表達(dá)重組人血白蛋白的酵母菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用和表達(dá)重組人血白蛋白的方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，涉及一種表達(dá)重組人血白蛋白的巴斯德畢赤酵母菌、所述巴斯德畢赤酵母菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用，以及利用該巴斯德畢赤酵母菌表達(dá)重組人血白蛋白的方法。本發(fā)明利用交配單倍體酵母菌獲得二倍體巴斯德畢赤酵母菌，所述二倍體菌含有兩個(gè)染色體組，兩個(gè)染色體組均包含人血白蛋白成熟肽編碼序列，但分別包含不同的篩選標(biāo)記。利用二倍體菌株具有兩個(gè)染色體組的性質(zhì)高效表達(dá)重組人血白蛋白，本發(fā)明有效地解決了現(xiàn)有技術(shù)中表達(dá)菌株構(gòu)建周期長(zhǎng)、重組人血白蛋白表達(dá)量偏低等問(wèn)題?！緦?zhuān)利說(shuō)明】表達(dá)重組人血白蛋白的酵母菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用和表達(dá)重組人血白蛋白的方法【
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】[0001]本發(fā)明屬于生物【
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】，具體涉及一種高效表達(dá)重組人血白蛋白的巴斯德畢赤酵母菌，所述巴斯德畢赤酵母菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用，以及利用所述巴斯德畢赤酵母菌表達(dá)重組人血白蛋白的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]人血白蛋白(HSA)是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的40%~60%，在體內(nèi)起著維持血漿膠體滲透壓、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)等重要作用。人血白蛋白臨床上主要用于失血?jiǎng)?chuàng)傷、燒傷引起的休克、腦水腫及損傷引起的顱壓升高、肝硬化及腎病引起的水腫或腹水；在心肺分流術(shù)、燒傷的輔助治療、血液透析的輔助治療及成人呼吸窘迫綜合征中也有廣泛應(yīng)用，是醫(yī)院臨床急救或重癥手術(shù)的必備藥品，在醫(yī)院市場(chǎng)一直占據(jù)舉足輕重的地位。人血白蛋白通常由血漿提取。由于漿站改制及血液制品安全監(jiān)管力度的加強(qiáng)等諸多因素的影響，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)以人血白蛋白為代表的血液制品供應(yīng)嚴(yán)重短缺，供需矛盾問(wèn)題突出。采用基因工程方法生產(chǎn)重組人血白蛋白具有原料來(lái)源豐富、質(zhì)量可控、可形成規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可以徹底消除病毒污染危險(xiǎn)，對(duì)于緩解國(guó)內(nèi)人血白蛋白供不應(yīng)求的局面、消除血源產(chǎn)品的安全風(fēng)險(xiǎn)具有十分重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義，具有廣闊的發(fā)展空間和市場(chǎng)前景。[0003]目前，重組人血白蛋白已經(jīng)在巴斯德畢赤酵母(日本三菱制藥株式會(huì)社)的表達(dá)系統(tǒng)獲得成功表達(dá)及生產(chǎn)，相關(guān)藥物已上市銷(xiāo)售(商品名Medway")。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)體系，是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，與現(xiàn)有的其它表達(dá)系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分秘、翻譯后修飾以及糖基化修飾等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，而且培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離，現(xiàn)已廣泛用于外源蛋白的表達(dá)。[0004]巴斯德畢赤酵母通常是以單倍體形式存在，當(dāng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)限制時(shí)，2個(gè)單倍體細(xì)胞通過(guò)交配融合成二倍體，但是在營(yíng)養(yǎng)貧瘠時(shí)，二倍體傾向于以有性生殖方式進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)生單倍體的子囊孢子。基于目前大部分產(chǎn)品劑量較小，單倍體巴斯德畢赤酵母已經(jīng)具有較好的表達(dá)效率，可以滿(mǎn)足大部分產(chǎn)品的生產(chǎn)需求。而二倍體巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建成本可能比較高、構(gòu)建過(guò)程可能比較復(fù)雜，目前對(duì)于二倍體巴斯德畢赤酵母菌的研究?jī)H限于遺傳學(xué)研究，幾乎沒(méi)有采用其進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的研究報(bào)道。[0005]現(xiàn)有技術(shù)中，通常采用增加插入酵母基因組中目的蛋白表達(dá)盒拷貝數(shù)的方法提高表達(dá)量，如對(duì)表達(dá)菌株進(jìn)行多次電擊轉(zhuǎn)化或是不斷提高表達(dá)菌株的抗性篩選濃度(無(wú)抗性標(biāo)記的菌株不適用)等。但此類(lèi)方法需要耗費(fèi)大量的時(shí)間來(lái)對(duì)大量的重組子進(jìn)行鑒定和篩選，同時(shí)結(jié)果具有不可預(yù)測(cè)性，操作復(fù)雜，成本較高?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)重組人血白蛋白的二倍體巴斯德畢赤酵母菌及其制備方法，所述方法能夠低成本、便捷地制備二倍體巴斯德畢赤酵母菌，所述二倍體巴斯德畢赤酵母菌能夠高效表達(dá)重組人血白蛋白，有效解決現(xiàn)有技術(shù)中表達(dá)菌株構(gòu)建周期長(zhǎng)、表達(dá)量偏低等問(wèn)題。[0007]在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種二倍體巴斯德畢赤酵母菌，所述二倍體巴斯德畢赤酵母菌含有兩個(gè)染色體組，兩個(gè)染色體組均包含人血白蛋白成熟肽編碼序列但分別包含不同的篩選標(biāo)記。[0008]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建表達(dá)重組人血白蛋白的二倍體巴斯德畢赤酵母菌的方法，所述方法使用兩種均含有人血白蛋白成熟肽編碼序列但具有不同篩選標(biāo)記的單倍體巴斯德畢赤酵母菌，通過(guò)將兩種單倍體巴斯德畢赤酵母菌進(jìn)行交配獲得二倍體巴斯德畢赤酵母菌。