改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因及其重組載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25位至第450位所示，該序列根據(jù)家蠶的密碼子偏好性進(jìn)行設(shè)計(jì)，能夠在家蠶中正常表達(dá)和翻譯；本發(fā)明還公開了含改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組載體，該重組表達(dá)載體含有增強(qiáng)子hr3和分泌型絲膠1基因啟動(dòng)子Ser1，能夠在家蠶中部絲腺細(xì)胞特異表達(dá)人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，并將重組蛋白分泌至蠶絲的絲膠層中，其獲得的蠶絲具有生物活性，直接使用具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，是一種良好的醫(yī)用材料。
【專利說(shuō)明】改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因及其重組載體和應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因，還 涉及含有改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組載體和改造的人酸性成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子基因的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶W泌絲著稱，是最早被人類所完全馴化利用的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（昆蟲）之一。家蠶 的絲腺是合成、分泌蠶絲蛋白的器官，是整個(gè)蠶絲業(yè)的生物學(xué)基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)數(shù)千年的人工馴 化，家蠶的絲腺具備了超強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成與分泌能力，一頭體重5g左右家蠶能合成分泌約 0. 5g蠶絲蛋白，為目前已知昆蟲之最。蠶絲蛋白主要由絲素蛋白（fibroin)和包裹在其外 層的絲膠蛋白（sericin)構(gòu)成；絲素蛋白是蠶絲的主體，約占75%，由蠶的后部絲腺合成，包 括f ib-H鏈、f ib-L鏈和P25 H種主要組分，均不溶于水；其余為絲膠蛋白，約占25%，由蠶的 中部絲腺合成，包括絲膠1 (Sericinl)、絲膠2 (Sericin2)和絲膠3 (Sericin3) H種主要組 分，其中又W絲膠1蛋白含量最高，均可溶于水。蠶絲是天然的蛋白絲纖維，絲素是構(gòu)成整 個(gè)蠶絲網(wǎng)產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)，其卓越的機(jī)械性能使其被廣泛應(yīng)用于紡織業(yè)，此外，絲素蛋白也具有 很好的生物相容性，作為生物材料被廣泛用做手術(shù)縫合線，人造血管，藥物載體W及組織工 程支架等。絲膠蛋白是一類親水膠性蛋白，除了黏附在絲素的外層形成雖絲之一基本功能 之外，絲膠蛋白本身也具有多種生物學(xué)功能，被用做可降解的生物材料，生物醫(yī)學(xué)材料，成 型品聚合物，功能性膜材料，光纖W及織物等。
[0003] W鱗翅目昆蟲Trichoplusia ni來(lái)源的piggyBac轉(zhuǎn)座子發(fā)展而來(lái)的遺傳操作工 具在家蠶中的成功應(yīng)用，為遺傳改造家蠶并賦予其新型功能提供的寶貴契機(jī)。家蠶絲腺幾 個(gè)主要的絲蛋白編碼基因Fib-H，F(xiàn)ib-L，P25 W及Sericinl的啟動(dòng)子被用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表 達(dá)系統(tǒng)，用于控制外源基因在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺中的精確與高量表達(dá)。該些表達(dá)系統(tǒng)被用來(lái) 表達(dá)各種功能蛋白，W此提高蠶絲的機(jī)械與生物學(xué)功能。如，利用Fib-H表達(dá)系統(tǒng)在家蠶后 部絲腺特異表達(dá)蛛絲-蠶絲融合蛋白，使蠶絲的機(jī)械性能得到大幅提高。利用Fib-H表達(dá) 系統(tǒng)在家蠶后部絲腺特異表達(dá)H種不同的英光蛋白，而創(chuàng)作出彩色雖絲。利用Fib-L表達(dá) 系統(tǒng)在家蠶后部絲腺特異表達(dá)堿性人成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF)使蠶絲的水溶蛋白經(jīng)過(guò)復(fù)性 處理后具有促細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能。