治療肝癌的藥物及raco-1單克隆抗體的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種治療肝癌的藥物及RACO-1單克隆抗體的應(yīng)用，本發(fā)明治療肝癌的藥物包括藥物有效量的RACO-1單克隆抗體，所述RACO-1單克隆抗體為人源RACO-1單克隆抗體，所述人源RACO-1單克隆抗體通過(guò)以下步驟制備得到：提取原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血淋巴細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR法克隆RACO-1DNA；采用RACO-1DNA進(jìn)行噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建；篩選噬菌體抗體庫(kù)得到目的細(xì)菌；提取目的細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA，切除質(zhì)粒DNA中的噬菌體外殼蛋白Ⅲ基因，將剩余部分的質(zhì)粒DNA進(jìn)行表達(dá)、純化得到人源RACO-1單克隆抗體，本發(fā)明具有特異性好、親和力高、免疫原性小、副作用低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】治療肝癌的藥物及RAC0-1單克隆抗體的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種治療肝癌的藥物及RAC0-1單克隆抗體的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球男性第五大常見(jiàn)腫瘤,具有預(yù)后惡劣、死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命與健康。盡管近年來(lái)隨著影像診斷與手術(shù)技術(shù)的不斷進(jìn)步以及以索拉非尼為代表的肝癌靶向治療藥物的面世，為肝癌的早期診斷與治療提供了可能與更多且更有效的治療選擇，使肝癌的治療水平得到了一定的提高。然而，綜觀目前肝癌臨床治療現(xiàn)狀，現(xiàn)今尚缺乏真正有效、副作用少的肝癌治療藥物，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍高居不下，術(shù)后5年生存率仍徘徊在30%上下，嚴(yán)重制約了肝癌總體治療水平的提高，無(wú)法使之得到根本性的改善。
[0003]生物技術(shù)藥研究是當(dāng)今生命科學(xué)研究中最為活躍的領(lǐng)域之一，其中的分子靶向藥物因其選擇性高，廣譜有效，不易發(fā)生耐藥，同時(shí)安全性也明顯優(yōu)于細(xì)胞毒性化療藥物，各國(guó)均予以高度重視，現(xiàn)已有多個(gè)此類藥物獲得批準(zhǔn)上市應(yīng)用。新近經(jīng)FDA批準(zhǔn)的索拉非尼(Sorafenib)即是一種新型多祀點(diǎn)的抗腫瘤藥物。在最近的一項(xiàng)多中心、雙盲、安慰劑對(duì)照的III期臨床試驗(yàn)中，Llovet等隨機(jī)對(duì)602名以前未經(jīng)過(guò)系統(tǒng)性治療的晚期肝癌患者給予索拉非尼或安慰劑治療，研究發(fā)現(xiàn):在晚期肝癌中，索拉非尼組患者的中位生存時(shí)間比安慰劑組患者延長(zhǎng)2.8個(gè)月。因此，美國(guó)FDA宣布索拉非尼適用于治療無(wú)法手術(shù)切除的肝細(xì)胞肝癌。國(guó)內(nèi)陳志南院士自主研發(fā)的國(guó)家生物制品一類新藥“碘[1311]美妥昔單抗注射液(利卡汀)”，也是專門用于治療肝癌的特異性抗體靶向藥物，現(xiàn)已經(jīng)批準(zhǔn)在國(guó)內(nèi)上市。該放射免疫靶向藥物在前期的臨床應(yīng)用中顯示對(duì)晚期肝癌具有一定療效。
[0004]此外，有研究報(bào)告，以抗人AFP單抗為載體、1311和絲裂霉素為“雙彈頭”，治療中晚期肝癌患者，結(jié)果顯示治療后腫瘤縮小率高于對(duì)照組。也有報(bào)告研究人肝癌單抗Hepama-1與1311偶聯(lián)制成的1311-Hepama_l單克隆抗體導(dǎo)向治療晚期肝癌,雖能使部分患者癌性癥狀減輕。但這后兩項(xiàng)研究均未見(jiàn)有關(guān)提聞生存率的報(bào)告。
[0005]目前單克隆抗體大多是鼠源性的，而鼠源性單克隆抗體應(yīng)用于人體治療時(shí)存在諸多問(wèn)題:一是不能有效地激活人體中補(bǔ)體和Fe受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)；二是被人體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human antigen mouse antibody, HAMA);三是在人體循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除掉。
[0006]對(duì)于不能手術(shù)的晚期HCC，藥物治療是其主要治療方式。然而，迄今系統(tǒng)化療仍然沒(méi)有高效的化療藥物或方案，大量的臨床試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示，化療藥物單藥治療肝癌的有效率大約在O~25%之間，與非治療組比較收益甚微，僅有姑息效果，且缺乏相關(guān)的大規(guī)模III期臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)以供參考。阿霉素是傳統(tǒng)的用于肝癌治療的藥物，但是客觀緩解率僅為10%~15%，且不能延長(zhǎng)患者生存期。靶向藥物的治療效果也并不理想，其中最為成功的索拉菲尼藥物對(duì)患者生存時(shí)間的延長(zhǎng)也僅為3個(gè)月。[0007]綜上所述，有關(guān)肝癌的藥物的研究尚存在許多問(wèn)題，目前仍然無(wú)法很好的解決提高肝癌病人臨床治療的生存率這一關(guān)鍵問(wèn)題，根本無(wú)法滿足肝癌病人的治療需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明旨在提供一種治療肝癌的藥物及RAC0-1單克隆抗體的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法很好的解決提高肝癌病人臨床治療的生存率的技術(shù)問(wèn)題。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種治療肝癌的藥物。該藥物包括藥物有效量的RAC0-1單克隆抗體。
[0010]進(jìn)一步地，RAC0-1單克隆抗體為人源RAC0-1單克隆抗體。