[0009]在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的二倍體巴斯德畢赤酵母在表達(dá)重組人血白蛋白中的應(yīng)用。[0010]在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)重組人血白蛋白的方法，所述方法包括發(fā)酵本發(fā)明的二倍體巴斯德畢赤酵母菌。[0011]利用交配方法進(jìn)行二倍體巴斯德畢赤酵母菌株的選育，在短期內(nèi)便可得到拷貝數(shù)不低于2的二倍體巴斯德畢赤酵母菌株，這無(wú)論是從篩選時(shí)間上還是工作量上都要少于上述常規(guī)方法。選育的二倍體菌株可以穩(wěn)定存在并且高效表達(dá)重組人血白蛋白，所表達(dá)的蛋白結(jié)構(gòu)正確。本發(fā)明大幅度的提聞了表達(dá)效率，與現(xiàn)有的常規(guī)生廣菌株相比，表達(dá)量大幅度提高；且本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)?！緦?zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0012]圖1為實(shí)施例1中載體pUC57_Alb結(jié)構(gòu)示意圖。[0013]圖2為實(shí)施例2中重組表達(dá)載體pPIC9K_AlbN結(jié)構(gòu)示意圖。[0014]圖3為實(shí)施例3中重組表達(dá)載體pPIC9_AlbN結(jié)構(gòu)示意圖。[0015]圖4為實(shí)施例4中重組表達(dá)載體pPIC9_AlbA結(jié)構(gòu)示意圖。[0016]圖5為實(shí)施例5中重組表達(dá)載體pPICZa-AlbA結(jié)構(gòu)示意圖。[0017]圖6為實(shí)施例8中各二倍體菌株、單倍體對(duì)照菌株GS115_AlbN及陰性對(duì)照菌株GS115的搖瓶表達(dá)量分析結(jié)果圖，其中縱坐標(biāo)代表重組人血白蛋白的表達(dá)量(mg/L)。[0018]圖7為實(shí)施例9中二倍體菌株MFD2和單倍體對(duì)照菌株GS115_AlbN在100L發(fā)酵規(guī)模上的重組人血白蛋白表達(dá)量增長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。其中，橫坐標(biāo)代表發(fā)酵周期(小時(shí))，縱坐標(biāo)代表表達(dá)量(g/L)，“一?一”代表MFD2菌株表達(dá)量，“一”代表GS115-AlbN菌株表達(dá)量。[0019]圖8為實(shí)施例10中所得樣品的HPLC純度結(jié)果圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0020]在本申請(qǐng)文件中，單倍體巴斯德`畢赤酵母菌是指含有一個(gè)染色體組的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞，二倍體巴斯德畢赤酵母菌是指含有兩個(gè)染色體組的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。[0021]本發(fā)明中的人血白蛋白編碼序列(SEQIDNO:1)具體信息來(lái)自于GenBank公開(kāi)的序列(登錄號(hào):AY728024.1)，所述人血白蛋白編碼序列包括5’酶切位點(diǎn)、人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列(SEQIDN0:2)和人血白蛋白成熟肽編碼序列(SEQIDN0:3)和3’酶切位點(diǎn)。本文中所稱(chēng)的人血白蛋白成熟肽編碼序列即為SEQIDN0:3所示序列。[0022]在第一個(gè)方面，本發(fā)明的二倍體巴斯德畢赤酵母菌含有兩個(gè)染色體組，兩個(gè)染色體組均包含人血白蛋白成熟肽編碼序列但包含不同的篩選標(biāo)記。[0023]所述篩選標(biāo)記可以均選自營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記或均選自抗生素篩選標(biāo)記。在一種實(shí)施方式中，其中一個(gè)染色體組含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和/或抗生素篩選標(biāo)記，另一個(gè)染色體組含有與第一個(gè)染色體組不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和/或抗生素篩選標(biāo)記?；蛘?，在另一種實(shí)施方式中，其中一個(gè)染色體組同時(shí)含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和抗生素篩選標(biāo)記，另一個(gè)染色體組不含任何篩選標(biāo)記。[0024]優(yōu)選地，所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記選自磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰羧胺合成酶基因ADE系列，磷酸乳清酸脫羧酶基因URA3，乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因URA5，精氨酸合成途徑基因ARG系列，組氨酸合成途徑基因HIS系列，賴(lài)氨酸合成途徑基因LYS系列，蛋氨酸合成途徑基因MET系列或脯氨酸合成途徑基因PRO系列。[0025]優(yōu)選地，所述抗生素篩選標(biāo)記選自印度斯坦異壁鏈霉菌(Streptoalloteichushindustanus)的Shble基因(Zeocin抗性)，土曲霉(Aspergillusterrus)的殺稻痕素-S-脫氨酶基因(殺稻瘟素抗性)，轉(zhuǎn)座子Tn903的卡那霉素抗性基因(G418抗性)或吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的Hph基因(潮霉素抗性)。[0026]優(yōu)選地，所述兩個(gè)染色體組分別來(lái)自于兩種均含有人血白蛋白成熟肽編碼序列、但具有不同的篩選標(biāo)記的單倍體巴斯德畢赤酵母菌；進(jìn)一步優(yōu)選地，通過(guò)兩種單倍體巴斯德畢赤酵母菌的交配獲得所述二倍體巴斯德畢赤酵母菌。[0027]優(yōu)選地，所述人血白蛋白成熟肽編碼序列以包含在基因表達(dá)盒中的形式存在于表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體還包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和/或抗生素篩選標(biāo)記基因，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞后通過(guò)篩選獲得單倍體巴斯德畢赤酵母菌。所述表達(dá)載體選自pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pA0815、pGAPZa、pPICZa或它們的衍生載體，優(yōu)選地所述表達(dá)載體為PPIC9、pPIC9K或pPICZα。