在蠶絲中表達(dá)膠原或纖維連接蛋白賦予蠶絲更好的 細(xì)胞黏附特性。但是該些新型蠶絲的應(yīng)用都需要事先利用酸、堿、高溫等條件將蠶絲中的絲 膠成分去除，該將會(huì)增加生產(chǎn)成本并導(dǎo)致環(huán)境污染，并影響其實(shí)際應(yīng)用。因此，探索研究能 被直接用作功能材料的新型蠶絲顯得尤為迫切。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基 因；本發(fā)明的目的之二在于提供含有所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組載 體；本發(fā)明的目的之H在于提供所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在家蠶中部絲 腺細(xì)胞表達(dá)制備促進(jìn)細(xì)胞增殖的蠶絲中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之四在于提供利用所述改造 的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在家蠶中部絲腺表達(dá)制得的蠶絲；本發(fā)明的目的之五在 于提供所述的蠶絲在制備促進(jìn)細(xì)胞增殖的材料中的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1.改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因，核巧酸序列如SEQ ID NO. 1第25位至 第450位所示。
[0007] 優(yōu)選的，核巧酸序列如SEQ ID NO. 1第7位至第450位所示。
[0008] 2.含有所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組載體。
[0009] 優(yōu)選的，所述重組載體含有表達(dá)改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)框。
[0010] 優(yōu)選的，所述表達(dá)框?yàn)轫樞蜻B接的增強(qiáng)子虹3,分泌型絲膠I啟動(dòng)子Pserlsp，人酸 性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因和終止子SV40。
[0011] 更優(yōu)選的，所述表達(dá)框的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 最優(yōu)選的，所述重組載體是W地ac巧Xp3EGFP，af]載體為骨架載體，在AscI酶切 位點(diǎn)處連入SEQ ID NO. 2所示序列。
[0013] 3.所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在家蠶中部絲腺細(xì)胞表達(dá)制備促 進(jìn)細(xì)胞增殖的蠶絲中的應(yīng)用。
[0014] 4.所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在家蠶中部絲腺表達(dá)制得的蠶絲。
[0015] 5.所述的蠶絲在制備促進(jìn)細(xì)胞增殖的材料中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于；本發(fā)明公開了一種改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基 因，該基因根據(jù)家蠶密碼子偏好進(jìn)行設(shè)計(jì)，能夠在家蠶絲腺中表達(dá)，并且該基因在分泌型絲 膠1基因啟動(dòng)子Seri和增強(qiáng)子虹3作用下能夠在家蠶中部絲腺中表達(dá)，其表達(dá)的重組蛋 白能夠分泌至蠶絲的絲膠層中，并且獲得的蠶絲具有生物活性，直接使用具有促進(jìn)細(xì)胞增 殖的功能，同時(shí)利用本發(fā)明制得的蠶絲促細(xì)胞增殖功能的發(fā)揮可不依賴于肝素，同時(shí)由于 本發(fā)明制得的蠶絲不需經(jīng)過(guò)復(fù)性、脫膠等處理，能夠降低生產(chǎn)成本和對(duì)環(huán)境的污染，能夠用 作良好的生物醫(yī)學(xué)材料；本發(fā)明還公開了改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組載 體，含有增強(qiáng)子虹3,分泌型絲膠I啟動(dòng)子Pserlsp，將目的基因特異的、高效的表達(dá)，為制備 新型功能蠶絲奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0018] 圖1為轉(zhuǎn)人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子hFGFl基因家蠶的構(gòu)建(A ;轉(zhuǎn)基因載體示意 圖。