高活性中性植酸酶突變體及其基因和用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)基因工程技術(shù)改造得到的一種突變的中性植酸酶及其基因和用途，該突變的中性植酸酶氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2，是以野生型淀粉液化芽孢桿菌DSM1061phyC基因?yàn)榛A(chǔ)，利用PCR技術(shù)對(duì)其基因進(jìn)行點(diǎn)突變獲得的。本發(fā)明公開(kāi)了改造的中性植酸酶及其相應(yīng)的DNA序列，還公開(kāi)了所述中性植酸酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所述的突變中性植酸酶與野生酶相比，在40～75℃范圍內(nèi)，活性均有提高，尤其是在50～60℃下活性提高約1倍。在pH7.5條件下，突變酶的活性約為野生酶的3.0倍。該中性植酸酶可作為一種飼料添加劑，能有效提高動(dòng)物對(duì)飼料中植酸磷的利用率。本發(fā)明所提供的突變中性植酸酶基因可用于構(gòu)建表達(dá)該酶的重組菌。
【專(zhuān)利說(shuō)明】高活性中性植酸酶突變體及其基因和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶的基因工程和酶生化工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及活性提高的突變中性植酸酶，本發(fā)明還涉及編碼該突變中性植酸酶的基因及用途。
【背景技術(shù)】 [0002]植酸酶(phytase)即肌醇六憐酸酶(myoinositolhexaphosphatephosphohydrotase),是催化植酸及植酸鹽水解產(chǎn)生肌醇和磷酸(或磷酸鹽)的酶的總稱(chēng)。植酸酶能夠?qū)⒅菜峒捌潲}類(lèi)水解成肌醇和無(wú)機(jī)磷，而肌醇和無(wú)機(jī)磷作為動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能有重要意義。
[0003]目前，植酸酶主要以添加劑形式用于飼料加工工業(yè)和食品加工工業(yè)，以提高植物性飼料(或食品)中磷元素的利用率，減少動(dòng)物糞便中排出的磷對(duì)環(huán)境特別是水環(huán)境的污染，使植酸的抗?fàn)I養(yǎng)性作用得到解除，并且提高機(jī)體對(duì)蛋白及多種微量元素的利用率。
[0004]來(lái)源于芽孢桿菌的植酸酶屬于中性植酸酶，其可在pH為中性的腸道中起作用，有效彌補(bǔ)了酸性植酸酶的不足，拓寬了植酸酶的應(yīng)用范圍。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于中性植酸酶的研究主要集中于產(chǎn)酶菌篩選和基因工程菌的構(gòu)建方面。姚斌等從枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis中克隆了中性植酸酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有生物學(xué)功能但比活較原始酶下降了 30% (姚斌，袁鐵錚,王元火,等.來(lái)源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大腸桿菌的表達(dá).生物工程學(xué)報(bào)，2001，17(1):11-15)。陳艷等將來(lái)源于淀粉液化芽孢桿菌的植酸酶在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因工程菌的植酸酶活性?xún)H為出發(fā)菌株的1.27倍,表達(dá)重組酶活性偏低(陳艷,孫健義,趙學(xué)新，等.Bacillus amyloliquefaciens中性植酸酶基因的原核表達(dá)及蛋白純化和性質(zhì).食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005,24(2):60-65)。近年來(lái)，Rao等在大腸桿菌中對(duì)芽孢桿菌中性植酸酶進(jìn)行了高效表達(dá)，結(jié)果表明其最適pH為7.0,最適溫度55?,最大活性16U/mg(RaoDE, Rao KV, Reddy VD.Cloning and expression of Bacillus phytase gene(phy)in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusion bodies.Journal ofApplied Microbiology.2008,105 (3):1128-1137)。Tung 等運(yùn)用定點(diǎn)突變方法對(duì)Bacillus Iicheniformis植酸酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了改善,取得了較好的效果。定點(diǎn)突變結(jié)果表明，突變酶G117A/G266A與野生酶具有類(lèi)似的米氏常數(shù)Km，催化效率keat和最適的Ca2+濃度,但是熱穩(wěn)定性有大幅上升(Tung ET, Ma HW, Cheng C, et al.Stabilization ofbeta-propeller phytase by introducing Xaa—>Pro and Gly—>Ala substitutions atconsensus positions.Protein Pept.Lett.,2008,15,297-299)。