[0011]進(jìn)一步地，人源RAC0-1單克隆抗體通過(guò)以下步驟制備得到:提取原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血淋巴細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR法克隆RAC0-1 DNA ;采用RAC0-1 DNA進(jìn)行噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建；篩選噬菌體抗體庫(kù)得到目的細(xì)菌；提取目的細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA，切除質(zhì)粒DNA中的噬菌體外殼蛋白III基因，將剩余部分的質(zhì)粒DNA進(jìn)行表達(dá)、純化得到人源RAC0-1單克隆抗體。
[0012]進(jìn)一步地，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:1;下游引物的序列如 SEQ ID NO:2o
[0013]進(jìn)一步地，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 ;下游引物的序列如 SEQ ID NO:4ο
[0014]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種RAC0-1單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0015]進(jìn)一步地，RAC0-1單克隆抗體為人源RAC0-1單克隆抗體。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種RAC0-1單克隆抗體在體外抑制肝癌細(xì)胞中的應(yīng)用，包括將RAC0-1單克隆抗體以有效抑制濃度與肝癌細(xì)胞接觸。
[0017]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，將RAC0-1單克隆抗體用于制備肝癌的藥物，RAC0-1單克隆抗體能夠特異性地抑制RAC0-1在人體內(nèi)的表達(dá)水平，從而有效的降低肝癌侵襲轉(zhuǎn)移能力，提高肝癌患者的五年生存率。優(yōu)選地，RAC0-1單克隆抗體采用的是人源RAC0-1單克隆抗體，其具有特異性好、親和力高、免疫原性小、副作用低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
圖1示出了 RAC0-1 mRNA和蛋白在肝癌組織中高表達(dá)；A:Real-time PCR檢測(cè)25對(duì)肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中RACO-1mRNA水平，結(jié)果顯示RACO-1mRNA在肝癌組織中呈顯著性高表達(dá)；T，肝癌組織；ANLT，鄰近非腫瘤肝組織；NL，正常肝組織；B: Western-blot檢測(cè)肝癌組織及鄰近非腫瘤肝組織中RAC0-1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，RAC0-1蛋白在肝癌組織中表達(dá)明顯高于鄰近非腫瘤肝組織及正常肝組織，'^,P〈0.01 ；
圖2示出了 Real-time PCR及Western-blot檢測(cè)RAC0-1在5種肝細(xì)胞系中的表達(dá)；A: Real-time PCR檢測(cè)5種肝細(xì)胞系中RACO-1mRNA水平，結(jié)果顯示RACO-1mRNA水平隨細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移潛能升高而增加ffestern-blot檢測(cè)5種肝細(xì)胞系中RAC0-1蛋白水平，結(jié)果顯示RACO-1蛋白水平隨細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移潛能升高而增加；
圖3示出了 RAC0-1在肝癌組織的免疫染色(X400)，結(jié)果顯示RAC0-1主要分布于細(xì)胞衆(zhòng)內(nèi):A:Shimizu評(píng)分為一，陰性表達(dá)；B:Shimizu評(píng)分為1+ ；C:Shimizu評(píng)分為2+ ；D:Shimizu評(píng)分為3+ ；E =RACO-1免疫染色強(qiáng)度與肝癌的預(yù)后分析，高表達(dá)組總體生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組Gd=0.004) ；F =RACO-1免疫染色強(qiáng)度與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分析；
圖4示出了抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體在體外抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移；A:劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞HCCLM3遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響；B =Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞系HCCLM3侵襲能力的影響；C:劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97-H遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響；D =Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97-H侵襲能力的影響；
圖5示出了抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體在體內(nèi)抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移；A:利用HCCLM3細(xì)胞構(gòu)建裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型；紅色箭頭指原位瘤，黑色箭頭指轉(zhuǎn)移瘤；B:示鏡下轉(zhuǎn)移灶；C:抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體處理組與對(duì)照組轉(zhuǎn)移灶數(shù)目比較；以及
圖6示出了抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移A:劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞系HCCLM3和MHCC97-H遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響。B =Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞系HCCLM3和MHCC97-H侵襲能力的影響。C:抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體組與對(duì)照組裸鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目比較。