3Xp3EGFP代表轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記；虹3代表從家蠶桿狀病毒重慶株系（BmNPV化ongqing strain)中克隆而來(lái)的增強(qiáng)子虹3 ;Pserlsp代表分泌型絲膠1基因啟動(dòng)子；SV40代表轉(zhuǎn)錄 終止子；B ;根據(jù)家蠶密碼子使用偏好型優(yōu)化而來(lái)的hFGFlDNA序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；C : 轉(zhuǎn)基因家蠶英光篩選，注射G1代蠶卵和蛾子的復(fù)眼發(fā)散綠色英光轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體均由紅 色箭頭標(biāo)出，標(biāo)尺大小為2mm)。
[0019] 圖2為重組hFGFl蛋白在轉(zhuǎn)基因家蠶中的表達(dá)檢測(cè)（A ;中部絲腺中重組hFGFl 蛋白的免疫組化分析，a和b表示轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺的免疫組化在英光W及白光下的結(jié) 果，c和d表示正常對(duì)照家蠶中部絲腺的免疫組化在英光w及白光下的結(jié)果，標(biāo)尺大小為 lOOym ;B :重組hFGFl蛋白在中部絲腺中的SDS-Page (左巧口 Westernblot檢測(cè)J (右);C :重 組hFGFl蛋白在蠶絲中的表達(dá)檢測(cè)W及含量測(cè)定)。
[0020] 圖3為細(xì)胞培養(yǎng)用蠶絲薄片的制備（A轉(zhuǎn)hFGFl基因家蠶蠶雖；B轉(zhuǎn)hFGFl基因家 蠶蠶雖，蠶雖薄層經(jīng)過(guò)5次超純水漂洗瞭干；C蠶雖薄層打孔制成6mm直徑的圓薄片；標(biāo)尺 大小為1cm)。
[0021] 圖4為轉(zhuǎn)hFGFl蠶絲生物學(xué)功能檢測(cè)（A為肝素存在時(shí)，轉(zhuǎn)hFGFl蠶絲促進(jìn) NIT/3T3S細(xì)胞生長(zhǎng)的情況；B為利用CCK-8測(cè)定肝素存在時(shí)，轉(zhuǎn)hFGFl蠶絲促進(jìn)NIT/3T3S 細(xì)胞增殖情況；C為無(wú)肝素時(shí)，轉(zhuǎn)hFGFl蠶絲促進(jìn)NIT/3T3S細(xì)胞生長(zhǎng)的情況；D為利用CCK-8 測(cè)定無(wú)肝素時(shí)，轉(zhuǎn)hFGFl蠶絲促進(jìn)NIT/3T3S細(xì)胞增殖情況，標(biāo)尺大小為200 y m)。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第H版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023] 實(shí)施例中使用的細(xì)胞系為小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3,由中國(guó)西南大學(xué)家蠶基因組 生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。
[0024] -、轉(zhuǎn)人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hFGFl)基因家蠶的制備
[00巧]將商業(yè)合成經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hFGFl)基因，即改造 的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1所 示核巧酸的上游為BamHI酶切位點(diǎn)，下游為Notl酶切位點(diǎn)，第7位至第24位為6個(gè)組氨酸 標(biāo)簽密碼子，第25位至第450位為改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。將合成的序列經(jīng) BamHI和Notl雙酶切后連接至經(jīng)同樣沒(méi)切的pslllSO比r3PSerlspRedSV40]載體中（見公開 號(hào)為CN102492692A的中國(guó)專利)，得pslllSO比r3PSerlhFGFlSV40]載體，其載體結(jié)構(gòu)如圖 1A所示。然后用AscI內(nèi)切酶酶切PS11180比r3PSerls地FGF1SV40]載體，切下表達(dá)改造的 人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)框，序列如SEQ ID NO. 2所示，該表達(dá)框包括順序連接的 虹3增強(qiáng)子、分泌型絲膠I啟動(dòng)子Pserlsp，改造的hFGFl基因（在hFGFl基因3'端融合有 6個(gè)組氨酸標(biāo)簽密碼子）和終止子SV40,并將其連接在同樣經(jīng)過(guò)AscI內(nèi)切酶酶切的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)載體地ac[3Xp3EGFPaf] (Horn and Wimmer2000;Thomas et al.2002)中，得轉(zhuǎn)基因 表達(dá)載體地化FGFlSv40。