番木瓜環(huán)斑病毒基因及其RNAi表達載體的構建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種番木瓜環(huán)斑病毒基因及其RNAi表達載體的構建方法，所述番木瓜環(huán)斑病毒基因為CP、Hc-Pro、NIb基因，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列；以感染番木瓜環(huán)斑病毒番木瓜葉片為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA，以CP、Hc-Pro、NIb為靶標干擾基因的保守區(qū)域，通過遺傳轉化，分別將其構建成高效、穩(wěn)定抗病毒植物表達載體，從而得到具有抗病毒植株。本發(fā)明利用CP、NIb、Hc-Pro基因片斷保守序列構建RNAi表達載體，并且將RNAi的高效抗病設計理念引入到番木瓜的抗病基因工程育種中，可用于創(chuàng)造高效、廣譜抗PRSV病毒病的新種質。
【專利說明】番木瓜環(huán)斑病毒基因及其RNAi表達載體的構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學和基因工程領域，涉及一種番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)中外殼蛋白基因(CP)、輔助成分蛋白(HC-Pro)、復制酶基因(NIb)基因、保守序列分析和RNAi表達載體構建方法，RNAi植物表達載體可用于基因槍或農桿菌介導的遺傳轉化，創(chuàng)造高效、廣譜抗PRSV病毒病的新種質。
【背景技術】
[0002]番木瓜(Carica papaya L.)的主要用途是生產水果和具有商業(yè)價值的蛋白水解酶。它是少有的能全年掛果，并在栽培9個月后就能結出成熟果實的作物。番木瓜樹能存活25年或更長的時間，每個葉腋都能不斷的抽生一個或多個果實，每個果實含有約1000多粒種子。從雄花或兩性花采的花粉，很容易人工授粉到雌花或兩性花。周年開花結果的習性，以及易于人工雜交，使得番木瓜能產生大量的后代和取得相當可靠的遺傳轉化結果，因此番木瓜是遺傳/基因組研究和作物改良的一個有吸引力的模型。
[0003]1998年夏威夷轉基因番木瓜彩虹和日升品種被開始商業(yè)化應用，是眾所周知的科學突破，代表了第一次實際應用的轉基因水果作物。利用基因槍法從最初轉化夏威夷溫和毒株HA5-1鏈的CP基因轉基因株系中篩選出的轉基因品種具有抗夏威夷PRSV的能力。之后，許多研究小組利用農桿菌介導法進行了大量轉化工作，利用的外植體包括葉片、葉柄等，但最常用的是體胚發(fā)生的再生體系。番木瓜最高的轉化效率是利用碳化硅或鎢處理胚性愈傷，使愈傷受傷后再進行共培養(yǎng)得到的，卡那霉素抗性轉化系(一般在150毫克/升)的篩選在6至13個月內完成，再生植株一般只有一個插入位點。近年，轉抗真菌基因的番木瓜抗棕櫚疫霉種質已通過基因槍的方法得到。當轉基因育種技術的管制放寬后，轉基因番木瓜系將成為世界范圍內番木瓜產業(yè)增長的重要因素。
[0004]由PRSV-CP基因介導的抗性具有一定的廣譜性，尤其是轉各株系CP基因的通讀部分的植株，對同屬病毒均表現(xiàn)出一定的抗性，這是利用CP基因的優(yōu)勢所在。但應用上還有很大的局限性=PRSV-CP介導的抗性主要表現(xiàn)在病毒侵染早期、推遲發(fā)病和減輕癥狀，抗性水平較低；轉基因表達的CP能包被異源病毒RNA，從而使得原本不能蚜傳的病毒能夠被蚜蟲傳播(Dougherty, 1994),或者一種病毒CP基因的植物表達產物可能包裝另一種病毒或其他致病因子的基因組，從而形成一種新的致病因子(高艷梅等，2009)。
[0005]利用PRSV的復制酶(NIb)基因構建人工抗性基因轉化植物獲得抗病毒植株，是抗PRSV番木瓜生物技術育種的又一重要進展。早在1996、1998年我國中山大學和香港大學的研究人員就對番木瓜PRSV的復制酶基因進行了克隆和轉化番木瓜的研究(葉長明等，1996 ;陳谷，1998)。我國華南農業(yè)大學的研究人員將番木瓜PRSV-Ys株系的復制酶基因轉化入番木瓜中，轉化植株對PRSV的Ys、Vb、Sm株系表現(xiàn)高抗，在定植田間的9個月中，轉基因植株無一發(fā)病，而對照則全部發(fā)病。這一轉基因品種“華農I號”于2006年獲政府批準在廣東省商業(yè)化種植。該復制酶基因含有35S啟動子和一個NOS終止子，并具卡那霉素抗性篩選功能。據報道，華農I號能抗來自中國4個不同地區(qū)的番木瓜環(huán)斑病毒株系(阮小蕾等，2004 ;阮小蕾等，2009 ;阮小蕾等，2010)。之前，華南農業(yè)大學的研究者們嘗試利用雙元載體PBI121將不可譯的復制酶基因和外殼蛋白基因轉入番木瓜中，但轉化植株沒有獲得抗病性。轉PRSV-NIb基因的植株的抗性特點是:抗性強、專一、持續(xù)時間長、但抗性范圍狹窄，一般對提供復制酶基因的親本病毒株系有很強抗性，而對那些與親本株系同源性差的病毒株系不表現(xiàn)抗性。
