遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保護(hù)劑及其凍干方法
【專利摘要】一種遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保護(hù)劑及其凍干方法，屬于海洋細(xì)菌冷凍真空干燥保存【技術(shù)領(lǐng)域】。成份為：脫脂乳粉，乳糖，海藻糖，維生素C，NaCl和無菌水。在無菌條件下將遲鈍愛德華氏菌的活菌懸液與上述凍干保護(hù)劑溶液按體積比1:4～1:1的比例充分混合均勻后，分裝，在-80℃條件下快速冷凍5～6小時，再在真空度0.28mbar、凍干艙溫度-54℃的條件下凍干18小時后，將真空度降至0.034mbar，溫度-54℃繼續(xù)凍干2小時。凍干完成后向凍干艙內(nèi)充入99.99％的干燥二氧化碳?xì)怏w至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密封。本發(fā)明建立了遲鈍愛德華氏菌冷凍真空干燥長期保存的技術(shù)方法，為深入開展遲鈍愛德華氏菌的相關(guān)研究提供了技術(shù)支撐。
【專利說明】遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保護(hù)劑及其凍干方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋細(xì)菌冷凍真空干燥保存【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種適用于遲鈍愛德華氏菌的真空冷凍干燥保護(hù)劑及其凍干方法。
【背景技術(shù)】
[0002]遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)，又名遲緩愛德華氏菌，在世界范圍內(nèi)廣泛分布于海、淡水環(huán)境中，是水生生物的重要致病菌，可引起魚類、兩棲類等多種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的疾病，對養(yǎng)殖生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅(鄭大海等2004)。因此，有關(guān)遲鈍愛德華氏菌的研究逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖病原學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者對遲鈍愛德華氏菌的分類、致病機(jī)理、抗原特性和疫苗等方面都進(jìn)行了較為深入的研究(Matt J.Griffin, etal.2013，Jong Earn Yuj et al.2013，Meng Zhang, et al.2012，Seung Hyuk Choi, etal.2011X
[0003]近十年來，隨著我國海水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，由遲鈍愛德華氏菌引起的疾病在不同的海水魚類養(yǎng)殖品種中都有發(fā)現(xiàn)。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所從患“脾腎結(jié)節(jié)癥”的大菱鲆脾臟和腎臟中分離到了一株優(yōu)勢細(xì)菌，經(jīng)過深入細(xì)致的病原學(xué)和病理學(xué)研究，證實大菱鲆“脾腎結(jié)節(jié)癥”的致病原是遲鈍愛德華氏菌(水產(chǎn)學(xué)報，2007年第31卷第4期)，并深入進(jìn)行了遲鈍愛德華氏菌和其他常見海水魚類病原菌的多重PCR檢測技術(shù)和熒光定量PCR檢測技術(shù)研究(劉智超，中國海洋大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2012年)。同時，針對包括遲鈍愛德華氏菌在內(nèi)的多種大菱鲆常見病原篩選了一種多效中草藥復(fù)方(國家發(fā)明專利ZL201010100782.8)。這些研究主要集中于遲鈍愛德華氏菌感染養(yǎng)殖大菱鲆發(fā)病的流行病學(xué)、病原學(xué)、病理學(xué)和防治技術(shù)等方面，并未涉及到遲鈍愛德華氏菌的長期保存技術(shù)研究。
[0004]因為遲鈍愛德華氏菌是魚類較為常見且致病力較強(qiáng)的病原菌，已被公認(rèn)為水生經(jīng)濟(jì)動物細(xì)菌性疾病病原學(xué)研究的模式物種之一。在深入研究了該菌的病原學(xué)特性和致病機(jī)理等方面后，國內(nèi)外很多學(xué)者研究認(rèn)為研制開發(fā)相應(yīng)的疫苗是預(yù)防遲鈍愛德華氏菌病最有效的措施之一，而如何長期保藏具有生物學(xué)活性的遲鈍愛德華氏菌或其疫苗成為其中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。真空冷凍干燥技術(shù)是目前長期保藏微生物菌株并保存其活性最有效的技術(shù)方法，非常適宜用于遲鈍愛德華氏菌活菌株或疫苗的長久保存。然而，由于遲鈍愛德華氏菌自身的生物學(xué)特性、生境條件、營養(yǎng)需求、人工培養(yǎng)方法等有其特異性，很難借鑒其他微生物菌株的保存方法，因此尋找合適的真空冷凍干燥保護(hù)劑和凍干方法是實現(xiàn)遲鈍愛德華氏菌凍干長久保存必須解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于冷凍真空干燥保存遲鈍愛德華氏菌菌株的凍干保護(hù)劑和具體的凍干方法，能夠?qū)崿F(xiàn)遲鈍愛德華氏菌在常溫下的長期保藏和保存活力，為深入開展遲鈍愛德華氏菌的相關(guān)研究提供技術(shù)支撐。
