一種快速獲取大量優(yōu)質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提高干細(xì)胞培養(yǎng)效率的方法，所述方法包括在亞磁環(huán)境下培養(yǎng)干細(xì)胞。本發(fā)明使用的方法在不影響細(xì)胞性質(zhì)的前提下快速獲得大量優(yōu)質(zhì)的干細(xì)胞，不會對細(xì)胞造成任何額外生物或化學(xué)污染，對解決干細(xì)胞治療中細(xì)胞數(shù)量稀少問題及提高干細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品產(chǎn)量有重要意義。
【專利說明】一種快速獲取大量優(yōu)質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能提高神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)效率且不影響干細(xì)胞品質(zhì)的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前對于神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，主要是利用添加生長因子EGF和bFGF無血清培 養(yǎng)基來維持細(xì)胞增殖，形成神經(jīng)干細(xì)胞球，從而把干細(xì)胞從細(xì)胞混合物中分離并維持細(xì)胞 的正常生長[1-6]。但是，受細(xì)胞培養(yǎng)條件限制及組織來源等因素的限制，常規(guī)方法最終能 夠獲得的細(xì)胞數(shù)量十分有限。此外，大部分神經(jīng)干細(xì)胞在體外傳代20代后都會出現(xiàn)退化， 并且神經(jīng)干細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境要求比較嚴(yán)格，容易出現(xiàn)因環(huán)境變化導(dǎo)致的細(xì)胞品質(zhì)改變等問 題，所有這些因素都導(dǎo)致了神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用以及工業(yè)化生產(chǎn)受到限制[2， 5-6]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)分子或生物分子能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，從而在短時(shí) 間內(nèi)獲取大量細(xì)胞，但是，化學(xué)分子或生物分子除了對細(xì)胞增殖的效應(yīng)，往往對干細(xì)胞的其 他方面產(chǎn)生額外的效應(yīng)，即它們在影響細(xì)胞增殖的同時(shí)也會可能會導(dǎo)致細(xì)胞自身品質(zhì)的改 變，所以存在風(fēng)險(xiǎn)[7-10]。另外一個(gè)不可避免的問題是化學(xué)分子或生物分子的使用為后續(xù) 的科學(xué)研究或臨床及工業(yè)應(yīng)用埋下隱患，難以祛除。
[0003] 亞磁環(huán)境是一種物理環(huán)境，是利用設(shè)備把環(huán)境中磁場屏蔽之后產(chǎn)生的一種磁場強(qiáng) 度極低的環(huán)境。過去的研究中，科學(xué)界一直沒有對亞磁環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)給出一個(gè)明確的定義， 近期中國科學(xué)院生物物理所赫榮喬研究組發(fā)表的文章把亞地磁場定義為磁場總強(qiáng)度小于 500nT的磁場環(huán)境[11]。經(jīng)過過去幾十年的研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)亞磁場對動物的生長、發(fā)育、 行為，植物的生長、發(fā)育，微生物增殖、抗藥性，細(xì)胞的增殖、形態(tài)等生物學(xué)過程產(chǎn)生不同的 效應(yīng)[12-19]。這些結(jié)果說明亞磁擁有十分廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，因此，亞磁相關(guān)研究引起了 廣泛的關(guān)注。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在亞地磁場環(huán)境中生長的神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度顯著增加，但 細(xì)胞增殖能力和分化能力沒有發(fā)生顯著改變。由于細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不引入額外化學(xué)分子 或生物分子的干擾，并且在短時(shí)間內(nèi)能得到與常規(guī)方法相比數(shù)倍的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞，所以，這種方 法極大的降低成本，提高效率。