[0028]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述包含人血白蛋白成熟肽編碼序列的基因表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)從5’到3’依次包括:啟動(dòng)子序列、信號(hào)肽序列、人血白蛋白成熟肽編碼序列和終止子序列。這些序列可操作性地相連。所述啟動(dòng)子選自AOXl啟動(dòng)子、A0X2啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、FLDl啟動(dòng)子、PEX8啟動(dòng)子或YPTl啟動(dòng)子，優(yōu)選AOXl啟動(dòng)子。所述信號(hào)肽序列選自α因子信號(hào)肽序列或人血白蛋白信號(hào)肽序列。所述終止子序列可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適用的終止子序列。[0029]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞是GS115(his4，Mut+)或X33。但本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，很多其它已知的巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞都可以應(yīng)用于本發(fā)明，而不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。[0030]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述二倍體巴斯德畢赤酵母菌是本發(fā)明的MFD1-7菌株。[0031]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供構(gòu)建表達(dá)重組人血白蛋白的二倍體巴斯德畢赤酵母菌的方法。[0032]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法中使用的單倍體巴斯德畢赤酵母菌通過(guò)以下方法構(gòu)建:[0033](I)獲得人血白蛋白成熟肽編碼序列，如可以通過(guò)全基因合成法或通過(guò)PCR法獲得;[0034](2)將獲得的編碼序列插入到一種或多種表達(dá)載體中，得到含有人血白蛋白基因表達(dá)盒的載體；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體包含一種或多種篩選標(biāo)記；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述篩選標(biāo)記選自如上文第一方面所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記或抗生素篩選標(biāo)記；所述表達(dá)載體是如上文第一方面所述的具體表達(dá)載體；[0035](3)將步驟(2)得到的載體線(xiàn)性化，如通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切，電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選獲得單倍體巴斯德畢赤酵母菌；優(yōu)選地，所述巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞是GS115(his4，Mut+)或X33。[0036]進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的構(gòu)建二倍體巴斯德畢赤酵母菌的方法包括將兩種單倍體巴斯德畢赤酵母菌作為親本在平板上進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)。[0037]在利用本發(fā)明的二倍體巴斯德畢赤酵母菌表達(dá)重組人血白蛋白時(shí)，可以利用本領(lǐng)域公知的方法培養(yǎng)本發(fā)明的酵母菌。在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，為保證二倍體畢赤酵母能夠穩(wěn)定表達(dá)重組人血白蛋白，優(yōu)選地，在發(fā)酵后期補(bǔ)加蛋白胨。[0038]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不限于以下具體實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。[0039]本發(fā)明所用的原材料及來(lái)源如下所示。如未特別說(shuō)明，使用的原材料、試劑、儀器均是可以從常規(guī)化學(xué)或生物試劑生產(chǎn)商處可購(gòu)買(mǎi)的。[0040]DNA聚合酶、DNA連接酶和限制性?xún)?nèi)切酶均為NEB公司產(chǎn)品。[0041]質(zhì)粒抽提試劑盒與膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。[0042]單倍體巴斯德畢赤酵母宿主菌GS115(his4，Mut+)和X33，表達(dá)載體pPIC9K、pPIC9和pPICZaA為Invitrogen公司產(chǎn)品。[0043]雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌MF14(his4，argl::CYC1TT)和MF54(his4,met2::CYClTT)根據(jù)JunjieYANG,WeihongJIANG,ShengYANG.mazFasacounter-selectablemarkerforunmarkedgeneticmodificationofPichiapastoris.FEMSYeastRes.2009，9(4):600-609構(gòu)建。[0044]基因序列的合成、引物合成以及基因測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成；PUC57載體由上海生工生物工程有限公司提供。[0045]質(zhì)譜分子量檢測(cè)、N末端序列分析、C末端序列分析及圓二色譜分析均由上海中科新生命生物科技有限公司完成。[0046]實(shí)施例1:人血白蛋白編碼序列的獲得[0047]參考GenBank公開(kāi)的“Homosapiensserumalbuminprecursor,mRNA,completecds”序列(登錄號(hào):AY728024.1)，委托上海生工生物工程有限公司合成本發(fā)明的人血白蛋白編碼序列(合成序列見(jiàn)SEQIDNO:1)。其中，該編碼序列的5’端包括有BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC，然后連接人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列(SEQIDNO:2)，再連接人血白蛋白成熟肽編碼序列(SEQIDNO:3)，在人血白蛋白成熟肽編碼序列的3’末端有EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC。將合成的DNA序列插入到pUC57載體上，命名為pUC57-Alb(載體結(jié)構(gòu)圖如附圖1所示)。