[0006]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實現(xiàn):[0007]—種遲鈍愛德華氏菌的真空冷凍干燥保護(hù)劑，它的組成成份為:脫脂乳粉、乳糖、海藻糖、維生素C、NaCl和無菌蒸餾水。[0008]進(jìn)一步，所述的遲鈍愛德華氏菌的真空冷凍干燥保護(hù)劑，它的組成成份及其終濃度為:脫脂乳粉50~150g/L，乳糖50~100g/L，海藻糖100g/L，維生素C 5~20g/L，NaCl15g/L，溶劑為無菌蒸餾水。
[0009]一種所述的保護(hù)劑的配制方法為:將脫脂乳粉、乳糖和海藻糖溶于無菌NaCl溶液中，在106°C條件下濕熱滅菌30min，自然冷卻后配制成溶液A ;將維生素C溶于無菌NaCl溶液中，并經(jīng)0.22 μ m混合纖維素濾膜過濾后配制成溶液B ;將配置好的溶液A和溶液B在無菌條件下混合，并振蕩均勻后配制成凍干保護(hù)劑溶液，其各成份的終濃度為脫脂乳粉50~150g/L、乳糖 50 ~150g/L、海藻糖 100g/L、維生素 C 5 ~20g/L、NaCl 15g/L。
[0010]本發(fā)明還提供一種遲鈍愛德華氏菌的凍干方法。
[0011]本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0012]一種遲鈍愛德華氏菌冷凍真空干燥保藏的凍干方法，具體步驟是將經(jīng)純化培養(yǎng)的遲鈍愛德華氏菌用無菌的1.5% NaCl溶液配制成IO7~109cfu/mL的活菌懸液，并將活菌懸液與上述凍干保護(hù)劑溶液按體積比1:4~1:1的比例充分混合均勻后，分裝至安培瓶中并置于_80°C條件下快速冷凍5~6小時，再放入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)凍干艙中，在真空度0.28mbar、凍干艙溫度_54°C的條件下凍干18小時后，將真空度降至0.034mbar,并維持凍干艙溫度_54°C的條件下繼續(xù)凍干2小時，待凍干完成后向凍干艙內(nèi)充入99.99%的高純度干燥二氧化碳?xì)怏w至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密封。密封完畢的安培瓶內(nèi)即裝有凍干的遲鈍愛德華氏菌菌粉，能夠置于常溫下長期保存。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對比的有益效果:
[0014]1.優(yōu)化了凍干保護(hù)劑的配方，并在其中添加了一定的鹽分，使其更加適用于遲鈍愛德華氏菌的凍干保藏。
[0015]2.改良了冷凍真空干燥的凍干程序，將凍干程序設(shè)置為不同真空度的兩個階段，使凍干更為徹底，保存效果更好。
[0016]3.凍干完畢后向凍干艙中充入了高純度二氧化碳?xì)怏w并直接壓蓋密封，由于二氧化碳?xì)怏w密度較大，有效隔絕了凍干菌株與空氣的直接接觸，在惰性氣體的保護(hù)下使凍干菌株的保存期更長。
【具體實施方式】
[0017]下面通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明:
[0018]實施例1
[0019]從山東省威海市某大菱鲆養(yǎng)殖廠采集到患“脾腎結(jié)節(jié)癥”的大菱鲆病魚數(shù)條，將其打包充氧帶回中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所實驗室進(jìn)行病原分離。無菌操作分別剪取少許病魚的脾臟和腎臟組織，將其放入無菌培養(yǎng)皿中用滅菌的1.5%的NaCl溶液輕輕滴洗數(shù)次后，將組織剪碎。用接種環(huán)挑取少量剪碎的組織，在胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離細(xì)菌。將劃線完畢的培養(yǎng)基置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，從形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落中選取單個菌落，再次轉(zhuǎn)接至一個新的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。重復(fù)以上步驟2~3次，直至獲得病原菌的純培養(yǎng)菌落。將獲得的純培養(yǎng)物制成高濃度的活菌懸液，并腹腔注射健康大菱鲆以驗證其致病性。對驗證后的病原菌進(jìn)行常規(guī)生理生化表型實驗和16S rDNA序列比對分析,鑒定為遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)。