【具體實(shí)施方式】
[0019]需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0020]本發(fā)明的發(fā)明人采用Real-time PCR方法檢測(cè)RAC0-1 (RACO-1為已知基因，基因序列可在互聯(lián)網(wǎng)上的基因庫(kù)中下載，例如NCBI)在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAC0-1 mRNA在肝癌組織中呈高表達(dá)，且其在高侵襲轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系HCCLM3中的表達(dá)也明顯高于低侵襲轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系H印G2，RAC0-1 mRNA表達(dá)水平隨著肝癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力由弱到強(qiáng)依次增強(qiáng)。由此可見(jiàn)RAC0-1與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力關(guān)系密切。同時(shí)，采用Western-bolt方法檢測(cè)RAC0-1蛋白在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果同樣顯示RAC0-1蛋白在肝癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著肝癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力由弱到強(qiáng)依次增強(qiáng)，與Real-time PCR結(jié)果完全一致，如圖1和圖2所示。
[0021]圖1示出了 RAC0-1 mRNA和蛋白在肝癌組織中高表達(dá)。圖1中的A示出了Real-time PCR檢測(cè)25對(duì)肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(編號(hào)分別為N129、N190、N109、N185、N122、N124、N116、N191、N160、N106、N107、N126、N143、N152、N128、N132、N144、N114、N103、N163、N013、N033、N056、N098、N121)中 RACO-1mRNA 水平。其中，RAC0-1 PCR 檢測(cè)引物如下:上游引物序列為 SEQ ID NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3’);下游引物序列為 SEQ IDNO:2: (5’-tgtagtcggtcagtgccttct_3，)。GAPDH (甘油醒 _3_ 磷酸脫氫酶)作為內(nèi)參引物:上游引物:5’ -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物:5’ -TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’。所有引物均按100 μΜ濃度稀釋備用。按Τ0Υ0Β0公司PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，建立50 μ I PCR反應(yīng)體系如下:SYBR? Green Realtime PCR MasterMix-Plus-25 μ I ；Plus Solution 5μ I ;上游引物(10 μ M) 2 μ I ;下游引物(10 μ Μ) 2 μ I ;所檢測(cè)樣品cDNA溶液5 μ I ；dH2011 μ 1 PCR 反應(yīng)過(guò)程在 ABI Prism 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Foster City，CA，USA)上完成。反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 60 sec ；95°C 15 sec,60 °C 15sec, 72 V 45 sec。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAC0-1 mRNA在肝癌組織中呈高表達(dá)，且其在高侵襲轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系HCCLM3中的表達(dá)也明顯高于低侵襲轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系H印G2，RAC0-1mRNA表達(dá)水平隨著肝癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力由弱到強(qiáng)依次增強(qiáng)。
[0022]圖1中的B示出了 Western-blot檢測(cè)肝癌組織及鄰近非腫瘤肝組織中RAC0-1蛋白的表達(dá)。其操作步驟如下:取預(yù)先加入loading buffer的100 μ g從組織或細(xì)胞提取的總蛋白。在沸水中變性約十分鐘，然后將樣本以12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(Bio-Rad，Hercules, CA，USA)，先80V電泳約30min，蛋白樣品跑出積層膠后轉(zhuǎn)至120V電泳到底后分離蛋白后經(jīng)電泳槽濕轉(zhuǎn)法至PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA。將所需條帶區(qū)域膠切下后在12V下轉(zhuǎn)膜約80-90min后，將5%脫脂奶粉溶于PBST封閉約一小時(shí)后置入一定濃度的一抗溶液中(抗體濃度按抗體說(shuō)明書(shū)稀釋)，4°C孵育過(guò)夜，PBST洗滌PVDF膜45 min,再置入1: 3000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG 二抗常溫下孵育約一小時(shí)，用PBST洗滌PVDF膜十分鐘，三次后，用高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒一比一混合后顯影。本試驗(yàn)使用的一抗為 antihuman RAC0-1 antibody (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO),內(nèi)參照一抗選擇鼠抗人 β-actin抗體(Santa Cruz Biotechnology), 二抗選擇HRP標(biāo)記的兔抗鼠 IgG抗體(KPL，Gaithersburg, MD)。數(shù)碼相機(jī)拍取結(jié)果,用Bandscan 5.0對(duì)條帶圖像進(jìn)行分析，以條帶的灰度值表示蛋白水平的表達(dá)量。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果取其平均值。結(jié)果同樣顯示RAC0-1蛋白在肝癌組織中呈高表達(dá)。