[0005] 更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)：
[0006] 1. -種提高干細(xì)胞培養(yǎng)效率的方法，所述方法包括在亞磁環(huán)境下培養(yǎng)干細(xì)胞。
[0007] 2.根據(jù)1所述的方法，其中所述亞磁環(huán)境是通過屏蔽環(huán)境磁場產(chǎn)生的。
[0008] 3.根據(jù)1所述的方法，其中所述亞磁環(huán)境的磁場總強(qiáng)度小于500ηΤ。
[0009] 4.根據(jù)1所述的方法，其中所述干細(xì)胞來自于哺乳動物，所述哺乳動物選自人、 狗、貓、馬、牛、兔、猴、大鼠、小鼠。
[0010] 5.根據(jù)4所述的方法，其中所述干細(xì)胞來自于人。
[0011] 6.根據(jù)1所述的方法，其中所述干細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。
[0012] 7.根據(jù)6所述的方法，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞包括原代培養(yǎng)腦來源神經(jīng)干細(xì)胞、純 化的神經(jīng)干細(xì)胞、大鼠 SVZ來源神經(jīng)干細(xì)胞，人胚胎來源神經(jīng)干細(xì)胞。
[0013] 8.利用根據(jù)1-7中任一項(xiàng)所述的方法培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1 :亞磁環(huán)境（hypogeomagnetic field, HGMF)磁場強(qiáng)度分布示意圖，虛線標(biāo)出 為放置細(xì)胞的位置。
[0015] 圖2 :地磁場（geomagnetic field,GMF)環(huán)境磁場強(qiáng)度分布示意圖，虛線標(biāo)出為放 置細(xì)胞的位置。
[0016] 圖3 :在地磁（GMF)或亞磁（HGMF)環(huán)境中生長的神經(jīng)干細(xì)胞形成的神經(jīng)球。
[0017] 圖4 :培養(yǎng)7天后分別統(tǒng)計(jì)地磁（GMF)和亞磁（HGMF)環(huán)境中生長的神經(jīng)干細(xì)胞細(xì) 胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)亞磁中得到3倍于地磁數(shù)量的細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有極顯著差異（t-test，***， P〈0. 001)。
[0018] 圖5 :統(tǒng)計(jì)生長于96孔板中細(xì)胞球，結(jié)果顯示亞磁中的細(xì)胞形成更多體積大神經(jīng) 球（直徑大于1〇〇 U m)。
[0019] 圖6 :統(tǒng)計(jì)每1000個(gè)原代細(xì)胞形成的神經(jīng)球數(shù)目，結(jié)果成球率沒有出現(xiàn)顯著差異。
[0020] 圖7 :連續(xù)亞磁處理兩次的神經(jīng)干細(xì)胞，其增殖能力與亞磁處理一次的細(xì)胞相同， 但是，它們所獲得細(xì)胞數(shù)量都高于地磁組。亞磁處理后的細(xì)胞重新種在地磁環(huán)境中，與持續(xù) 地磁處理組相比，細(xì)胞數(shù)目沒有出現(xiàn)顯著差異。
[0021] 圖8 :生長于亞磁中的神經(jīng)球能連續(xù)傳代10代以上。
[0022] 圖9 :在地磁（GMF)和亞磁（HGMF)環(huán)境中生長的神經(jīng)球經(jīng)4%多聚甲醛固定后， 免疫細(xì)胞化學(xué)顯示細(xì)胞球?yàn)镹estin陽性（紅色），分化后能形成神經(jīng)元（β 3-Tubulin陽 性，綠色）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽性，紅色），所有細(xì)胞細(xì)胞核用Hochest染色（藍(lán)色） (bar=50 μ m) 〇

【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明中所指的"亞磁環(huán)境"是指通過磁屏蔽線圈或磁屏蔽箱獲得的總磁場強(qiáng)度 小于500nT的磁場環(huán)境。
[0024] 實(shí)施例1、亞磁細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境控制
