用于增加韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)量的攜氧劑及其應用的制作方法
【專利摘要】用于增加韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)量的攜氧劑及其應用。韋蘭膠是由鞘氨醇單胞菌合成并分泌到胞外的一類高分子微生物多糖。因其具備優(yōu)良的假塑流變性、懸浮與乳化性、兼容性、穩(wěn)定性而日益受到關(guān)注。在鞘氨醇單胞菌TP-5（保藏號CGMCCNo.3097）發(fā)酵初期，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.05%（m/v）的TritonX-100、0.2%（m/v）的Tween-20、0.2%（m/v）的Tween-40或0.3%（m/v）的Tween-80，能使韋蘭膠的產(chǎn)量分別提高21.80%、22.73%、36.62%和28.12%。表面活性劑類攜氧劑可望應用于韋蘭膠等高粘度多糖的發(fā)酵工業(yè)中。
【專利說明】用于增加韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)量的攜氧劑及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，它涉及幾種發(fā)酵過程中可能會影響韋蘭膠產(chǎn)量的攜氧功能物質(zhì)，及其在高粘度生物多糖發(fā)酵生產(chǎn)中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]韋蘭膠(welan gum)也被稱為威倫膠、溫輪膠、威蘭膠或沃倫膠,是鞘氨醇單胞菌{Sphingomonas sp.TP-5)以碳水化合物為主要原料經(jīng)好氧發(fā)酵合成的一種鞘氨醇膠類聚合物。韋蘭膠的結(jié)構(gòu)骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖的單元組成，側(cè)鏈由單鏈的L-甘露糖或單鏈的L-鼠李糖構(gòu)成。由于其具有優(yōu)良的增粘性、獨特的假塑流變性、懸浮和乳化性、酸堿穩(wěn)定性及耐溫性，使得韋蘭膠在石油開采、食品、醫(yī)藥、化妝品及建筑行業(yè)等多個領(lǐng)域中具有廣泛的應用前景。
[0003]韋蘭膠是美國Kelco公司80年代繼黃原膠、結(jié)冷膠之后開發(fā)的最有市場前景的微生物多糖之一，迄今為止美國的Kelco公司是韋蘭膠全球唯一的生產(chǎn)、供應商，且年供應量只有I萬噸，遠達不到韋蘭膠的實際需求量，供小于求，使得韋蘭膠的市場價格居高不下。同時巨大的商業(yè)利潤使韋蘭膠的生產(chǎn)技術(shù)被壟斷，有關(guān)其工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的論文與專利鮮有報道。而目前國外對于韋蘭膠的報道大多集中在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及應用方面，而在發(fā)酵和生產(chǎn)方面的報道很少。我國近年開始對韋蘭膠的發(fā)酵生產(chǎn)及特性進行研究，然而其工業(yè)化進程卻十分緩慢，這主要是由于韋蘭膠的發(fā)酵成本高、單位產(chǎn)率低等因素所致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決韋蘭膠等高粘度多糖的發(fā)酵生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量偏低的問題，提供幾種適合在培養(yǎng)基中添加的用于增加韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)量的攜氧劑，及其在高粘度多糖的發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域的應用。
[0005]本發(fā)明提供的一株鞘氨醇單胞菌ΤΡ-5 (保藏號CGMCC N0.3097，該菌株已在ZL200910069960.2號專利中公開)發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠過程中添加的攜氧劑，所述的攜氧劑為表面活性劑類攜氧劑 TritonX-100、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80。
[0006]發(fā)酵初期，在發(fā)酵培養(yǎng)基(m/v)(蔗糖44.68g/L, Na2HPO4 9.28g/L, CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaN03 4g/L、MgS04 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L,ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L和NiSO4 0.02mmol/L構(gòu)成的微量元素溶液ImL)中分別添加0.05%(m/v)的 TritonX-100,0.2% (m/v)的 Tween-20,0.2% (m/v)的 Tween-40 或 0.3% (m/v)的Tween-80，能使韋蘭膠的產(chǎn)量分別提高21.80%,22.73%,36.62%和28.12%。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:
本發(fā)明主要是從發(fā)酵工程的角度出發(fā)，提供一類發(fā)酵過程中可能會影響韋蘭膠產(chǎn)量的攜氧功能物質(zhì)，旨在最大限度的提高產(chǎn)量，為最終實現(xiàn)韋蘭膠的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。隨著人們對高粘度生物多糖發(fā)酵技術(shù)的不斷進步，本發(fā)明的應用可使韋蘭膠的產(chǎn)量不斷提高，并有助于進一步降低生產(chǎn)成本，擴大應用范圍，因此具有很好的發(fā)展前景。。[0008]
【專利附圖】

【附圖說明】[0009]圖1是鞘氨醇單胞菌sp.TP-5的搖瓶發(fā)酵曲線；
圖2是不同氧載體對韋蘭膠發(fā)酵的影響；
圖3是添加正十二烷對韋蘭膠發(fā)酵的影響；
圖4是不同表面活性劑對韋蘭膠發(fā)酵的影響；
圖5是不同表面活性劑加入量對韋蘭膠發(fā)酵的影響；
圖6是H2O2的添加時間對韋蘭膠發(fā)酵的影響；
圖7是H2O2的加入量對韋蘭膠發(fā)酵的影響。
[0010]
【具體實施方式】
[0011]實施例1韋蘭膠的發(fā)酵生產(chǎn)
取-80 °C甘油管保藏的鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.TP-5 (保藏號為CGMCCN0.3097，該菌株已在ZL200910069960.2號專利中公開)平板劃線，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)3d ;用無菌接種環(huán)挑取長勢良好的單菌落在裝有LB斜面培養(yǎng)基(m/v)(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉1%，瓊脂1.5%，pH 7.2 ;121°C滅菌20分鐘后降至50°C后將試管傾斜20度待冷卻到室溫后即成斜面)的試管中劃之字線，30°C恒溫培養(yǎng)3d ;從活化的LB斜面培養(yǎng)基上挑兩環(huán)菌體到裝有5mL LB液體培養(yǎng)基(m/v)(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉1%，ρΗ 7.2 ;121°C滅菌20分鐘)的試管中振蕩培養(yǎng)，至試管中菌液變渾濁，以此作為一級種子液，接到內(nèi)裝200mL種子培養(yǎng)基(m/v)(蔗糖15g/L，蛋白胨2.5 8/1，酵母粉1.5 g/L，(NH4)2HPO4 1.5 g/L,K2HPO4 2.5 g/L,MgSO4 0.01 g/L,pH 7，121°C滅菌 30min)的 500mL 三角瓶中，搖床設(shè)置為溫度30°C，轉(zhuǎn)速200rpm，振蕩培養(yǎng)24小時；將培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接入裝有 IOOmL 發(fā)酵培養(yǎng)基(m/v)(蔗糖 44.68g/L,Na2HPO4 9.28g/L, CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaN03 4g/L、MgS04 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L,ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L和NiSO4 0.02mmol/L構(gòu)成的微量元素溶液lmL)的500mL三角瓶中，置于往復式恒溫搖床中，30°C，115rpm，振蕩培養(yǎng)3天左右。
[0012]由圖1搖瓶發(fā)酵曲線可知，整個發(fā)酵過程中pH略有降低；(Tl4h主要是TP-5菌體的生長繁殖和為合成產(chǎn)物的準備階段，未合成韋蘭膠，且開始發(fā)酵液只是培養(yǎng)基溶液，粘度較低；14l0h主要韋蘭膠產(chǎn)量快速增長的階段，14h左右開始合成韋蘭膠，發(fā)酵液粘度隨之開始增大，與韋蘭膠的產(chǎn)量呈正相關(guān)；24h后菌株TP-5產(chǎn)膠率迅速增加，發(fā)酵液粘度也隨之迅速增長；40h之后進入發(fā)酵后期發(fā)酵液粘度較高，溶氧不足，韋蘭膠的產(chǎn)量開始緩慢增長；發(fā)酵進行到66h產(chǎn)物量達到最大值，粘度值也接近最大值，葡萄糖幾乎耗盡，72h之后粘度不再顯著增大，最大值達3588mPa.s ;再繼續(xù)發(fā)酵不利于韋蘭膠的合成，并會增加生產(chǎn)成本。因此，控制發(fā)酵周期在66h左右，此時產(chǎn)量為18.05g/L。
[0013]實施例2烷烴類氧載體對韋蘭膠發(fā)酵的影響
發(fā)酵初始時，在發(fā)酵培養(yǎng)基(m/v)(蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaN03 4g/L、MgS04 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L,ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L和NiSO4 0.02mmol/L構(gòu)成的微量元素溶液ImL)中添加不同氧載體,探究它們在不同濃度下對韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)量的影響，本實驗以液態(tài)烷烴(包括正庚烷、正己烷、正十二烷、正十六烷)和豆油為氧載體，加入量控制在0-20%之間，發(fā)酵70h，用3倍體積的乙醇提取。正十六烷與豆油不溶于乙醇，乙醇提取后會有一部分的正十六烷和豆油吸附在產(chǎn)物中，再用適量的正己烷萃取加以去除。
[0014]結(jié)果由圖2可知，發(fā)酵體系中添加正己烷不能提高韋蘭膠的產(chǎn)量，而加入正庚烷后發(fā)酵液中幾乎不產(chǎn)膠，說明正己烷和正庚烷都不適宜作為韋蘭膠發(fā)酵的氧載體。正十二烷、正十六烷和豆油都能很大程度上提高韋蘭膠的產(chǎn)量，且添加正十二烷的效果最佳。分別添加10%的正十二烷，10%正十六烷，5%的豆油均能起到較好的增產(chǎn)效果，產(chǎn)量分別提高了75.63%,51.15% 和 69.93%。