[0005]目前，中性植酸酶在應(yīng)用過(guò)程中還存在一些問(wèn)題，其中較為突出的就是該酶在高溫制粒殺菌工藝中活力損失較大，因此獲得高活性的中性植酸酶是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。利用現(xiàn)代基因工程方法對(duì)現(xiàn)有的優(yōu)良菌株進(jìn)行改造，是獲得高活性突變株的便捷途徑。定點(diǎn)突變是蛋白質(zhì)工程廣泛采用的技術(shù)，它是根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)理等信息，在基因水平進(jìn)行核苷酸突變，以達(dá)到改造酶分子中特定氨基酸殘基的目的，使酶的性質(zhì)最佳化。利用生物信息工具進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析與設(shè)計(jì)，并結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)提高淀粉液化芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens DSM1061中性植酸酶的活性，為其應(yīng)用推廣奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種突變的中性植酸酶，該突變的中性植酸酶與野生酶相t匕，在40~75°C范圍內(nèi)，活性均有提高，尤其是在50~60°C下，活性比野生酶提高約I倍。在pH7.5條件下，突變酶的活性約為野生酶的3.0倍。
[0007]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供編碼上述突變中性植酸酶的基因(核苷酸序列)，該突變的中性植酸酶基因可用于構(gòu)建重組菌。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述突變中性植酸酶的生產(chǎn)方法。
[0009]上述突變中性植酸酶核苷酸序列與野生酶核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)為HM747163)相比，第251位的編碼天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榫幋a谷氨酸的密碼子。
[0010]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施達(dá)到:
[0011]編碼權(quán)利要求1所述的突變中性植酸酶的核苷酸序列(即對(duì)應(yīng)野生型中性植酸酶氨基酸序列第251位的天冬氨酸密碼子突變?yōu)楸磉_(dá)谷氨酸的密碼子)，如SEQ ID N0.1所述。
[0012]一種突變的中性植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。該序列表示原中性植酸酶氨基酸序列(即野生型淀粉液化芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens DSM1061phyC基因所表達(dá)的氨基酸序列)的251位的天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基所取代。
[0013]含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體。如質(zhì)粒等。
[0014]用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
[0015]用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物利用N1-NTA瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和純化。
[0016]所述的突變中性植酸酶在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
[0018]本發(fā)明所提供的中性植酸酶與野生酶相比，在較寬的溫度范圍內(nèi)活性顯著提高。本發(fā)明還提供了該突變中性植酸酶的基因序列，這些序列可用于構(gòu)建表達(dá)高活性中性植酸酶的重組菌。本發(fā)明還提供了所述的突變中性植酸酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明涉及的中性植酸酶可以作為一種飼料添加劑，能有效提高動(dòng)物對(duì)飼料中磷元素的利用率。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1不同溫度下野生酶及突變酶活性比較。
[0020]圖2不同pH下野生酶及突變酶活性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1:淀粉液化芽抱桿菌 Bacillus amyloliquefaciens DSM1061phyC 基因的獲得及第251位氨基酸殘基的突變[0023]淀粉液化芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens DSM1061 從德國(guó) DSMZ 購(gòu)得。
[0024]培養(yǎng)基的制備:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L，121 °C，高壓蒸汽滅菌15min。
[0025]菌體的收集:將Bacillus amyloliquefaciens DSM1061接種到上述培養(yǎng)基中，置37°C搖床，180r.mirf1培養(yǎng)過(guò)夜，8000r.min'fC,離心15min,收集菌體。
[0026]目的基因的提取:采用改良的的酚-氯仿抽提法獲取Bacillusamyloliquefaciens DSM1061的基因組，以該基因組為模版，使用如下PCR引物(由生工生物工程(上海)公司合成):
[0027]phyC-F:5，-GCGGATCC ATGAATCATTCAAAAACAC-3，(SEQ ID N0.3)