該表達(dá)載體W家蠶神經(jīng)復(fù)眼特異啟動(dòng)子（3 Xp3)驅(qū)動(dòng)的綠色英光 蛋白基因（EGFP)為轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記，含有一個(gè)虹3增強(qiáng)子，W此提高分泌型絲膠I啟動(dòng)子 Pserlsp的轉(zhuǎn)錄活性，含有經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的改造的hFGFl基因，且在hFGFl基因3'端融合 表達(dá)6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的核巧酸，并W SV40為轉(zhuǎn)錄終止子，其中帶組氨酸標(biāo)簽的hFGFl基因 如圖1B所示。
[0026] 將轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體地化FGFlSv40與編碼piggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pA3PIG按 照1 ;1摩爾比混合（400ng/yL)，參照申請(qǐng)?zhí)枮?00910103397.6公開的方法進(jìn)行顯微注 射。具體步驟為：將混合后的質(zhì)粒注射已解除滯育的大造早期胚胎(產(chǎn)卵后2?化），隨后 用無(wú)毒膠水對(duì)注射孔進(jìn)行封口，經(jīng)35%的甲酵蒸汽消毒5分鐘后，置于25C，相對(duì)濕度85% 的環(huán)境中賠化，賠化的幼蟲（GO代）采用人工飼料飼育，至成蟲后進(jìn)行自交或回交制種，獲 得的G1代蠶卵(第7天）在宏觀體視英光顯微鏡（Olypus MVXIO,日本）下檢測(cè)，綠色英光 觀察采用波長(zhǎng)為460?490nm的激發(fā)光，篩選出在眼睛或神經(jīng)特異激發(fā)綠色英光的轉(zhuǎn)基因 陽(yáng)性蛾圈（圖1C)，所得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性蛾圈率為5. 8%。將陽(yáng)性蛾圈中的陽(yáng)性個(gè)體飼養(yǎng)至蛾期， 將轉(zhuǎn)基因家蠶蛾子（圖1C)與正常家蠶蛾子進(jìn)行回交制種，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系，命名為 haiFGFlSv40。
[0027] 二、轉(zhuǎn)基因家蠶中hFGFl重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)
[0028] 將hShFGFlSv40轉(zhuǎn)基因家蠶5齡第6天的中部絲腺進(jìn)行免疫組化分析。具體步 驟為；取1cm左右長(zhǎng)度的5齡第6天hShFGFlSv40轉(zhuǎn)基因家蠶的中部絲腺，利用0. C. T.試 齊IJ(SakuraFinetechnical)進(jìn)行冷凍包埋，在冷凍切片機(jī)中將包埋的中部絲腺切成厚度約 為10 y m的橫切面，貼于載玻片上，免疫組化的一抗為兔源抗hFGFl抗體（Biovision)，二 抗為FITC-1油eledGoat Anti-Rabbit IgG (Beyotime),英光信號(hào)的采集利用英光顯微鏡 (Wkon)，結(jié)果如圖2A所示。由圖2A可知，轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺的絲膠層有強(qiáng)烈的綠色英 光信號(hào)，對(duì)照無(wú)明顯的英光信號(hào)，表明重組hFGFl蛋白在轉(zhuǎn)基因家蠶的中部絲腺細(xì)胞中高 效合成，并分泌至絲腺層中。
[0029] 為進(jìn)一步驗(yàn)證英光信號(hào)屬于重組hFGFl蛋白，提取轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺總蛋白進(jìn) 行SDS-Page W及Westernblot檢測(cè)。具體步驟為：取Ig轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺，置于10血 PBSp服.0緩沖液中，剪碎后，于4°C過(guò)夜振蕩，18000巧m，4°C離也5分鐘收集上清部分。取 20 y L上清蛋白樣品于15%的SDS-Page膠中進(jìn)行電泳分離，并利用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如 圖2B所示。