[0023]圖2示出了 Real-time PCR及Western-blot檢測(cè)RA⑶-1在5種肝細(xì)胞系中的表達(dá)(步驟同上)，這5種肝細(xì)胞系分別為L(zhǎng)02、H印G2、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3。其中，圖2中的A示出了 Real-time PCR檢測(cè)5種肝細(xì)胞系中RACO-1mRNA水平，結(jié)果顯示RACO-1mRNA水平隨細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移潛能升高而增加；圖2中的B示出了 Western-blot檢測(cè)上述5種肝細(xì)胞系中RAC0-1蛋白水平，結(jié)果顯示RAC0-1蛋白水平隨細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移潛能升高而增加。
[0024]進(jìn)一步采用免疫組化法檢測(cè)了肝癌組織中RAC0-1蛋白的表達(dá)，圖3結(jié)果顯示，RAC0-1蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，而癌旁肝組織中則未見(jiàn)明顯表達(dá)，且RAC0-1高表達(dá)組的患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間及總生存時(shí)間低于RAC0-1低表達(dá)組，證實(shí)其高表達(dá)與肝癌差的預(yù)后密切相關(guān)。圖3示出了 RAC0-1在肝癌組織的免疫染色(X 400)，結(jié)果顯示RAC0-1主要分布于細(xì)胞衆(zhòng)內(nèi):其中圖3中的A Shimizu評(píng)分為一,陰性表達(dá)；圖3中的B Shimizu評(píng)分為1+ ;圖3中的C Shimizu評(píng)分為2+ ;圖3中的D Shimizu評(píng)分為3+ ；E =RACO-1免疫染色強(qiáng)度與肝癌的預(yù)后分析，高表達(dá)組總體生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組Gd=0.004) ；F =RACO-1免疫染色強(qiáng)度與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分析。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下:所有石蠟標(biāo)本均以3~5 μ m厚度進(jìn)行連續(xù)切片，在開(kāi)展免疫組化前將石蠟切片60 °C烤片約30min，然后把片子浸泡在二甲苯中進(jìn)行脫蠟。大約20分鐘后取出，分別用100%，95%，80%，70%乙醇和蒸餾水依次梯度脫水，室溫下3 min,迅速取出載玻片，浸泡在PBS (Phosphate Buffered Saline)中5min。將玻片用放于破片架，浸在1:50稀釋的EDTA修復(fù)液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)中，放入微波爐中用高火煮10分鐘。然后用Polink-2 plus?通用型二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)進(jìn)行染色，染色后用PBS漂洗3次后，漂洗后的片子滴加3% H2O2孵育。大約10分鐘后PBS漂洗3次。滴加1:400稀釋的antihumanRAC0-1 抗體(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 37°C孵育 I 小時(shí)，PBS 漂洗 3 次后，滴加Po I y-HRP ant1-Goat IgG, 37°C下孵育30分鐘，PBS漂洗3次。漂洗后滴加新鮮配置的DAB(二氨基聯(lián)苯胺，Diaminobenzidine)顯色液顯色。當(dāng)鏡下觀察到細(xì)胞衆(zhòng)內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色著色時(shí)迅速停止染色。自來(lái)水沖洗后，浸入蘇木素復(fù)染液復(fù)染后，大約I分鐘左右，完成后用60 1:烤箱烘干切片，中性樹(shù)脂封片。[0025]發(fā)明人研究結(jié)果表明，RAC0-1在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。RAC0-1通過(guò)AP-1信號(hào)通路調(diào)控肝細(xì)胞癌的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程從而促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移，作用機(jī)制明確，功能強(qiáng)大，特異性強(qiáng)，有望成為肝癌治療靶點(diǎn)。
[0026]本發(fā)明的發(fā)明人在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，制備相應(yīng)的人源性單克隆抗體，通過(guò)離體及在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其抗腫瘤的藥效學(xué)作用，最終獲得肝癌治療候選藥物。采取噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)制備RAC0-1人源性單克隆抗體,曬菌體抗體庫(kù)(phage antibody library)技術(shù)是20世紀(jì)90年代初期抗體工程領(lǐng)域的重大研究進(jìn)展，它結(jié)合了噬菌體展示與抗體組合文庫(kù)技術(shù)，把外源的DNA插入噬菌體編碼的外殼蛋白pill或pVDI的基因中，使外源DNA片段對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體外殼蛋白中形成融合蛋白。此方法包括噬菌體庫(kù)的產(chǎn)生、結(jié)合抗原的展不抗體的篩選、展不有聞未和力抗體的曬菌體擴(kuò)增、有聞未和力的抗體的分尚和定性的具體步驟。其具體操作步驟如下:
其基本方法是從人外周血淋巴細(xì)胞中提取RNA或基因組DNA，設(shè)計(jì)核苷酸引物，用PCR方法克隆人全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因組裝到噬菌體表達(dá)載體內(nèi)，與噬菌體外殼蛋白基因融合，感染大腸桿菌并使抗體片段表達(dá)于噬菌體。然后利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆性擴(kuò)增，獲得可溶性抗體片段(如Fab、scFV及dsFv等)，即噬菌體抗體。