[0048]實(shí)施例2:重組表達(dá)載體pPIC9K_AlbN的構(gòu)建[0049]用BamHI和EcoRI內(nèi)切酶將pUC57-Alb中帶有人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列及人血白蛋白成熟肽編碼序列的核酸片段切下，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收1800bp左右的核酸片段。用BamHI和EcoRI內(nèi)切酶將pPIC9K表達(dá)載體(Invitrogen,自帶α因子信號(hào)肽編碼序列、his4基因篩選標(biāo)記、卡那霉素抗性基因)中α因子信號(hào)肽編碼序列及多克隆位點(diǎn)序列切除，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收9000bp的載體骨架。將上述回收的載體骨架及核酸片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有100μg/ml氨芐青霉素抗性(Amp)的LB平板(10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，10g/l氯化鈉，15g/L瓊脂)篩選陽(yáng)性克隆。采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒制備質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒用5’AOX通用引物(SEQIDNO:4)和3’AOX通用引物(SEQIDNO:5)進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒中含有序列正確的人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列及人血白蛋白成熟肽編碼序列。將此載體命名為pPIC9K-AlbN(載體結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)附圖2)。該載體所包含的人血白蛋白基因表達(dá)盒由Α0Π啟動(dòng)子-人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列-人血白蛋白成熟肽編碼序列-AOXl終止子組成，該載體同時(shí)含有his4基因篩選標(biāo)記及卡那霉素抗性篩選基因(G418)。[0050]實(shí)施例3:重組表達(dá)載體pPIC9_AlbN的構(gòu)建[0051]用BamHI和EcoRI內(nèi)切酶將pUC57_Alb中帶有人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列及人血白蛋白成熟肽編碼序列的核酸片段切下，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收1800bp左右的核酸片段。用BamHI和EcoRI內(nèi)切酶將pPIC9表達(dá)載體(Invitrogen,自帶α因子信號(hào)肽序列、his4基因篩選標(biāo)記)中α因子信號(hào)肽編碼序列及多克隆位點(diǎn)序列切除，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收9000bp的載體骨架。將上述回收的載體骨架及核酸片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有100μg/ml氨芐青霉素抗性(Amp)的LB平板篩選陽(yáng)性克隆。采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒制備質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒用5’AOX通用引物(SEQIDNO:4)和3’AOX通用引物(SEQIDNO:5)進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒中含有序列正確的人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列及人血白蛋白成熟肽編碼序列。將此載體命名為pPIC9-AlbN(載體結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)附圖3)，該載體所包含的人血白蛋白基因表達(dá)盒由AOXl啟動(dòng)子-人血白蛋白信號(hào)肽編碼序列-人血白蛋白成熟肽編碼序列-AOXl終止子組成，同時(shí)該載體含有his4基因篩選標(biāo)記。`[0052]實(shí)施例4:重組表達(dá)載體pPIC9_AlbA的構(gòu)建[0053]用上游引物HsaUPl(SEQIDNO:6，含有EcoRI酶切位點(diǎn))和下游引物HsaDNUSEQIDNO:7，含有NotI酶切位點(diǎn))對(duì)pUC57-Alb質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得人血白蛋白成熟肽編碼序列的核酸片段。將此核酸片段用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收1800bp左右的核酸片段。然后與采用同樣酶切的PPIC9表達(dá)載體(Invitrogen,自帶α因子信號(hào)肽編碼序列、his4基因篩選標(biāo)記)連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含有100μg/ml氨芐青霉素抗性(Amp)的LB平板篩選陽(yáng)性克隆。采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒制備質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒用5’AOX通用引物(SEQIDNO:4)和3’AOX通用引物(SEQIDN0:5)進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒中含有序列正確的α因子信號(hào)肽編碼序列及人血白蛋白成熟肽編碼序列，將此載體命名為pPIC9-AlbA(載體結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)附圖4)，該載體所包含的人血白蛋白基因表達(dá)盒由AOXl啟動(dòng)子-α因子信號(hào)肽編碼序列-人血白蛋白成熟肽編碼序列-AOXl終止子組成，同時(shí)該載體含有his4基因篩選標(biāo)記。[0054]實(shí)施例5:重組表達(dá)載體pPICZa-AlbA的構(gòu)建[0055]用上游引物HsaUPl(SEQIDNO:6，含有EcoRI酶切位點(diǎn))和下游引物HsaDNUSEQIDNO:7，含有NotI酶切位點(diǎn))對(duì)pUC57-Alb質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得人血白蛋白成熟肽編碼序列核酸片段。將此核酸片段用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收1800bp左右的核酸片段，然后與采用同樣酶切的pPICZaA表達(dá)載體(Invitrogen,自帶α因子信號(hào)肽編碼序列及Zeocin抗性篩選標(biāo)記)連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有20μg/mlZeocin抗性的LB平板篩選陽(yáng)性克隆。