[0006]臺灣番木瓜轉基因研究者發(fā)現(xiàn)當PRSV-YK株系的Hc-Pro基因改變后，抗PRSV-YK株系的轉基因種質將失去抗病能力(Ying-Huey Cheng, 1996)，這說明Hc-Pro基因在PRSV感染過程中發(fā)揮著重要作用，沉默病毒的Hc-Ριχ)基因表達也是值得嘗試的轉基因育種策略。 [0007]此外，研究中發(fā)現(xiàn)由轉CP基因介導的抗性不僅僅和外殼蛋白有關，還和RNA介導的抗性有關，即高水平或者是廣譜的植物病毒抗性是由外殼蛋白和RNA干擾共同引起的。RNA介導的抗性與蛋白質介導的抗性有著明顯的不同，它僅依靠轉基因的RNA轉錄，而不需要病毒基因編碼表達的蛋白質，故具有較高的生物安全性，容易被公眾接受；同時，其抗性表現(xiàn)型與接種物的劑量無關，類似于免疫，它更為高效；RNA介導的抗性只需病毒RNA序列與靶序列同源，允許部分位點的突變、甚至缺失，并且伴隨著dsRNA的產生而產生，這種dsRNA是與沉默基因的正義或反義RNA高度同源性的，但當轉基因序列和病毒基因序列的非同源性高于10%的時候，轉基因就很難賦予植物抗病性(Bau HJ2003)，因而特異性更強，為了獲得廣譜的病毒抗性，通過附加更多的病毒相關序列擴充轉基因結構，能夠使轉基因植物獲得更為廣譜的抗性(Bucher EC2006)。
[0008]RNAi (RNA interference)即RNA干擾,是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物體內普遍存在的一種古老的生物學現(xiàn)象，是由雙鏈RNA( dsRNA)介導的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達，簡單地說，RNAi就是指由RNA介導的高效基因沉默現(xiàn)象。利用RNAi技術設計短片段反向重復發(fā)夾結構病毒基因相關序列，序列表達后能夠直接產生dsRNA，與傳統(tǒng)轉病毒全長如CP或RP等相關基因來產生RNA，并進一步在植物體內剪切產生dsRNA，從而介導RNA抗性相比，RNAi技術的抗病毒效率遠遠更高，一般來說轉病毒單鏈正義或者反義基因賦予植物的病毒抗性只有20%左右，但是轉入能夠產生dsRNA的IR序列的植物對病毒的抗性卻高達90%(Waterhouse PM2003)。因此利用RNAi技術培育廣譜、高抗PRSV番木瓜新品系，在理論上是可行的。
[0009]目前，世界上還沒有利用RNAi技術轉化番木瓜得到轉基因種質與品種(系)的研究。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明的目的是一種番木瓜環(huán)斑病毒基因及其RNAi表達載體的構建方法，利用對抗PRSV有效的病毒CP、NIb、Hc-Pro基因片斷保守序列構建RNAi表達載體進行番木瓜轉化，解決了分別利用CP和NIb基因轉化使番木瓜獲得抗PRSV所存在的不足，并且將RNAi的高效抗病設計理念引入到番木瓜的抗病基因工程育種中，可用于創(chuàng)造高效、廣譜抗PRSV病毒病的新種質。
[0011]本發(fā)明所采用的技術方案:
[0012]一種番木瓜環(huán)斑病毒基因，為CP、Hc-Pro, NIb基因，提取自感染番木瓜環(huán)斑病毒的番木瓜葉片中，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核
苷酸序列。
[0013]以感染番木瓜環(huán)斑病毒番木瓜葉片為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA，以CP、Hc-Pro, NIb為靶標干擾基因的保守區(qū)域，通過遺傳轉化，引入到番木瓜的抗病基因工程育種中，分別將其構建成高效、穩(wěn)定抗病毒植物表達載體，從而得到具有抗病毒植株。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種番木瓜環(huán)斑病毒CP、Nib、Hc-Pro基因的RNAi表達載體的構建方法，是以感染番木瓜環(huán)斑病毒番木瓜葉片為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA,以CP基因、Hc-Pro基因、NIb基因(其核苷酸序列分別如SEQID N0.1，SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3)為模板，設計特異性引物，用高保真Taq酶進行PCR反應，在CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段分別引入XhoI和BglII酶切位點，在CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段分別引入BamHI和SalI酶切位點，引物序列如下:
[0015]CP正向序列:酶切位點XhoI和BglII
[0016]PRSV-CP-RNA1-Pl: 5，-CCCTCGAGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
[0017]PRSV-CP-RNA1-P2:5，-GAAGATCTTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3，
[0018]基因大小544bp
[0019]CP反向序列:酶切位點SalI和BamHI [0020]PRSV-CP-RNA1-P3:5，-GCGTCGACTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
[0021 ] PRSV-CP-RNA1-P4:5，-CGGGATCCTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3，
[0022]Hc-Pro正向序列:酶切位點XhoI和BglII
[0023]PRSV-Hcpro-RNA1-Pl: 5，-CCCTCGAGTGAATGCACGTAACATGAACGA-3，
[0024]PRSV-Hcpro-RNA1-P2:5，-GAAGATCTACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3，
[0025]基因大小484bp
[0026]Hc-Pro反向序列:酶切位點SalI和BamHI
[0027]PRSV-Hcpro-RNA1-P3:5，-GCGTCGACTGAATGCACGTAACATGAACGA-3，
[0028]PRSV-Hcpro-RNA1-P4:5，-CGGGATCCACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3，
[0029]NIb正向序列:酶切位點XhoI和BglII
[0030]PRSV-NIb-RNA1-Pl: 5，-CCCTCGAGCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3，
[0031]PRSV-NIb-RNA1-P2:5’ -GAAGATCTACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3’
[0032]基因大小424bp
[0033]NIb反向序列:酶切位點SalI和BamHI
[0034]PRSV-NIb-RNA1-P3:5，-GCGTCGACCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3，
[0035]PRSV-NIb-RNA1-P4:5，-CGGGATCCACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3，
[0036]將PCR產物連接到PMD18-T Simple載體，轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質粒，由XhoI和BglII雙酶切得到的CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段，與XhoI和BglII雙酶切的pRNAil017連接，轉化，篩選陽性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質粒，經BamHI和SalI雙酶切與CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段進行連接，轉化，篩選陽性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質粒，經PstI和SalI雙酶切與pCAMBIA2300-35S-0CS植物表達載體同樣雙酶切后進行連接，轉化，篩選陽性克隆子，電泳檢測并測序驗證，植物表達載體PCAMBIA2300-35S-CP正反-0CS、pCAMBIA2300-35S-Hc-Pro 正反-OCS、pCAMBIA2300_35S_NIb 正反-OCS 構建成功。
[0037]本發(fā)明的技術優(yōu)勢和有益效果:
