是安全的，更由于其他種類的氨基酸的加入，還可以在一定程度上提高飼料添加劑的功效。因此，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品是飼料添加劑。
[0023]經(jīng)本發(fā)明人長(zhǎng)期研究和實(shí)驗(yàn)，令人意外地發(fā)現(xiàn)了，在抗吸濕性差的賴氨酸硫酸鹽中添加一定比例的其它類型的氨基酸，會(huì)使得賴氨酸硫酸鹽產(chǎn)品的抗吸濕性得到顯著提升，因此適宜長(zhǎng)期保存。在本文中，平衡含水率可以與平衡濕度互換使用，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的吸濕性指標(biāo)，指的是在一定相對(duì)濕度環(huán)境下，產(chǎn)品含水率達(dá)到平衡(即，含水率既不會(huì)增加，也不會(huì)減少)時(shí)的含水率。優(yōu)選可以在常規(guī)保存條件下(相對(duì)濕度為33-58%)長(zhǎng)期保存，本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品的(平衡)含水率小于5% (w/w)，優(yōu)選小于3% (w/w)，更優(yōu)選小于 2.5% (w/w)。
[0024]本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品可以不含有其他雜質(zhì)(即，本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品由上述氨基酸組成)，也可以進(jìn)一步包含雜質(zhì)，如發(fā)酵雜質(zhì)。經(jīng)本發(fā)明人研究，采用本發(fā)明第一方面的方法制備的產(chǎn)品中的其他雜質(zhì)，并不能使上述比例的氨基酸產(chǎn)品在常規(guī)保存條件下含水率高于3% (w/w)。因此優(yōu)選本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品是由本發(fā)明第一方面的方法制備的。
[0025]在第三方面，本發(fā)明提供了賴氨酸硫酸鹽、天冬氨酸和谷氨酸聯(lián)合在制備本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品中的應(yīng)用，優(yōu)選提供了賴氨酸硫酸鹽、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸聯(lián)合在制備本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品中的應(yīng)用。其中，該產(chǎn)品含水率小，優(yōu)選(平衡)含水率小于5% (w/w),更優(yōu)選小于3% (w/w),最優(yōu)選小于2.5% (w/w)。
[0026]本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明的產(chǎn)品抗吸濕性佳，使得產(chǎn)品中的含水率降低50%以上，適合于在我國(guó)南北方廣大地區(qū)長(zhǎng)期儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用；本發(fā)明的產(chǎn)品作為L(zhǎng)-賴氨酸飼料，安全可靠，功效有所提升；本發(fā)明的產(chǎn)品的賴氨酸含量有現(xiàn)有市售賴氨酸煙酸鹽產(chǎn)品對(duì)應(yīng)，所以便于商業(yè)推廣；本發(fā)明的發(fā)酵方法實(shí)施步驟簡(jiǎn)單，僅需要一次發(fā)酵，節(jié)約了生產(chǎn)成本，無(wú)安全隱患；本發(fā)明的發(fā)酵方法的提純步驟，方便了操作，也節(jié)約了生產(chǎn)成本。
[0027]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。
[0028]另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。
[0029]
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說(shuō)明書(shū)等參考。
[0031]實(shí)施例1 RNA聚合酶sigma-32因子基因構(gòu)建體的制備
根據(jù) NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)的蛋白登錄號(hào) AAB18436.1 的氨基酸序列，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了適度表達(dá)型密碼子(非表達(dá)量?jī)?yōu)化密碼子)，并通過(guò)商業(yè)途徑委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成編碼RNA聚合酶sigma-32因子的基因并構(gòu)建入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-20b(+)(可購(gòu)自美國(guó)Novagen公司，商品編號(hào)Cat.N0.69739-3)中?？