采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒制備質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒用5’AOX通用引物(SEQIDNO:4)和3’AOX通用引物(SEQIDNO:5)進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒中含有序列正確的α因子信號(hào)肽編碼序列及人血白蛋白成熟肽編碼序列,將此載體命名為pPICZa-AlbA(載體結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)附圖5)，該載體所包含的人血白蛋白基因表達(dá)盒由AOXl啟動(dòng)子-α因子信號(hào)肽編碼序列-人血白蛋白成熟肽編碼序列-AOXl終止子組成，同時(shí)該載體含有Zeocin抗性篩選標(biāo)記。[0056]實(shí)施例6:含有人血白蛋白基因表達(dá)盒的單倍體巴斯德畢赤酵母工程菌的構(gòu)建[0057]將含有pPIC9K_AlbN表達(dá)載體的大腸桿菌DH5α陽(yáng)性克隆菌接種于含有100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集菌體，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒制備質(zhì)粒。取15μIpPIC9K-AlbN質(zhì)粒，用PmeI進(jìn)行酶切線(xiàn)性化。線(xiàn)性化的質(zhì)粒采用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化后置于-20°C保存?zhèn)溆谩Ａ砣“退沟庐叧嘟湍杆拗骶鶪S115(his4，Mut+)接種至含有3mlYPD液體培養(yǎng)基(10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)的試管中，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。取100μI的培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮YPD培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，30°C培養(yǎng)至0D540達(dá)到1.5。將巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞培養(yǎng)物于4°C，3000rpm離心5min,棄上清,加入30ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水清洗菌體,4°C,3000rpm離心5min,重復(fù)一次。加入Iml的冰預(yù)冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，取100μI分裝至無(wú)菌離心管中，置冰上備用。取10μI線(xiàn)性化的pPIC9K-AlbN載體加入到上述100μIGSl15感受態(tài)細(xì)胞中混勻，轉(zhuǎn)至冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中冰浴5min，用吸水紙吸干電轉(zhuǎn)化杯表面水分，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)化儀中，進(jìn)行電擊，電擊條件:電壓1500V，電容254?，電阻2000，電擊時(shí)間10ms。電擊完畢后，迅速加入Iml冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，將菌液涂布于MD平板(13.4g/L酵母氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，15g/L瓊脂)上，置于30°C倒置培養(yǎng)至單菌落克隆出現(xiàn)。挑取單菌落用5’AOX通用引物(SEQIDNO:4)和3’AOX通用引物(SEQIDNO:5)進(jìn)行PCR法擴(kuò)增人血白蛋白成熟肽編碼序列，所獲得的核酸片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收，并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的陽(yáng)性克隆命名為GS115-AlbN(G418K)。由于GS115_AlbN(G418K)單倍體菌株的基因組完整，不含營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，因此可以在工業(yè)用基本鹽培養(yǎng)基(85%磷酸26.7ml/L，硫酸鈣0.93g/L，硫酸鉀18.2g/L，七水硫酸鎂14.9g/L，氫氧化鉀4.13g/L)中培養(yǎng)，選用此菌株作為單倍體菌株進(jìn)行對(duì)照研究。[0058]采用上述相同的方法將pPIC9K_AlbN質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌MF14(his4,argl::CYClTT)，經(jīng)MDR平板(13.4g/L酵母氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，40mg/L精氨酸，15g/L瓊脂)篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確(針對(duì)人血白蛋白成熟肽編碼序列測(cè)序)的陽(yáng)性克隆命名為MF14K-AlbN(argl,G418K)。[0059]采用上述相同的方法將pPIC9_AlbA質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌GSl15(his4，Mut+)，經(jīng)MD平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為GS115-AlbA。[0060]采用上述相同的方法將pPIC9_AlbN質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌MF14(his4,argl::CYC1TT)，經(jīng)MDR平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為MFH-AlbN(argl)ο[0061]采用上述相同的方法將pPIC9_AlbN質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌MF54(his4,met2::CYClTT)，經(jīng)MDM平板(13.4g/L酵母氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，40mg/L蛋氨酸，15g/L瓊脂)篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為MF54-AlbN(met2)。