[0027]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種治療肝癌的藥物。該治療肝癌的藥物包括RAC0-1單克隆抗體。RAC0-1單克隆抗體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)的技術(shù)手段根據(jù)RAC0-1全基因序列制備的單克隆抗體?？贵w制劑用于體內(nèi)給藥時(shí)必須是無(wú)菌的，這一點(diǎn)易于實(shí)現(xiàn)，比如，使用除菌濾膜過(guò)濾?？贵w給藥途徑與已知方法一致，如通過(guò)靜脈、腹膜、大腦、肌肉、眼內(nèi)、動(dòng)脈、鞘內(nèi)、吸入或損傷區(qū)途徑注射或輸液等。
[0028]治療所用的抗體的有效量依賴于，比如，治療目標(biāo)、給藥的途徑和患者的病情。因此，治療學(xué)家優(yōu)選滴定確定劑量并根據(jù)要求修改給藥途徑，以獲得最佳治療效果。一般情況下，臨床醫(yī)師將給藥抗體直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需效果的劑量。這種治療方法的進(jìn)行易于由常規(guī)檢測(cè)方法監(jiān)控。本發(fā)明中所提到的“有效量”與本領(lǐng)域通常的“有效量”含義相同；同樣，本發(fā)明中所指的“有效抑制濃度”是臨床醫(yī)師將給藥抗體直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需效果的濃度。
[0029]本發(fā)明所述的單克隆抗體，可以同藥用的載體制備成混合物。這種藥物組合物可通過(guò)靜脈、鼻或肺給藥，優(yōu)選為液體或粉末氣霧劑(凍干)。組合物還可以根據(jù)需要腸胃外給藥或皮下給藥。當(dāng)全身給藥時(shí)，治療組和物應(yīng)該是無(wú)菌、無(wú)熱源，并且在可用于腸胃外的溶液中，并適當(dāng)考慮到PH值、等滲壓性和穩(wěn)定性。這些條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。簡(jiǎn)言之，將具有所需純度的單克隆抗體同生理可用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合。這些物質(zhì)的使用量和濃度上對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其他有機(jī)鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；小分子量(小于10個(gè)氨基酸殘基)肽如聚精氨酸，蛋白如血清蛋白、明膠或免疫球蛋白等。
[0030]人源化抗體是指抗體的可變區(qū)部分(即Vh和Vl區(qū))或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對(duì)人類機(jī)體造成的免疫副反應(yīng)。優(yōu)選地，RAC0-1單克隆抗體為人源RAC0-1單克隆抗體。因?yàn)椋嗽磫慰寺】贵w具有特異性好，親和力高，免疫原性小，副作用低的特點(diǎn)。
[0031]優(yōu)選地，人源RAC0-1單克隆抗體通過(guò)以下步驟制備得到:提取原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血淋巴細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR法克隆RAC0-1 DNA;采用步驟I)克隆獲得的RAC0-1 DNA進(jìn)行噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建；篩選噬菌體抗體庫(kù)得到目的細(xì)菌；提取目的細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA，切除質(zhì)粒DNA中的噬菌體外殼蛋白III基因，將剩余部分的質(zhì)粒DNA進(jìn)行表達(dá)、純化得到人源RAC0-1單克隆抗體。[0032]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如 SEQ ID NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3’)；下游引物的序列如 SEQ ID NO:2(5， -tgtagtcggtcagtgccttct-3，)。
[0033]根據(jù)本發(fā)明另一種典型的實(shí)施方式，克隆RAC0-1 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 (5，- TCAGGGAGAGAAAGGAAGACTG _3’);下游引物的序列如 SEQ ID NO:4 (5，-GTGGACAGAGCGACTTGGATAA -3，)。
[0034]本發(fā)明中，提供一種RAC0-1單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，其中，RAC0-1單克隆抗體為人源RAC0-1單克隆抗體，即將干擾RAC0-1基因的表達(dá)作為治療肝癌的一種方法。
[0035]下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0036]實(shí)施例1
O總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄PCR法克隆RAC0-1基因。
[0037]用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RAC0-1高表達(dá)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者(原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者，女性，41歲)外周血淋巴細(xì)胞總RNA。取約20 μ g總RNA，加入I μ gOligodT, 5ul 250mmol/LdNTP 及 200UM-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBC0LBRL)，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成。PCR擴(kuò)增RAC0-1基因，其中，擴(kuò)增引物如下:上游引物序列為SEQID NO:1 NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3，)；下游引物的序列如 SEQ ID NO:2(5，-tgtagtcggtcagtgccttct-3’)。PCR 擴(kuò)增的條件為:94°C變性 20min、52°C退火 50s、72°C延伸1.5min、共進(jìn)行35輪循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0038]2)大腸桿菌的電穿孔轉(zhuǎn)化
2.5ml過(guò)夜培養(yǎng)的XLl-Blue菌液接種到500ml SB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至A600=0.7~0.8，冰浴15min，4°C離心，棄上清，用10%冷甘油將細(xì)菌洗滌2次后，懸浮于2ml 10%甘油中，-70°C凍存?zhèn)溆?。電穿孔時(shí)將細(xì)菌取出融化，使用Bio-Rad公司的Genepulsertransfection系統(tǒng),按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行穿孔。