[0025] 在錯(cuò)合金制作的支架上，用磁屏蔽金屬坡莫合金（厚度：0. 5mm，磁通透性：20000, 購自北京首都鋼鐵有限公司））包裹制作成磁屏蔽箱，纏繞層數(shù)12層，箱體最終尺寸為 470mm*641mm*6511mm (長*寬*高）。在箱體頂部開數(shù)個(gè)小孔（直徑0. 5mm)，分別安裝進(jìn)氣 扇和出氣扇，箱體邊側(cè)開門。為了保持箱體內(nèi)適合細(xì)胞生長的環(huán)境，亞磁屏蔽箱被放置在一 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERA240，Thermo Fisher Scientific，USA)中，細(xì)胞培養(yǎng)箱的環(huán)境保持為適 宜細(xì)胞生長的條件：溫度37°C，濕度95%，C02濃度5%。通過運(yùn)行磁屏蔽箱頂部的風(fēng)扇，箱體 內(nèi)的環(huán)境與外部進(jìn)行交換，保持內(nèi)外環(huán)境一致[12,15]。用溫度計(jì)和濕度計(jì)（Smart Sensor AR827, Smart Sensor，HongKong)檢測溫度和濕度，用（1)2計(jì)（Labotec Incubator Control 1050，Labotec，Rosdorf，Germany)檢測箱體內(nèi)(302濃度，發(fā)現(xiàn)內(nèi)外環(huán)境一致。磁場總強(qiáng)度用 三軸磁強(qiáng)計(jì)（APS Model 520 3-Axis Fluxgate Magnetometer，Applied Physics Systems， Mountain View，CA，USA)檢測，檢測結(jié)果見圖1、圖2。
[0026] 實(shí)施例2、神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)
[0027] 材料：C57BL/6小鼠（購自北京斯貝福公司）
[0028] 溶液：HEM 溶液，MEM(GIBCO,415〇〇-〇l8) -袋，HEPES (Sigma，H4〇34)3· 81：3g，力口 ddH20 至 0· 875L，添加 2% 雙抗（Penicillin/Streptomycin，Gibco, 14140-122)
[0029] NSA 溶液，（DMEM/F12(Gibco, 12500-062) -袋，Glucose (Sigma，G7021)3. 75g，碳 酸氫鈉（Sigma，S5761) 1. 125g，HEPES1. 192g，加 ddH20 至 0· 9L。
[0030] NSA-/-溶液，（50mL)，NSA 44mL，10%BSA(Roche，10711454001) lmL，Proliferation Supplement (Stem Cell Technologies, 05701) 5mL,雙抗 l%〇
[0031] NSA+/+ 溶液，（50mL)，NSA-/-50mL，！feparin(Sigma，H3149,3. 78mg/mL)50y L, EGF(BD Bioscience,354010,1 μ g/mL)100 μ L, bFGF (Roche,11104616001,0. 1 μ g/ mL)50 μ L〇
[0032] 0· 05%胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶（Sigma，T5266)0. 05g，EDTA(Sigma，E6158)0. 004g, 加 PBS 100mL。
[0033] 胰蛋白酶抑制劑溶液，胰蛋白酶抑制劑（Sigma，T6522) 11. 2mg，DNase I (Roche， 10104159001，lmg/mL)0. 8mL，HEM 79. 2mL。
[0034] 操作步驟：
[0035] 1.新生P2小鼠，用70%酒精消毒后，壓迫頸椎處死，在無菌環(huán)境中完整取出腦，浸 泡在冰冷的HEM溶液中。
[0036] 2. P15或成年小鼠，70%酒精消毒后，頸椎脫臼處死，在無菌環(huán)境中取出腦，浸泡在 冰冷的HEM中。在體視顯微鏡下，取出SVZ區(qū)組織放在冰冷的HEM溶液中（操作視頻http: // www. stemcell· com/en/Technical-Resources/Multimedia· aspx)〇
[0037] 3.用剪刀將組織破碎成大塊，加6mL 0. 05%胰酶后轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，37°C消 化 10min。
[0038] 4.在混懸液中加入等體積的胰蛋白酶抑制劑終止消化，室溫靜止3分鐘后在100g 離心5分鐘。
[0039] 5.去上清液，在沉淀物中加入2mL NSA+/+，反復(fù)吹打把組織打散成單細(xì)胞懸液。
[0040] 6.細(xì)胞懸液用 40 μ m濾網(wǎng)（BD Bioscience，354020)過濾，用額外 2mLNSA+/+沖洗 離心管和濾網(wǎng)，獲得的所有濾液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