[0062]采用上述相同的方法將pPIC9_AlbA質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌MF14(his4,argl::CYC1TT)，經(jīng)MDR平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為MFH-AlbA(argl)ο[0063]采用上述相同的方法將pPIC9_AlbA質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌MF54(his4,met2::CYC1TT),經(jīng)MDM平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為MF54_AlbA(met2)。[0064]采用上述相同的方法將pPICZa-AlbA質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌Χ33，用含有50μg/mlZeocin抗生素的YPD平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為X33-AlbZ(ZeocinE)0[0065]采用上述相同的方法將pPICZa-AlbA質(zhì)粒線(xiàn)性化后電擊轉(zhuǎn)化宿主菌GS115(his4，Mut+)，用含有50μg/mlZeocin抗生素的YPD平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為GS115-AlbZ(his4，ZeocinK)。[0066]實(shí)施例7:含有人血白蛋白基因表達(dá)盒的二倍體巴斯德畢赤酵母工程菌的構(gòu)建[0067]單倍體菌株MF14-AlbN(argl)由于argl基因缺失,導(dǎo)致自身無(wú)法合成精氨酸，同理MF54-AlbN(met2)由于met2基因缺失,導(dǎo)致自身無(wú)法合成蛋氨酸，因此這兩種含有人血白蛋白基因表達(dá)盒的單倍體營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株無(wú)法在MD固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。而兩種單倍體菌株一旦交配形成二倍體，由于染色體互補(bǔ)，自身缺陷部分在另一套染色體中得到彌補(bǔ)，這便使得新的二倍體菌株可以在MD固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。本發(fā)明的發(fā)明人正是利用這一原理進(jìn)行兩種單倍體缺陷型菌株的交配實(shí)驗(yàn)，方法步驟如下:取上述兩種單倍體缺陷型菌株涂于YPD固體培養(yǎng)基上活化，30°C培養(yǎng)至單菌落形成。將活化的兩種單倍體缺陷型菌株于MD固體培養(yǎng)基上相互垂直交叉劃線(xiàn)，置于30°C培養(yǎng)至兩種單倍體菌株交叉點(diǎn)長(zhǎng)出單克隆。挑取單克隆劃線(xiàn)到新的MD固體培養(yǎng)基上30°C擴(kuò)增培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行顯微鏡觀察并與單倍體菌落培養(yǎng)物進(jìn)行比較，以確定形成二倍體菌株，其中二倍體菌落的形態(tài)明顯大于單倍體菌落。通過(guò)PCR的方法進(jìn)一步對(duì)二倍體菌落進(jìn)行驗(yàn)證，確定所述二倍體菌落包含兩套基因組，每套基因組均包含人血白蛋白成熟肽編碼序列。挑取二倍體陽(yáng)性克隆用5’A0X通用引物(SEQIDNO:4)和3’A0X通用引物(SEQIDNO:5)進(jìn)行PCR法擴(kuò)增人血白蛋白成熟肽編碼序列，所得片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。經(jīng)測(cè)序鑒定(針對(duì)HSA序列測(cè)序)正確的二倍體陽(yáng)性克隆命名為MFDl。[0068]采用上述相同原理及方法將MF14-AlbA(argl)和MF54_AlbA(met2)進(jìn)行交配，經(jīng)鑒定后獲得二倍體陽(yáng)性克隆命名為MFD2。[0069]采用上述相同原理及方法將MF14-AlbA(argl)和MF54_AlbN(met2)進(jìn)行交配，經(jīng)鑒定后獲得二倍體陽(yáng)性克隆命名為MFD3。[0070]采用上述相同原理及方法將MF14-AlbN(argl)和MF54_AlbA(met2)進(jìn)行交配，經(jīng)鑒定后獲得二倍體陽(yáng)性克隆命名為MFD4。[0071]單倍體菌株GS115-AlbN(G418K)具有G418抗性，因此可以在含有G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是不能在含有Zeocin的YB)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，同理X33-AlbZ(ZeocinK)具有Zeocin抗性，因此可在含有Zeocin的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是不能在含有G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。兩種菌在含有50μg/mlZeocin和300μg/mlG418雙抗的YPD培養(yǎng)基中均無(wú)法生長(zhǎng)，但是通過(guò)選擇壓力交配后形成的二倍體菌株同時(shí)具有Zeocin和G418抗性，因此可以在篩選平板中生長(zhǎng)。首先將上述兩種單倍體菌株涂于YH)固體培養(yǎng)基上活化。將活化的兩種單倍體缺陷型菌株于含有Zeocin和G418抗生素的YPD固體培養(yǎng)基上相互垂直交叉劃線(xiàn)，置于30°C培養(yǎng)至兩種單倍體菌株交叉點(diǎn)長(zhǎng)出單克隆。挑取單克隆劃線(xiàn)到新的含有Zeocin和G418抗生素的固體培養(yǎng)基上30°C擴(kuò)增培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行顯微鏡觀察并于單倍體菌落培養(yǎng)物進(jìn)行比較，以確定形成二倍體菌株，其中二倍體菌落的形態(tài)明顯大于單倍體菌落。通過(guò)PCR的方法進(jìn)一步對(duì)二倍體菌落進(jìn)行驗(yàn)證，確定所述二倍體菌落包含兩套基因組，每套基因組均包含人血白蛋白成熟肽編碼序列。挑取二倍體陽(yáng)性克隆用5’AOX通用引物(SEQIDNO:4)和3’AOX通用引物(SEQIDNO:5)進(jìn)行PCR法擴(kuò)增人血白蛋白成熟肽編碼序列，所獲得的片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的二倍體陽(yáng)性克隆命名為MFD5。[0072]單倍體菌株GS115_AlbZ(his4,ZeocinK)由于his4基因缺失,導(dǎo)致自身無(wú)法合成組氨酸，因此在MD平板中不能生長(zhǎng)，但是該菌株含有Zeocin抗性基因，可以在含有Zeocin的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。而單倍體菌株GS115_AlbA無(wú)Zeocin抗性基因，因此無(wú)法在含有Zeocin的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。首先將上述兩種單倍體菌株涂于Yro固體培養(yǎng)基上活化。