[0039]3)噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建
將PCR擴(kuò)增的RAC0-1 DNA經(jīng)Sacl+Xbal消化、電泳純化后插入載體pComb3H中，電穿孔轉(zhuǎn)化XLl-Blue細(xì)胞，然后向XLl-Blue中加3ml SOC培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)Ih后加入含氨芐青霉素50yg/ml、四環(huán)素10yg/ml的SB培養(yǎng)基20ml，37°C振蕩培養(yǎng)2h，加入約1012空斑形成單位(PFU)的輔助噬菌體VCSMl3，接種到100ml含相同(即氨芐青霉素50 μ g/ml、四環(huán)素10 μ g/ml)抗生素的SB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2h，加入卡那霉素至終濃度70μ g/ml，30~37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集上清，加入PEG-8000到4%，NaCl到3%，冰浴30min后，離心棄上清，以2ml含1% BSA的TBS溶解沉淀，離心收集上清即為噬菌體抗體庫(kù)。
[0040]4)噬菌體抗體庫(kù)滴度的測(cè)定
將噬菌體抗體庫(kù)溶液按1:100的比例稀釋于SB培養(yǎng)基中，取IOml加到100mlXLl-Blue (A600=l.0)中，鋪氨芐青霉素培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日計(jì)數(shù)集落，計(jì)算集落形成單位(CFU)。
[0041] 5 )菌落直接PCR鑒定法
挑取單個(gè)細(xì)菌集落，懸于200ml水中，煮沸2min，取2ml用適當(dāng)引物(上游引物序列為 SEQ ID NO:1 (5，-aacaaggggtctgtggaaatc-3’)；下游引物序列為 SEQ ID NO:2:(5’ -tgtagtcggtcagtgccttct-3’ )進(jìn)行PCR反應(yīng),瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)相應(yīng)擴(kuò)增帶。
[0042]6)卩遼菌體抗體庫(kù)的篩選(Panning)
將噬菌體抗體庫(kù)溶液以0.05%碳酸鹽緩沖液稀釋至40μ g/ml，每孔25 μ I (lugRACO-1)包被ELISA板，吸去包被液，以含3% BSA (牛血清白蛋白)的PBS緩沖液加滿小孔，37°C封閉lh，吸去封閉液，加入50 μ I噬菌體抗體庫(kù)液(約1011~1012個(gè)CFU)，37°C培育2h，吸去噬菌體抗體液，以含0.05%吐溫的TBS加滿小孔，用力吹打。5min后吸棄TBS (第2輪洗5次，第3輪以后洗10次)，加入50μ I的洗脫液(0.lmol/L HC1，以甘氨酸調(diào)至pH2.2，加BSA至0.1%)，室溫靜置lOmin，將洗脫液稍加吹打后吸出，立即加入3μ I 2mol/L Tris中和，加2ml XLl-Blue (A600=l)，室溫靜置15min感染，接種到IOml SB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素20 μ g/ml,四環(huán)素10 μ g/ml)中，取1.0 μ I和10 μ I鋪盤測(cè)定CFU，其余菌液30°C振蕩培養(yǎng)lh，加入氨芐青霉素至終濃度50μ g/ml，37°C繼續(xù)培養(yǎng)lh，加入輔助噬菌體(VCSM13)1012 PFU，接種到100ml SB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素20 μ g/ml，四環(huán)素10 μ g/ml)中，37°C培養(yǎng)2h，加入卡那霉素至終濃度70 μ g/ml，30~37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心，上清進(jìn)行PEG (聚乙二醇)沉淀。
[0043]7 )可溶性Fab分子的表達(dá)
將篩選擴(kuò)增的噬菌體抗體庫(kù)提取雙鏈質(zhì)粒DNA，用Spel/Nhel消化，切除噬菌體外殼蛋白III的編碼基因，經(jīng)連接酶連接自身環(huán)化后轉(zhuǎn)化XLl-Blue細(xì)菌，鋪氨芐青霉素盤(20yg/ml),次日隨機(jī)挑取單集落，接種到IOml SB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml氨節(jié)青霉素,20mmol/LMgCl2), 37°C振蕩培養(yǎng)6h，加入IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至lmmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)可溶性Fab分子，然后降低培養(yǎng)溫度至30°C，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集上清用于ELISA檢測(cè)(上清即為可用于治療肝癌的單克隆抗體)。
[0044]實(shí)施例2
PCR擴(kuò)增RAC0-1基因(來(lái)自原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者I例，女性，48歲)，其中，擴(kuò)增引物如下:上游引物的序列如SEQ ID NO: 3 (5’- TCAGGGAGAGAAAGGAAGACTG-3’)；下游引物的序列如SEQ ID NO:4 (5，- GTGGACAGAGCGACTTGGATAA -3’)。其余實(shí)驗(yàn)條件均與實(shí)施例1相同。
[0045]下述實(shí)驗(yàn)中RAC0-1單克隆抗體是通過(guò)加入細(xì)胞培養(yǎng)液中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理的。[0046]將實(shí)施例1獲得的單克隆抗體進(jìn)行體外試驗(yàn)操作如下:
先按常規(guī)流程培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞(HCCLM3_tMl和HCCIiOantiL1以及MHCC97_H_t?i和MHccgT-HantiL1)，所有能滅菌的器械均消毒滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min。先以0.25%胰酶消化細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中和，并輕微吹打制成單細(xì)胞懸液，按5 X 105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于小培養(yǎng)皿或6孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至95%-100%融合時(shí)，用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃?rùn)M線，大約每隔0.5-lcm 一道，用10 μ I移液器頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，劃痕后用無(wú)菌PBS洗細(xì)胞3次，清洗漂浮起來(lái)的碎細(xì)胞，然后加入無(wú)血清培養(yǎng)基在5% CO2、37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。分別于劃痕后48小時(shí)給細(xì)胞拍照，觀察劃痕愈合情況，每組細(xì)胞做3個(gè)平行孔，重復(fù)3次，計(jì)算劃痕愈合率(圖4中的B和D，其中，B中示出了 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞系HCCLM3侵襲能力的影響；D中示出了 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97-H侵襲能力的影響)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)RAC0-1單克隆抗體處理后的肝癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯下降。用侵襲小室實(shí)驗(yàn)觀察抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。所需檢測(cè)細(xì)胞(HCCLM3e°ntMl 和 HCCLM3antHAaM 以及 MHCC97-He°ntMl 和 MHCC97-Hanti以2X IO4細(xì)胞總數(shù)加入每個(gè)小室，再加入300 μ I DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)于下室加入500 μ I含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，將小室置于配套的下室上，我們采用孔徑為8 μ m的預(yù)鋪Matrigel膠的Transwell板(Costar,Cambridge,USA)檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲能力。每板為16孔，使用前于小室內(nèi)加入少量的無(wú)血清DMEM讓其水化。完成上述操作后在5% CO2,370C條件下培養(yǎng)12-24小時(shí)。取出Transwell小室，用棉簽擦盡上室面的Matrigel膠和細(xì)胞，固定后下室面用1%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡觀察。隨機(jī)取3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)小室下室面的細(xì)胞數(shù)即為穿透Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值(圖4中的A和C，其中A中示出了劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞HCCLM3遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響；C中示出了劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97-H遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響)，證實(shí)RAC0-1單克隆抗體能明顯降低肝癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)侵襲能力。
[0047]將實(shí)施例1獲得的單克隆抗體進(jìn)行體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)操作如下:在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。飼養(yǎng)條件如下:恒溫(25°C -27°C)、恒濕(45% -50%)、新鮮空氣高度除塵除菌、無(wú)特殊支原體環(huán)境下飼養(yǎng)一周左右。購(gòu)買4-6周齡雄性BALB/C-nu/nu裸鼠8只(每組4只)，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌飼養(yǎng)室。動(dòng)物置于專用培養(yǎng)箱內(nèi)，安放于層流式超凈架內(nèi)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(加入GFP熒光)和對(duì)照組細(xì)胞(無(wú)GFP)，培養(yǎng)至足夠量時(shí)(達(dá)到IXlO7/只)時(shí)開(kāi)展裸鼠肝臟原位種植成瘤實(shí)驗(yàn)。
[0048]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:首先將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞1:1混合(HCCLM3_tn)1和HCCIiO31^.4 以及 MHCC97-H_tMl 和 ΜΗ(Χ97-!η+ΚΑαΜ)，用 ImlTIP 頭將細(xì)胞反復(fù)吹打使其成為細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管離心后，繼續(xù)加培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5X107/ml。實(shí)驗(yàn)用裸鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉，每只裸鼠用量約0.2-0.5ml，先注射0.2ml，觀察2分鐘左右，如注射量不夠再加0.1ml，直至裸鼠達(dá)到麻醉效果為止。用絡(luò)合碘消毒已麻醉好裸鼠右上腹部皮膚，范圍約3cm左右，于右上腹肋緣下作長(zhǎng)約Icm斜切口，顯露肝臟右葉，用注射器吸取準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液0.2ml，在肝右葉區(qū)域作肝臟被膜下注射0.2ml量后，觀察肝臟出血情況，必要時(shí)止血。仔細(xì)縫合關(guān)腹，平均縫合2針每只。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察:約40天時(shí)，采用頸椎脫位法處死裸鼠，完整解剖取出肝臟種植瘤，肉眼觀察肝臟種植瘤并拍照，將肺組織浸泡于10%的中性甲醛中過(guò)夜，石蠟包埋后行連續(xù)切片，常規(guī)用抗GFP抗體做免疫組織化學(xué)染色后顯微鏡下計(jì)數(shù)肝肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。