[0028]phyC-R:5，-GTC AAGCTT TTATTTTCCGCTTCTGTC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0029]運(yùn)用Bio basic INC公司的PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。PCR循環(huán)參數(shù):94°C,lmin ;56Imin ；72°C, Imin ;共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)。
[0030]Bacillus amyloliquefaciens DSM1061phyC基因的也可以通過(guò)基因的全序列合成獲得，如委托生工生物工程(上海)有限公司按照Bacillus amyloliquefaciensDSM1061phyC基因序列(GenBank登錄號(hào)為HM747163)進(jìn)行合成，合成的基因同樣可用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0031]采用生工生物工程(上海)有限公司的膠回收試劑盒將目的基因片段進(jìn)行純化。將純化的基因或者全合成的基因與pET22b (+)(美國(guó)Novagen公司)進(jìn)行常規(guī)的連接反應(yīng)，將連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。運(yùn)用質(zhì)粒提取試劑盒Oio basic INC公司)，提取質(zhì)粒。運(yùn)用上述的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增鑒定確定插入的phyC基因，得到陽(yáng)性重組pET-phyC質(zhì)粒。
[0032]根據(jù)Stratagene公司的Quik-Change多重定點(diǎn)突變?cè)噭┖械囊?設(shè)計(jì)如下引物 5’ -CAGATCCAGACCATCCGATT-3’，以 pET-phyC 質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR，將 Asp251 突變?yōu)镚lu251，用限制性?xún)?nèi)切酶消化原始質(zhì)粒模板，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化高效率的感受細(xì)胞，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，即可得到含有突變基因(SEQ ID N0.1)的質(zhì)粒pET-phyC-D251E。
[0033]實(shí)施例2:表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選和鑒定
[0034]為構(gòu)建植酸酶基因的高效表達(dá)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物刪除了該酶N端的26位氨基酸殘基構(gòu)成的信號(hào)肽部分。引物設(shè)計(jì)采用Primer Premierf.0軟件，在引物中分別引入限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindIII (加粗下劃線(xiàn)部分)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物如下:
[0035]phvC-F:5，-GCGGATCCGAAGCATAAGCTGTCAGA-3，(SFQ ID N0.5)
[0036]phvC-R:5，-GTCAAGCTTTTTTCCGCTTCTGTC-3，(SEQ ID N0.6)
[0037]以獲得的phyC全長(zhǎng)基因?yàn)槟０錚CR的反應(yīng)參數(shù)為:94°C，lmin ；56°C,lmin ；72°C,Imin ;共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0038]將PCR產(chǎn)物和pET22b (+)載體分別用BamH I和Hind III消化并連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET22b-phyC-D251E。連接液轉(zhuǎn)化E.coli DH5a細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，提取質(zhì)粒并送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。
[0039]實(shí)施例3:中性植酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)
[0040]將經(jīng)鑒定后的pET22b-phyC-D251E重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coli BL21 (DE3)中，同時(shí)將空載體pET22b(+)轉(zhuǎn)入相同宿主作為對(duì)照。各取100 μ L轉(zhuǎn)化液分別涂布于含Amp(100yg/mL)的LB平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)成大小合適的菌落。挑取含有重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種至含100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)液，置搖床37°C，180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量(V/V)轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C，180r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6tltl ^ 0.6-0.8)分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1.0mmol/L，置20°C搖床，180r/min誘導(dǎo)表達(dá)6h。