將活化的兩種單倍體菌株在含有Zeocin的MD固體培養(yǎng)基上相互垂直交叉劃線(xiàn)，置于30°C培養(yǎng)至兩種單倍體菌株交叉點(diǎn)長(zhǎng)出單克隆。挑取單克隆`劃線(xiàn)到新的含有Zeocin的MD固體培養(yǎng)基上30°C擴(kuò)增培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行顯微鏡觀察并于單倍體菌落培養(yǎng)物進(jìn)行比較，以確定形成二倍體菌株，其中二倍體菌落的形態(tài)明顯大于單倍體菌落。通過(guò)PCR的方法進(jìn)一步對(duì)二倍體菌落進(jìn)行驗(yàn)證，確定所述二倍體菌落包含兩套基因組，每套基因組均包含人血白蛋白成熟肽編碼序列。挑取二倍體陽(yáng)性克隆用5’AOX通用引物(SEQIDNO:4)和3’AOX通用引物(SEQIDNO:5)進(jìn)行PCR法擴(kuò)增人血白蛋白成熟肽編碼序列，所獲得的片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的二倍體陽(yáng)性克隆命名為MFD6。[0073]同理利用MF14K-AlbN(argl，G418K)的精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和G418抗性和X33_AlbZ(Ze0cinK)的無(wú)G418抗性基因，將活化后的兩種單倍體菌株垂直交叉劃線(xiàn)于含有G418的MD平板中，經(jīng)過(guò)篩選和鑒定獲得陽(yáng)性二倍體菌株，命名為MFD7。由于X33-AlbZ(ZeocinK)同時(shí)含有Zeocin基因，因此在擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)使用含有G418和Zeocin雙抗的MD平板進(jìn)行篩選，以減少出現(xiàn)的假陽(yáng)性。[0074]實(shí)施例8:二倍體菌株搖瓶表達(dá)[0075]為了驗(yàn)證二倍體菌株的重組人血白蛋白表達(dá)量比單倍體菌株高，將實(shí)施例7制備得到的七株二倍體菌株MFD1-7、單倍體對(duì)照菌GSl15-AlbN及陰性對(duì)照菌株GSl15在搖瓶上進(jìn)行初步表達(dá)研究。首先將各菌株按0.5%的比例接種于BMGY培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀pH6.0,1.34%ΥΝΒ4Χ10-5%生物素，1%甘油)，每株接種三瓶，30°C培養(yǎng)24h，OD6tltl達(dá)到15左右。將菌液3000rpm離心5min收集細(xì)胞，去除上清液，用BMMY培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，IOOmM磷酸鉀pH6.0,1.34%ΥΝΒ4Χ10、生物素，0.5%甲醇)重懸菌體，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每24h加入終濃度1.5%的甲醇繼續(xù)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)至第5天(120h)結(jié)束培養(yǎng)。將發(fā)酵液12000rpm離心5min后收集上清液進(jìn)行HPLC表達(dá)量分析。HPLC分析采用TosohG3000SWXL，流動(dòng)相為含1%異丙醇的pH7.0的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，流速0.6ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。各菌株表達(dá)量結(jié)果見(jiàn)附表1及附圖6。結(jié)果表明7株二倍體菌株的表達(dá)量均達(dá)到420mg/L以上,最高可達(dá)513mg/ml,明顯優(yōu)于單倍體菌株的253mg/ml。因此二倍體菌株具有明顯的表達(dá)量?jī)?yōu)勢(shì)。[0076]實(shí)施例9:二倍體菌株發(fā)酵罐表達(dá)[0077]將MFD2菌株接種到600mlYI3D培養(yǎng)基中，30V250rpm培養(yǎng)24h，至OD6tltl達(dá)到10-20。配制30L含有50g/L甘油的基本鹽培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中高壓蒸汽滅菌30min。滅菌結(jié)束后將發(fā)酵罐溫度降低至30°C，pH用28%氨水調(diào)節(jié)至6.0，設(shè)置轉(zhuǎn)速300rpm，通氣條件為0.2vvm。接種前在培養(yǎng)基中加入120mlPTMl微量元素，并調(diào)整溶解氧至100%。然后將600ml種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵罐中開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中控制溫度30°C，pH6.0，通過(guò)攪拌及通氣量控制溶解氧不低于20%。培養(yǎng)約20-25h時(shí)發(fā)酵罐中甘油耗完，此時(shí)開(kāi)始以500ml/hr補(bǔ)料速度流加50%甘油(含12ml/LPTMl)，流加約4h后停止甘油補(bǔ)料，開(kāi)始流加甲醇(含12ml/LPTMl)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。初始甲醇補(bǔ)料速度設(shè)置為60ml/hr，5小時(shí)后增加至180ml/hr，流加3小時(shí)后增加至270ml/hr，并以此速度補(bǔ)料至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵至200h開(kāi)始以200ml/hr速度補(bǔ)加90g/L的蛋白胨溶液，防止發(fā)酵后期因營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致二倍體菌株單倍體化。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，甲醇補(bǔ)料期約為280h，發(fā)酵周期約為310h。發(fā)酵過(guò)程每天取樣HPLC法檢測(cè)重組人血白蛋白的表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果表明(附圖7)，二倍體菌株MFD2的最高表達(dá)量能夠達(dá)到8.8g/L，而對(duì)照單倍體菌株GSl15-AlbN在同樣發(fā)酵時(shí)間的表達(dá)量只有5.4g/L，二倍體菌株與單倍體菌株相比表達(dá)量提高了1.6倍。[0078]將發(fā)酵液劃線(xiàn)于YPD平板分離單菌落，然后挑取獲得的單菌落涂于MD平板上進(jìn)行二倍體穩(wěn)定性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，涂布后的MD平板在30°C培養(yǎng)48h后，95%以上菌落均可以正常生長(zhǎng)出單菌落，這說(shuō)明大部分二倍體菌株在發(fā)酵結(jié)束時(shí)仍以二倍體形式穩(wěn)定存在。