并做統(tǒng)計(jì)分析。[0049]在體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，證明抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體下調(diào)RAC0-1能明顯抑制HCCLM3細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移(結(jié)果如圖5所示，圖5中A示出了利用HCCLM3細(xì)胞構(gòu)建裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型；紅色箭頭指原位瘤，黑色箭頭指轉(zhuǎn)移瘤示出了示鏡下轉(zhuǎn)移灶；C示出了抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體處理組與對(duì)照組轉(zhuǎn)移灶數(shù)目比較)。
[0050]將實(shí)施例2獲得的單克隆抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟同上，也得出了相近的結(jié)果，如圖6所示。圖6示出了抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。其中，圖6中的A:劃痕愈合實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞系HCCLM3和MHCC97-H遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響。B =Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌人源性RA⑶-1單克隆抗體對(duì)肝癌細(xì)胞系HCCLM3和MHCC97-H侵襲能力的影響。C:抗肝癌人源性RA⑶-1單克隆抗體組與對(duì)照組裸鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目比較
RAC0-1在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。RAC0-1通過(guò)與AP-1成員C-JunD的相互作用調(diào)控AP-1信號(hào)通路，這對(duì)AP-1信號(hào)通路的激活十分關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)敲除RAC0-1的細(xì)胞增殖明顯減慢，同時(shí)，AP-1通路中增殖相關(guān)蛋白cdc2、cyclinDl和hb_egf的表達(dá)明顯減弱。更重要的是過(guò)表達(dá)RAC0-1可促進(jìn)小鼠消化道腫瘤的形成。另外，RAC0-1對(duì)其他腫瘤信號(hào)通路如Wnt和Ras信號(hào)通路也存在重要的調(diào)控作用。我們的研究已經(jīng)證實(shí)RAC0-1通過(guò)調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，通過(guò)抗肝癌人源性RAC0-1單克隆抗體可以在體內(nèi)外顯著抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，有望成為臨床治療肝癌的重要藥物，從而推動(dòng)肝癌治療水平的提高。
[0051]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，將RAC0-1單克隆抗體用于制備肝癌的藥物，RAC0-1單克隆抗體能夠特異性的抑制RAC0-1在人體內(nèi)的表達(dá)水平，從而有效的降低肝癌侵襲轉(zhuǎn)移能力，提高肝癌患者的五年生存率。RAC0-1單克隆抗體采用的是人源RAC0-1單克隆抗體，其具有特異性好、親和力高、免疫原性小、副作用低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
[0052]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種治療肝癌的藥物，其特征在于，包括藥物有效量的RACO-1單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于，所述RAC0-1單克隆抗體為人源RAC0-1單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于，所述人源RAC0-1單克隆抗體通過(guò)以下步驟制備得到: 1)提取原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血淋巴細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR法克隆RAC0-1DNA ； 2)采用所述RAC0-1DNA進(jìn)行噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建； 3)篩選所述噬菌體抗體庫(kù)得到目的細(xì)菌； 4)提取所述目的細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA，切除所述質(zhì)粒DNA中的噬菌體外殼蛋白III基因，將剩余部分的所述質(zhì)粒DNA進(jìn)行表達(dá)、純化得到所述人源RAC0-1單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于，所述克隆RAC0-1DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:1 ;下游引物的序列如SEQ ID NO:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于，所述克隆RAC0-1DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO: 3 ;下游引物的序列如SEQ ID NO:4。
6.RAC0-1單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述RAC0-1單克隆抗體為人源RAC0-1單克隆抗體。
8.RAC0-1單克隆抗體在體外抑制肝癌細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，將所述RAC0-1單克隆抗體以有效抑制濃度與所述肝癌細(xì)胞接觸。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103520718SQ201310439418
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】徐江鋒, 劉細(xì)玉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬義烏醫(yī)院