寺∵^(guò)程參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》以及所用商品化試劑的操作指南進(jìn)行，簡(jiǎn)要過(guò)程如下:` 通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀，合成RNA聚合酶sigma-32因子基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(購(gòu)自TaKaRa公司)將這些核酸片段的5’端進(jìn)行磷酸化，然后等摩爾比混合這5個(gè)核酸片段后于65°C變性5分鐘，退火降溫至16°C，加入T4 DNA連接酶(購(gòu)自TaKaRa公司)連接12小時(shí)。然后，取I μ L上述連接產(chǎn)物在50μ L反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中正向引物如序列表的SEQ ID No: 3所示(引入了 EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn))、反向引物如序列表的SEQ IDΝο:4所示(引入了 Xho I內(nèi)切酶位點(diǎn))，反應(yīng)條件為:以94° C變性4分鐘，然后以94° C變性30秒、63° C退火60秒并72° C延伸35秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72° C延伸4分鐘并降溫至4° C。
[0032]瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物，回收約900bp大小的片段，用EcoR I和XhoI雙酶切該片段，并與經(jīng)這兩個(gè)內(nèi)切酶酶切的pET-20b(+)質(zhì)粒用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplO F’中。挑出陽(yáng)性克隆，抽提出其中的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，相應(yīng)核苷酸序列如本發(fā)明人設(shè)計(jì)的SEQ ID No:2所示，編碼了如SEQ ID No:1所示的RNA聚合酶sigma-32因子，由公司將構(gòu)建好的質(zhì)粒(命名為pET-sigma)寄回。
[0033]實(shí)施例2大腸桿菌發(fā)酵的L-賴氨酸硫酸鹽產(chǎn)品的制備
對(duì)中國(guó)專利第94194962號(hào)所述的方法構(gòu)建的產(chǎn)L-賴氨酸的大腸桿菌菌株W3110(tyrA)/pCABD2，轉(zhuǎn)化pET-sigma質(zhì)粒，經(jīng)鑒定獲得轉(zhuǎn)化陽(yáng)性克隆(命名% W3110(tyrA)/pCABD2-sigma)后，將菌株 W3110(tyrA)/pCABD2 和 W3110 (tyrA)/pCABD2-sigma分別參照中國(guó)專利第03120099號(hào)進(jìn)行賴氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，將菌株接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到0.35，以5%的接種量接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基配方為:100g葡萄糖，60g (NH4)2SO4, 50g CaCO3, 35mL蛋白胨-B (SoyProtein Enzymatic Hydrolysate,購(gòu)自上海信然生物技術(shù)有限公司，總氮含量不低于3%),Ig KH2PO4,400mg MgSO4.7H20，200mg L-甲硫氨酸，IOmg FeSO4.7H20，8.1mg MnSO4.4Η20,300 μ g生物素和200 μ g維生素BI，用Tris-HCl調(diào)節(jié)至pH7)中以36°C振蕩(250rpm)培養(yǎng)72小時(shí)。然后，離心收集培養(yǎng)基上清液(發(fā)酵液)。然后將上清液分別通過(guò)截留分子量IOOODa的超濾膜(可購(gòu)自德國(guó)Sartorius AG，商品編號(hào):3051460901E_SG)，用HPLC定量濾液中的L-賴氨酸含量以及其他成分。結(jié)果如表I所示，相對(duì)于W3110(tyrA)/pCABD2的濾液，W3110 (tyrA) /pCABD2-sigma的賴氨酸含量略有下降，但其他氨基酸的種類和比例明顯提高，其他雜質(zhì)(主要是低于氨基酸分子量的雜質(zhì)(無(wú)機(jī)鹽)，而高于氨基酸分子量的雜質(zhì)(糖、多糖、肽和蛋白)預(yù)計(jì)大部分被濾膜截留去除)的含量基本不變，因此兩者發(fā)酵產(chǎn)物的性質(zhì)如果有不同，估計(jì)是歸因于其他氨基酸的種類和比例。
[0034]表I濾液中的成分比較
【權(quán)利要求】