[0079]實(shí)施例10:二倍體菌株表達(dá)的重組人血白蛋白的純化及結(jié)構(gòu)分析[0080]采用本公司自有純化工藝(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?201010154987.4和201210322338.X)對(duì)實(shí)施例9中收獲的發(fā)酵液進(jìn)行純化后，得到了高純度的重組人血白蛋白，高壓液相色譜法(HPLC)檢測(cè)純度可以達(dá)到99%以上(見(jiàn)附圖8)。[0081]將純化后的重組人血白蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分子量檢測(cè)(上海中科新生命生物科技有限公司)，發(fā)現(xiàn)與天然人血白蛋白分子量一致。目的蛋白N末端測(cè)序結(jié)果為:DAHKSEVAHRFKDLG(SEQIDNO:8)，C末端測(cè)序結(jié)果為KLVAASQAALGL(SEQIDNO:9)，兩端序列與天然人血白蛋白完全相同。圓二色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后的重組人血白蛋白與天然人血白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。這說(shuō)明本發(fā)明表達(dá)出的重組人血白蛋白的結(jié)構(gòu)與天然人血白蛋白完全一致。[0082]附表1[0083]【權(quán)利要求】1.一種二倍體巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述酵母菌含有兩個(gè)染色體組，兩個(gè)染色體組均包含人血白蛋白成熟肽編碼序列，但分別包含不同的篩選標(biāo)記，所述人血白蛋白成熟肽編碼序列如SEQIDN0.3所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二倍體巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述篩選標(biāo)記選自營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記或抗生素篩選標(biāo)記。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二倍體巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，其中一個(gè)染色體組含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和/或抗生素篩選標(biāo)記，另一個(gè)染色體組含有與第一個(gè)染色體組不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和/或抗生素篩選標(biāo)記；或者，其中一個(gè)染色體組同時(shí)含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和抗生素篩選標(biāo)記，另一個(gè)染色體組不含任何篩選標(biāo)記；優(yōu)選地，所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記選自磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰羧胺合成酶基因ADE系列、磷酸乳清酸脫羧酶基因URA3、乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因URA5、精氨酸合成途徑基因ARG系列、組氨酸合成途徑基因HIS系列、賴(lài)氨酸合成途徑基因LYS系列、蛋氨酸合成途徑基因MET系列或脯氨酸合成途徑基因PRO系列；所述抗生素篩選標(biāo)記選自Shble基因、殺稻瘟素-S-脫氨酶基因、卡那霉素抗性基因或Hph基因。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的二倍體巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述兩個(gè)染色體組分別來(lái)自于兩種含有人血白蛋白成熟肽編碼序列、具有不同的篩選標(biāo)記的單倍體巴斯德畢赤酵母菌，所述二倍體巴斯德畢赤酵母菌通過(guò)所述兩種單倍體巴斯德畢赤酵母菌的交配獲得。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的二倍體巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述二倍體巴斯德畢赤酵母菌是MFD1-MFD7菌。6.—種構(gòu)建權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的二倍體巴斯德畢赤酵母菌的方法,其特征在于，所述方法使用兩種均含有人血白蛋白成熟肽編碼序列但具有不同篩選標(biāo)記的單倍體巴斯德畢赤酵母菌，通過(guò)將兩種單倍體巴斯德畢赤酵母菌進(jìn)行交配獲得二倍體巴斯德畢赤酵母菌。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括步驟:(O獲得人血白蛋白成熟肽編碼序列；(2)將獲得的人血白蛋白成熟肽編碼序列插入到一種或多種表達(dá)載體中，得到含有人血白蛋白基因表達(dá)盒的載體，所述表達(dá)載體包含一種或多種篩選標(biāo)記；優(yōu)選地，表達(dá)載體選自pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pA0815、pGAPZα、pPICZα或它們的衍生載體；(3)將步驟(2)得到的表達(dá)載體線(xiàn)性化，電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選獲得單倍體巴斯德畢赤酵母菌；優(yōu)選地，所述巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞是GS115(his4,Mut+)或X33；(4)將兩種由步驟(3)獲得的單倍體巴斯德畢赤酵母菌作為親本在平板上進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)，獲得二倍體巴斯德畢赤酵母菌。8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的二倍體巴斯德畢赤酵母菌在表達(dá)重組人血白蛋白中的應(yīng)用。9.一種表達(dá)重組人血白蛋白的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的二倍體巴斯德畢赤酵母菌。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于工業(yè)生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)二倍體巴斯德畢赤酵母菌的后期補(bǔ)加蛋白胨?！疚臋n編號(hào)】C12N1/19GK103468595SQ201310441524【公開(kāi)日】2013年12月25日申請(qǐng)日期:2013年9月24日優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日【發(fā)明者】楊俊杰,聶磊,王海彬,楊晟,陳飚,劉映淼,孔藝萌,徐巖,葉小紅,嚴(yán)娟娜,李丹,張賽萍,姜琪,白驊申請(qǐng)人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司