[0038]1、本發(fā)明米用RNAi技術，設計番木瓜環(huán)斑病毒CP、Hc-Pro> NIb保守區(qū)域反向重復發(fā)夾結構，使之能夠高效快速穩(wěn)定的產生dsRNA，與傳統(tǒng)轉病毒全長CP或RP等基因產生dsRNA相比，RNAi技術的抗病毒效率更高。
[0039]2、本發(fā)明提供的番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)中外殼蛋白基因(CP)、輔助成分蛋白基因(Hc-Ρι?)、復制酶基因(NIb)，是番木瓜環(huán)斑病毒自身繁殖、復制、侵染相關蛋白的重要編碼基因，分別將其構建成高效、穩(wěn)定抗病毒植物表達載體，通過基因槍或農桿菌介導的遺傳轉化，引入到番木瓜的抗病基因工程育種中，將其功能蛋白在mRNA水平進行阻斷，可以有效抑制病毒的繁殖、復制和擴散，使外源的病毒不能侵染轉基因抗病毒植株，達到抗病毒的效果。
[0040]3、本發(fā)明構建的番木瓜抗PRSV病毒植物表達載體pCAMBIA2300-35S-CP正反-OCS、pCAMBIA2300-35S-Hc-Pro 正反-OCS、pCAMBIA2300_35S_NIb 正反-OCS 為首次報道，通過基因槍或農桿菌介導的遺傳轉化，可創(chuàng)造高效、廣譜抗PRSV病毒病的新種質。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為番木瓜環(huán)斑病毒PRSV功能基因CP、Hc-Pro、NIb的共同保守區(qū)域分析圖譜；
[0042]圖2為CP、Hc-Pro、NIb基因干擾片段正向序列與反向序列PCR擴增；
[0043]圖3 為重組質粒 pRNAil017-CP 正、pRNAil017_Hc-pro 正、pRNAil017_NIb 正，經Xho I和Bgl II雙酶切 ；
[0044]圖4 為重組質粒 pRNAil017-CP 正反、pRNAil017_Hc-pro 正反、pRNAil017_NIb 正反經Sal I和Pst I雙酶切；
[0045]圖5為抗PRSV病毒植物轉基因載體雙酶切。
【具體實施方式】
[0046]下面結合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0047]實施例一:番木瓜環(huán)斑病毒CP、Hc-Pro和NIb基因保守區(qū)域分析
[0048]于2011年6月在海南島番木瓜主要種植區(qū)昌江、樂東、澄邁、文昌和三亞等地采集番木瓜疑似病毒樣品葉片(主要以幼嫩葉片上可見到明顯斑駁畸形的病狀為基準采集病葉)，共采集待測樣品76份(采集樣品均來自不同地點或同一地點相隔500m以內，所有樣品地點采用GPS定位，樣品采回以后置-80°C保存?zhèn)溆?。分別提取樣品葉片的總RNA，經Random引物反轉錄后，分別用表1所列引物進行PCR擴增，分子檢測(檢測存在的番木瓜環(huán)斑病毒CP、Hc-Pro和NIb基因的遺傳多樣性)，檢測到番木瓜環(huán)斑病毒PRSV的樣品有59個，即番木瓜環(huán)斑病毒病檢出率為59/76=77.63%，因此番木瓜環(huán)斑病毒PRSV是影響海南地區(qū)番木瓜產業(yè)健康發(fā)展的主要病毒病。
[0049]發(fā)明人將檢測到的PRSV樣品進行分子克隆測序，以PRSV病毒基因組CP、Hc-Pro和NIb作為靶標基因，Blast比對GenBank數(shù)據庫中的PRSV核苷酸信息，通過序列比對和運用Clustalx軟件分析，挑選出最具有典型的PRSV病毒CP、Hc-Pro和NIb基因的代表樣品，序列分析圖譜如附圖1所示，(a)番木瓜環(huán)斑病毒PRSV功能基因CP的共同保守區(qū)域分析，(b)番木瓜環(huán)斑病毒PRSV功能基因Hc-Pio的共同保守區(qū)域分析，(c)番木瓜環(huán)斑病毒PRSV功能基因NIb的共同保守區(qū)域分析。由圖中看出代表樣品具有海南番木瓜環(huán)斑病毒PRSV功能基因的共同保守區(qū)域特點，可作為設計番木瓜環(huán)斑病毒CP、Hc-Pro和NIb基因廣譜抗病毒植物表達載體的模板。
[0050]表1番木瓜花葉病檢測PCR弓丨物
[0051]
【權利要求】
1.一種番木瓜環(huán)斑病毒基因，其特征在于:所述番木瓜環(huán)斑病毒基因為CP、Hc-Pro,NIb基因，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