[0015]發(fā)酵初始時，加入不同量的正十二烷，加入量控制在5~10%，考察加入正十二烷后，對韋蘭膠產(chǎn)量及發(fā)酵液表觀粘度的影響。結(jié)果如圖3所示，整體上添加正十二烷后，韋蘭膠的產(chǎn)量和發(fā)酵液表觀粘度都有所增高，其中加入9%的正十二烷時發(fā)酵液表觀粘度最大，達5629mPa.s ;加入10%時產(chǎn)量值最大，達28.5 g/L。
[0016]實施例3表面活性劑對韋蘭膠發(fā)酵的影響
發(fā)酵初期，在發(fā)酵培養(yǎng)基(m/v)(蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaNO3 4g/L、MgSO4 0.8g/L,以及由 FeCl2 0.0036mmol/L、ZnSO4 0.0lmmol/L、MnCl2 0.0lmmol/L 和 NiSO4 0.02mmol/L 構(gòu)成的微量元素溶液 lmL)中添加 0.1% 的 Span-20、Tween-20、Tween-40> Tween-80和TritonX-100,探究不同種類的表面活性劑對韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖4所示，加入Span-20后未能提高韋蘭膠產(chǎn)量，其他幾種表面活性劑Tween-20、Tween-40> Tween-80和TritonX-100均能不同程度的提高韋蘭膠的產(chǎn)量。
[0017]在發(fā)酵初始，加入幾種不同的表面活性劑，將加入量控制在0.01%~0.3%之間，探究不同種類的表面活性劑在不同濃度時對韋蘭膠產(chǎn)量的影響。由圖5所示，這幾種表面活性劑在合適的加入量時均能有效`提高韋蘭膠的產(chǎn)量，且Tween-40的效果較明顯。分別添加0.05% 的 TritonX-100,0.2% 的 Tween-20,0.2% 的 Tween-40,0.3% 的 Tween-80 均能對韋蘭膠的發(fā)酵起到良好的增產(chǎn)效果，且產(chǎn)量提高率分別為21.80%,22.73%,36.62%和28.12%。
[0018]實施例4添加H2O2對韋蘭膠發(fā)酵的影響
根據(jù)不同階段韋蘭膠發(fā)酵的不同特點，選擇在0h、llh、23h、35h、48h和58h時分別在發(fā)酵培養(yǎng)基(m/v)(蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaNO34g/L,MgSO4 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L、ZnSO4 0.0lmmol/L,MnCl2 0.0lmmol/L 和NiSO4 0.02mmol/L構(gòu)成的微量元素溶液ImL)中添加0.1%的H2O2，探究不同時間添加H2O2對韋蘭膠的產(chǎn)量和發(fā)酵液表觀粘度的影響。結(jié)果如圖6所示，與不添加H2O2的對照組相比，無論在哪個階段添加H2O2，韋蘭膠的產(chǎn)量都有小幅度的增加，且對發(fā)酵液表觀粘度的影響不大。其中在35h和48h發(fā)酵的中后期添加，對產(chǎn)量的影響效果較好。
[0019]將H2O2的加入量控制在0.025%~?%的范圍內(nèi)，在發(fā)酵35h時添加不同量的H2O2,探究不同量的H2O2對韋蘭膠的產(chǎn)量和粘度的影響。結(jié)果如圖7所示，加入量超過0.5%后，發(fā)酵70h后，發(fā)酵液中沒有膠物質(zhì)產(chǎn)生且發(fā)酵液仍澄清。這表明加入的量過大不只會抑制韋蘭膠的合成也會影響菌體的生存繁殖?？刂萍尤肓吭?.075%以內(nèi)，隨著加入量的增加，產(chǎn)量有小幅度的增加，粘度值影響不甚明顯，加入的H2O2為0.075%時，韋蘭膠產(chǎn)量提高的最明顯，提高率為16.42%。
【權(quán)利要求】
1.用于增加韋蘭膠發(fā)酵產(chǎn)量的攜氧劑，所述的攜氧劑為表面活性劑類攜氧劑TritonX-100、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80。
2.如權(quán)利要求1所述的表面活性劑類攜氧劑在韋蘭膠發(fā)酵中的應用，其特征在于，發(fā)酵初期，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.05% (m/v)的TritonX-100、0.2% (m/v)的Tween-20、0.2% (m/v)的Tween-40或0.3% (m/v)的Tween-80,能使韋蘭膠的產(chǎn)量分別提高21.80%、22.73%、36.62% 和 28.12%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述表面活性劑類攜氧劑的應用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(m/v):蔗糖 44.68g/L，Na2HPO4 9.28g/L，CaCO3 4.65g/L，玉米蛋白粉 lg/L、NaNO34g/L,MgSO4 0.8g/L，以及由 FeCl2 0.0036mmol/L、ZnSO4 0.01mmol/L,MnCl2 0.0lmmol/L 和NiSO4 0.02mmol/L構(gòu)成的.微量元素溶液lmL。
【文檔編號】C12R1/01GK103468762SQ201310440981
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】馬挺, 李國強, 羅影, 吳萌萌, 周潔芳 申請人:南開大學