結(jié)果表明；在轉(zhuǎn)基因組泳道中的17kDa蛋白分子量marker的上方的出現(xiàn)一條 差異條帶，該差異條帶的分子量大小與重組hFGFl蛋白的預(yù)期大小一致。按照前述相同的 方法分離上清蛋白樣品，并將SDS-Page膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜置于含5% 脫脂奶粉的TBST中，于4°C過(guò)夜封閉，次日，先用TBST洗涂1次，再將膜放入含兔抗hFGFl (購(gòu)自Biovision公司）稀釋比例1 ;10000的TBST中，室溫?fù)u床賠育1. 5h，用TBST洗涂5 次，再將膜放入含HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(購(gòu)自碧云天公司）、稀釋比例為1 ;20000的TBST 中，室溫?fù)u床賠育1小時(shí)，TBST洗涂5次后用E化-Advance發(fā)光檢測(cè)試劑(購(gòu)自Amersham 公司）盒進(jìn)行顯色，結(jié)果如圖2B所示。Westernblot的雜交結(jié)果表明，其差異條帶即為重組 hFGFl蛋白條帶。
[0030] 將轉(zhuǎn)基因家蠶蠶雖粉碎成細(xì)磨，按照30mg/mL溶于萃取緩沖液（20mM Tris-cl，8M urea,抑7. 0)中，室溫振蕩過(guò)夜，18,00化pm, 4°C離也5分鐘收集上清蛋白樣品。取20 y L上 清蛋白樣品與hFGFl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-Page與Westernblot檢測(cè)。方法與前述方法相 同，結(jié)果如圖2C所示。結(jié)果顯示；轉(zhuǎn)基因家蠶雖絲中含有大量的重組hFGFl蛋白，與中部絲 腺內(nèi)容物中的檢測(cè)結(jié)果一致，表明重組蛋白能被分泌至絲腺腺腔的絲膠層中，并隨絲膠蛋 白分泌到蠶絲中形成蠶雖。將hFGFl重組蛋白在SDS-Page W及Westernblot中的蛋白條 帶與hFGFl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白條帶利用imagej軟件進(jìn)行灰度比對(duì)分析。結(jié)果顯示；轉(zhuǎn)基因 家蠶中hFGFl重組蛋白的含量約為21ng/y L蠶絲萃取總蛋白，即0. 07%雖層重量。
[0031] H、轉(zhuǎn)hFGFl基因蠶絲的生物學(xué)功能檢測(cè)
[0032] 為檢測(cè)hFGFl重組蛋白在蠶絲中是否具有其天然活性，W便直接將該種轉(zhuǎn)基因蠶 絲開發(fā)成為新型的生物醫(yī)學(xué)材料。收集轉(zhuǎn)hFGFl基因家蠶雖殼和正常家蠶雖殼，利用綴子 將其撕化成薄層，浸入雙蒸水中清洗5次，置于超凈臺(tái)中風(fēng)干，利用打孔器將薄層制成直徑 為6mm的小圓片（?13y g/片，約含long hFGFl重組蛋白），然后放入超凈臺(tái)紫外滅菌4小 時(shí)，即制成培養(yǎng)細(xì)胞用的蠶絲薄片（圖3)。蠶絲生物學(xué)功能測(cè)試用的細(xì)胞為商業(yè)化的小鼠 成纖維細(xì)胞（NIH/3T3)，將NIH/3T3培養(yǎng)于含有10%(v/v)胎牛血清（FBS，Gibco)的DMBl培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37C，5%C02,收集生長(zhǎng)至96%匯合度的NIH/3T3細(xì)胞按照500/100 y L/ 孔的細(xì)胞濃度貼壁平鋪于96孔板中，并用含0. 5%(v/v)胎牛血清（FBS，Gibco)的DMEM培 養(yǎng)基中饑餓處理24小時(shí)。再將制備的蠶絲薄片按照1片/孔添加至96孔板中，并W每孔 long的hFGFl標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，并在孔中添加肝素（heparin)作為對(duì)照，肝素的工作濃 度為8U/血。賠育48小時(shí)后，小也將蠶絲薄層從96孔板中取出，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，并加入 新的100 y L DMEM培養(yǎng)基。將96孔板置于顯微鏡下觀察經(jīng)過(guò)蠶絲賠育后的細(xì)胞的生長(zhǎng)狀 況。隨后，向96孔板內(nèi)按照l(shuí)OuL/孔的劑量加入CCK-8試劑(購(gòu)自碧云天公司），于37C反 應(yīng)化后，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定孔內(nèi)細(xì)胞的吸收值。每個(gè)測(cè)試組分別設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，且 重復(fù)3次W上。