[0041] 實(shí)施例4:中性植酸酶的純化
[0042]取適量按實(shí)施例3方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌培養(yǎng)液，8000r/min離心15min收集菌體，用無(wú)菌水洗滌兩次后，菌體重懸于0.5mL(pH7.5, 50mmol/L) Tris-HCl緩沖液中，冰浴中超聲破碎細(xì)胞。將超聲破碎后的樣品12000r/min，4°C離心IOmin取上清即為粗酶液。
[0043]由于設(shè)計(jì)的pET22b-phyC_D251E表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物中性植酸酶上帶有6個(gè)連續(xù)的組氨酸，可以通過(guò)金屬離子層析柱(N1-NTA瓊脂糖凝膠)親和純化。超聲波破碎誘導(dǎo)后的菌體于12000r/min離心,去除細(xì)胞碎片。上清液采用康為世紀(jì)Ni_Agarose6x His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒在4°C下進(jìn)行純化。將粗酶液負(fù)載上柱，流速為lmL/min:采用15倍柱體積平衡液(pH7.0，20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L 咪唑，0.5mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫除去雜蛋白，流速為lmL/min ;然后用8倍柱體積洗脫液(pH7.0,20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L咪唑,0.5mol/NaCl)收集目的蛋白，流速為lmL/min ;最后將目的蛋白置透析袋中除鹽,濃縮保存。
[0044]實(shí)施例5:中性植酸酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
[0045]中性植酸酶活性測(cè)定方法參考GB/T18634-2009。取適量酶液，底物植酸鈉濃度為
5.0mmol/L,反應(yīng)體系中 CaCl2 濃度為 lmmol/L,緩沖體系為 0.25mol/L Tris-HCl (ρΗ7.0)，反應(yīng)總體積為6mL。將上述混合物置37°C反應(yīng)30min，加入4mL顯色及終止液(體積比2:1:1的43%硝酸溶液，100g/L鑰酸銨，2.35g/L偏釩酸銨溶液)，置分光光度計(jì)測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量(波長(zhǎng)415nm)。
[0046]酶活性單位(U)定義為:在一定條件下，每分鐘釋放出I μ mol無(wú)機(jī)磷所需的酶量為一個(gè)酶活性單位。
[0047](I)中性植酸酶最適溫度的測(cè)定:將反應(yīng)混合物分別置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C水浴反應(yīng)30min，加入4mL顯色及終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)酶活。溫度對(duì)野生植酸酶和突變植酸酶的活性影響結(jié)果如圖1所示。隨著溫度的升高，酶活性逐漸增大，到60°C，突變酶與野生酶活性都達(dá)到最高。說(shuō)明二者的最適溫度為60°C。與野生酶相比，在40~75°C范圍內(nèi)，突變酶活性均有提高，尤其是在50~60°C下活性提高約I倍。
[0048](2)中性植酸酶最適pH的測(cè)定:配制不同pH的含有底物植酸鈉的溶液(pH3.0為甘氨酸-HCL緩沖液，pH4.0~pH6.5分別為HAc-NaAc緩沖液，pH7.0~pH9.0為T(mén)ris-HCl緩沖液；PH10.0為甘氨酸-NaOH緩沖液)。將反應(yīng)混合物置于60°C水浴反應(yīng)30min，加入4mL顯色及終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)酶活。pH對(duì)野生植酸酶和突變植酸酶活力影響結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，野生酶最適PH為7.0，而突變酶最適pH為7.5。在pH6.0~7.5這一較寬的范圍內(nèi)，野生酶活性均在最大活性的70%以上。在pH7.5條件下，突變酶的活性約為野生酶的3.0倍。
【權(quán)利要求】
1.一種突變的中性植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示的第27-383位。
2.編碼權(quán)利要求1所示的突變中性植酸酶的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，如SEQID N0.1所示的第79-1152位。
4.含有權(quán)利要求2所述的核苷酸序列的表達(dá)載體。
5.用權(quán)利要求4所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
6.權(quán)利要求1所述的突變中性植酸酶在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/55GK103468660SQ201310441632
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】許偉, 邵榮, 顏秀花, 王祖鵬 申請(qǐng)人:鹽城工學(xué)院