1.發(fā)酵制備含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括: (1)將編碼氨基酸序列如SEQID No:1所示的蛋白的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌； (2)在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng)步驟(I)獲得的菌，收集培養(yǎng)的上清液，并讓該上清液通過(guò)截留分子量為IOOODa的濾膜，保留濾液，所述濾液中包含如下重量配比的氨基酸: 賴氨酸54~60份,優(yōu)選為55~57份； 天冬氨酸1.3-1.9份，優(yōu)選為1.5-1.65份； 蘇氨酸0.8~1.2份，優(yōu)選為0.9~1.1份； 絲氨酸0.45~0.7份，優(yōu)選為0.55~0.65份； 谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.3-2.8份； 甘氨酸0.8-1.1份，優(yōu)選為0.85-1.05份； 丙氨酸1.3-1.7份，優(yōu)選為1.r1.6份； 纈氨酸0.8~1.2份，優(yōu)選為0.9~1.1份； 甲硫氨酸0.35~0.55份，優(yōu)選為0.4~0.5份； 異亮氨酸0.5-0.8份，優(yōu)選為0.6-0.7份； 亮氨酸1.101.6份，優(yōu)選為1.25~1.45份； 酪氨酸0.55~0.9份，優(yōu)選為0.65~0.8份； 苯丙氨酸0.5~0.85份，優(yōu)選為0.6~0.75份； 組氨酸0.8-1.2份，優(yōu)選為0.9-1.1份；和， 精氨酸，1-1.5份，優(yōu)選為1.1-1.3份； (3)向步驟(2)獲得的濾液，加入硫酸并濃縮干燥至含水率小于3%(w/w)0
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中賴氨酸與硫酸的摩爾比為廣3:0.5~1.5，優(yōu)選為1.5~2.5:0.75~1.25，更優(yōu)選為 2:1。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中菌是大腸桿菌，優(yōu)選是對(duì)L-賴氨酸反饋抑制脫敏的大腸桿菌。
4.含L-賴氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品(其優(yōu)選是飼料添加劑)，其中賴氨酸含量為54飛0%(w/w),更優(yōu)選為55-57% (w/w)，最優(yōu)選為55.7% (w/w);而且所述產(chǎn)品包含賴氨酸硫酸鹽72.1-80.1份，優(yōu)選為73.5-76.1份，更優(yōu)選為74.4份；天冬氨酸1.3-1.9份，優(yōu)選為1.5-1.65份，更優(yōu)選為1.61份；和，谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.3-2.8份，更優(yōu)選為2.56份。
5.權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其包含: 賴氨酸硫酸鹽72.1-80.1份，優(yōu)選為73.5-76.1份，更優(yōu)選為74.4份； 天冬氨酸1.3-1.9份，優(yōu)選為1.5-1.65份，更優(yōu)選為1.61份； 蘇氨酸0.8-1.2份，優(yōu)選為0.9-1.1份，更優(yōu)選為I份； 絲氨酸0.45~0.7份，優(yōu)選為0.55~0.65份，更優(yōu)選為0.6份; 谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.3-2.8份，更優(yōu)選為2.56份； 甘氨酸0.8-1.1份，優(yōu)選為0.85-1.05份，更優(yōu)選為0.96份； 丙氨酸1.3-1.7份，優(yōu)選為1.Π.6份，更優(yōu)選為1.5份； 纈氨酸0.8~1.2份，優(yōu)選為0.9-1.1份，更優(yōu)選為0.99份； 甲硫氨酸0.35~0.55份，優(yōu)選為0.4~0.5份，更優(yōu)選為0.44份； 異亮氨酸0.5-0.8份，優(yōu)選為0.6-0.7份，更優(yōu)選為0.63份；亮氨酸1.1-1.6份，優(yōu)選為1.25~1.45份，更優(yōu)選為1.36份； 酪氨酸0.55、.9份，優(yōu)選為0.65、.8份，更優(yōu)選為0.72份； 苯丙氨酸0.5^0.85份，優(yōu)選為0.6^0.75份，更優(yōu)選為0.67份； 組氨酸0.8^1.2份，優(yōu)選為0.9^1.1份，更優(yōu)選為1.02份；和， 精氨酸，1.1-1.5份，優(yōu)選為1.1-1.3份，更優(yōu)選為1.18份。
6.權(quán)利要求4或5所述的產(chǎn)品,其含水率小于5%(w/w),優(yōu)選小于3% (w/w),更優(yōu)選小于 2.5% (w/w)。
7.權(quán)利要求4或5所述的產(chǎn)品，其是由權(quán)利要求f3之任一所述的方法制備的。
8.賴氨酸硫酸鹽、天冬氨酸和谷氨酸聯(lián)合在制備飼料添加劑中的應(yīng)用，其中，氨基酸的重量配比如下: 賴氨酸硫酸鹽72.1-80.1份，優(yōu)選為73.5^76.1份，更優(yōu)選為74.4份； 天冬氨酸1.3^1.9份，優(yōu)選為1.5^1.65份，更優(yōu)選為1.61份；和， 谷氨酸2~3份，優(yōu)選為2.3^2.8份，更優(yōu)選為2.56份。
9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中飼料添加劑是權(quán)利要求4-7之任一所述的產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求4-7之任一所述的產(chǎn)品在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103451223SQ201310438880
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月7日
【發(fā)明者】馬吉銀, 陳崇安, 孟剛 申請(qǐng)人:寧夏伊品生物科技股份有限公司