結(jié)果顯示；加肝素時(shí)，轉(zhuǎn)hFGFl基因蠶絲和hFGFl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品都能顯著促 進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖4A)，CCK-8測(cè)試結(jié)果顯示轉(zhuǎn)hFGFl蠶絲的具有明顯的促細(xì)胞增 殖活性，且比hFGFl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品高，暗示hFGFl重組蛋白的促有細(xì)胞絲分裂活性在蠶絲中可 穩(wěn)定的維持（圖4B);不加肝素時(shí)，轉(zhuǎn)hFGFl基因蠶絲處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好，而hFGFl 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品處理的進(jìn)細(xì)胞幾乎不生長(zhǎng)（圖4C)，CCK-8測(cè)試結(jié)果進(jìn)一步顯示，不加肝素時(shí)，轉(zhuǎn) hFGFl基因蠶絲具有明顯的促細(xì)胞增殖活性，而hFGFl標(biāo)準(zhǔn)品組的促細(xì)胞增殖效果不明顯 (圖4D)，說(shuō)明該轉(zhuǎn)基因蠶絲可在不依賴肝素的情況下直接用于制備具有細(xì)胞增殖功能的生 物醫(yī)學(xué)材料。
[0033] 綜上所述，利用本發(fā)明構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體地化FGF1SV40制備的轉(zhuǎn)基因家蠶 h化FGF1SV40能特異高效的在中部絲腺細(xì)胞中合成人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子重組蛋白并 分泌至蠶絲的絲膠層中，獲得的轉(zhuǎn)基因蠶絲中重組蛋白的含量約為0.07%雖層重。轉(zhuǎn)基因 蠶絲的生物學(xué)活性測(cè)試結(jié)果表明；轉(zhuǎn)基因蠶絲具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖功能，提示重組蛋 白hFGFl在蠶絲中依然具有促細(xì)胞有絲分裂活性。此外，該轉(zhuǎn)基因蠶絲可不依賴于肝素而 發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，使得該轉(zhuǎn)基因蠶絲可W直接用于生物醫(yī)學(xué)材料的制備。
[0034] 最后說(shuō)明的是，W上優(yōu)選實(shí)施例僅用W說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO. 1 第25位至第450位所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因，其特征在于：核苷 酸序列如SEQIDNO. 1第7位至第450位所示。
3. 含有權(quán)利要求1或2所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體含有表達(dá)改造的人酸 性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)框。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述表達(dá)框?yàn)轫樞蜻B接的增強(qiáng)子 hr3,分泌型絲膠I啟動(dòng)子Pserlsp，人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因和終止子SV40。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組載體，其特征在于，所述表達(dá)框的核苷酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體是以pBac[3XP3EGFP， af]載體為骨架載體，在AscI酶切位點(diǎn)處連入SEQIDNO. 2所示序列。
8. 權(quán)利要求1或2所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在家蠶中部絲腺細(xì)胞表 達(dá)制備促進(jìn)細(xì)胞增殖的蠶絲中的應(yīng)用。
9. 利用權(quán)利要求1或2所述改造的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在家蠶中部絲腺表 達(dá)制得的蠶絲。
10. 權(quán)利要求9所述的蠶絲在制備促進(jìn)細(xì)胞增殖的材料中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104513821SQ201310450300
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】夏慶友, 王峰, 徐漢福, 王元成, 袁林, 馬三垣, 趙萍 申請(qǐng)人:西南大學(xué)