[0020]挑取純培養(yǎng)的遲鈍愛德華氏菌單菌落接于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中在28°C、150rpm條件下培養(yǎng)20h后，于4000r/min離心8min棄上清，收集菌體沉淀，然后加入菌體體積15倍左右的濃度為1.5%的無菌NaCl溶液充分振蕩均勻后，再次于4000r/min離心8min,棄上清,收集菌體沉淀,重復(fù)同樣步驟兩次后,用濃度為1.5%的無菌NaCl溶液將收集的菌體重懸配制成IO7~109cfu/mL的菌懸液備用。
[0021]先分別將5g脫脂乳粉、5g乳糖和IOg海藻糖溶于90mL濃度為1.5%的NaCl溶液中，在106°C條件下濕熱滅菌30min,自然冷卻后配制成溶液A。將0.5g維生素C溶于IOmL濃度為1.5%的無菌NaCl溶液中，并經(jīng)0.22 μ m混合纖維素濾膜過濾后配制成溶液B。將配置好的溶液A和溶液B在無菌條件下混合，并振蕩均勻后配制成IOOmL的凍干保護(hù)劑溶液，其各成份的終濃度為脫脂乳粉50g/L、乳糖50g/L、海藻糖100g/L、維生素C 5g/L、NaCl15g/L。
[0022]在無菌條件下，將已配置好的菌懸液和保護(hù)劑溶液按體積比1:1的比例混合并振蕩均勻后，分裝至數(shù)個2mL的無菌安培瓶中，每個安培瓶中裝有1.5mL的混合液，將安培瓶蓋上膠塞后在_80°C超低溫冰箱中冷凍5h。然后將已結(jié)冰的混合溶液迅速放入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)凍干艙中，在真空度0.28mbar、凍干艙溫度為_54°C的條件下凍干18小時，之后將真空度降低為0.034mbar,維持凍干艙溫度_54°C繼續(xù)凍干2小時。凍干程序完成后，向凍干艙內(nèi)緩慢充入99.99%的高純度干燥二氧化碳?xì)怏w至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密封即完成遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保存。凍干并密封后的安培瓶置于常溫下保存。
[0023]在凍干完成后的當(dāng)天，第7天和第90天，分別隨機(jī)挑選5個安培瓶，在無菌條件下打開密封并加入1.5mL的滅菌蒸餾水進(jìn)行復(fù)水，待凍干粉末完全溶解后用濃度為1.5%的無菌NaCl溶液進(jìn)行梯度稀釋，并用`胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基涂布進(jìn)行活菌計數(shù)，以測定凍干菌株的存活率。每個梯度進(jìn)行2次平行實驗，取其平均值，結(jié)果見表1。
`[0024]本次實驗結(jié)果證明，通過本方法獲得的遲鈍愛德華氏菌凍干菌粉常溫保存I天、7天和90天后的平均存活率均高于19%，取得了較佳的凍干保存效果。
[0025]表1遲鈍愛德華氏菌凍干菌粉復(fù)水后的存活率
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保護(hù)劑，其特征在于它的組成成份為:脫脂乳粉，乳糖，海藻糖，維生素C、NaCl和無菌蒸餾水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保護(hù)劑，其特征在于它的各種成份的終濃度為:脫脂乳粉50~150g/L，乳糖50~100g/L，海藻糖100g/L，維生素C5~20g/L, NaCl 15g/L,溶劑為無菌蒸懼水。
3.利用權(quán)利要求1或2所述的冷凍真空干燥保護(hù)劑進(jìn)行遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保藏的凍干方法，其特征在于它的方法步驟是: 用無菌的1.5% NaCl溶液將待凍干的遲鈍愛德華氏菌純培養(yǎng)菌落配制成IO7~109cfu/mL的活菌懸液，并在無菌條件下將活菌懸液與權(quán)利要求1或2所述的保護(hù)劑溶液按體積比1:4~1:1的比例充分混合均勻后，分裝至安培瓶中并置于-80°C條件下快速冷凍5~6小時，再放入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)凍干艙中，設(shè)置真空度0.28mbar、凍干艙溫度_54°C的條件下凍干18小時后，將真空度降至0.034mbar，維持凍干艙溫度_54°C繼續(xù)凍干2小時，待凍干完 成后向凍干艙內(nèi)充入99.99%的高純度干燥二氧化碳?xì)怏w至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密封。
【文檔編號】C12N1/04GK103468573SQ201310443283
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】張正, 王印庚, 于永翔, 廖梅杰, 榮小軍, 史秀清, 李彬, 王嵐 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所