2.—種權利要求1所述的番木瓜環(huán)斑病毒基因的RNAi表達載體的構建方法，其特征在于:是以感染番木瓜環(huán)斑病毒番木瓜葉片為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA，以核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 所示的 CP 基因、Hc-Pro 基因、NIb基因為模板，設計特異性引物，用高保真Taq酶進行PCR反應，在CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段分別引入XhoI和BglII酶切位點，在CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段分別引入BamHI和SalI酶切位點，引物序列如下: CP正向序列:酶切位點XhoI和BglII
PRSV-CP-RNA1-Pl:5， -CCCTCGAGTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
PRSV-CP-RNA1-P2:5， -GAAGATCTTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3， 基因大小544bp CP反向序列:酶切位點SalI和BamHI
PRSV-CP-RNA1-P3:5， -GCGTCGACTCAACGCCGGAACTAGTGGAACTT-3，
PRSV-CP-RNA1-P4:5， -CGGGATCCTCACGAGCCCTATCAGGTGTCTTT-3， Hc-Pro正向序列:酶切位點XhoI和BglII PRSV-Hcpro-RNA1-Pl:5’ -CCCTCGAGTGAATGCACGTAACATGAACGA-3’`
PRSV-Hcpro-RNA1-P2:5， -GAAGATCTACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3， 基因大小484bp Hc-Pro反向序列:酶切位點SalI和BamHI PRSV-Hcpro-RNA1-P3:5， -GCGTCGACTGAATGCACGTAACATGAACGA-3，
PRSV-Hcpro-RNA1-P4:5， -CGGGATCCACCATTTGCTGCCGAAACCTCT-3， NIb正向序列:酶切位點XhoI和BglII
PRSV-NIb-RNA1-Pl:5’ -CCCTCGAGCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3’
PRSV-NIb-RNA1-P2:5，-GAAGATCTACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3， 基因大小424bp NIb反向序列:酶切位點SalI和BamHI
PRSV-NIb-RNA1-P3:5， -GCGTCGACCTTTGTATTGCCATTCACCCAGAT-3，
PRSV-NIb-RNA1-P4:5，-CGGGATCCACTCATCCATAGAACCACGCTCAC-3， 將PCR產物連接到PMD18-T Simple載體，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質粒，由XhoI和BglII雙酶切得到的CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段，與XhoI和BglII雙酶切的pRNAil017連接，轉化，篩選陽性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質粒，經BamHI和SalI雙酶切與CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段進行連接，轉化，篩選陽性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質粒，經PstI和SalI雙酶切與PCAMBIA2300-35S-0CS植物表達載體同樣雙酶切后進行連接，轉化，篩選陽性克隆子，電泳檢測并測序驗證，植物表達載體PCAMBIA2300-35S-CP正反-0CS、pCAMBIA2300-35S-Hc-Pro 正反-OCS、pCAMBIA2300_35S_NIb 正反-OCS 構建成功。
【文檔編號】C12N15/83GK103484480SQ201310440173
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權日:2013年9月25日
【發(fā)明者】趙輝, 張雨良, 賈瑞宗, 朱蕓, 曾會才, 孔華, 彭明 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所