[0041] 7.再次在100g離心5分鐘，去上清液，沉淀物用l-2mL NSA+/+重懸獲得細(xì)胞懸 液。
[0042] 8.用血球計(jì)數(shù)板數(shù)計(jì)算細(xì)胞密度。按照80萬細(xì)胞每T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（BD Falcon) 接種，添加5mL NSA+/+ ;1000個(gè)細(xì)胞/孔，200μ L NSA+/+，分別放在地磁和實(shí)施例1中的亞 磁環(huán)境中培養(yǎng)，7天后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目或統(tǒng)計(jì)神經(jīng)球數(shù)目和大小。
[0043] 結(jié)果分析：
[0044] 結(jié)果顯示，生活在地磁和亞磁中的細(xì)胞都能形成形態(tài)正常的神經(jīng)球（圖3)，統(tǒng)計(jì) 細(xì)胞數(shù)目發(fā)現(xiàn)，亞磁中獲得3倍于地磁的細(xì)胞數(shù)量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有極顯著差異（***，Ρ值 〈0. 001)(圖4)，結(jié)果說明，亞磁處理能獲得更多數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)生長在96孔板 中的細(xì)胞球發(fā)現(xiàn)，原代神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞的成球率（原代細(xì)胞形成的神經(jīng)球數(shù)量與接種細(xì)胞 數(shù)量比值），地磁為2. 96%±0. 24%，亞磁為3. 34%±0. 16%，二者之間沒有顯著差異（圖6)， 這說明亞磁處理沒有影響到細(xì)胞的成球能力。干細(xì)胞的成球能力反應(yīng)了細(xì)胞的干性水平 [20]，這個(gè)結(jié)果說明亞磁處理沒有影響到細(xì)胞的干性。另外，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞球的大小，我們發(fā)現(xiàn) 生長在亞磁中細(xì)胞形成直徑大細(xì)胞球（直徑大于100 μ m)的數(shù)量高于地磁，地磁環(huán)境中形 成的神經(jīng)球大球比例為22. 16%±1. 42%，亞磁環(huán)境中大球的比率為42. 56%±1. 16%，二者之 間存在極顯著差異（t-test，*#，P值〈0. 001)(圖3,圖5)，該結(jié)果說明亞磁是通過促進(jìn)細(xì) 胞增殖來獲得更多數(shù)量的細(xì)胞。
[0045] 實(shí)施例3、神經(jīng)干細(xì)胞傳代
[0046] 操作步驟
[0047] 1.原代神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞在亞磁環(huán)境中培養(yǎng)7天（如在實(shí)施例2中所述）后，收集 所有的神經(jīng)球，在l〇〇g離心5分鐘。
[0048] 2.添加0. 05%胰酶或accutase在常溫消化3分鐘，加入等量胰蛋白酶抑制劑，輕 輕混勻。在l〇〇g離心5分鐘。
[0049] 3.吸去上清后，加入l_2mL NSA+/+，反復(fù)吹打制成成單細(xì)胞備懸液。
[0050] 4.按照10萬細(xì)胞接種到60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（Corning)，添加5mLNSA+/+ ; 1000個(gè)細(xì) 胞每孔，200 μ L NSA+/+，分別放在地磁和亞磁環(huán)境中培養(yǎng)，7天后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目或統(tǒng)計(jì)神經(jīng) 球數(shù)目和大小。
[0051] 結(jié)果分析：
[0052] 結(jié)果顯示，生長在地磁和亞磁中的神經(jīng)球都能正常傳代，生長于亞磁中的細(xì)胞分 別接種在地磁和亞磁環(huán)境中，7天后計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，亞磁處理一次和兩次的細(xì)胞數(shù)量沒有顯 著差異，但是，它們的數(shù)量都高于地磁中獲得細(xì)胞數(shù)量。亞磁中細(xì)胞重新種在地磁環(huán)境中 后，細(xì)胞數(shù)量與地磁相比沒有顯著差異（圖7)，說明亞磁效應(yīng)不會出現(xiàn)累積，并且一旦脫離 亞磁環(huán)境，亞磁效應(yīng)消失。亞磁大神經(jīng)球能連續(xù)傳代10代以上（圖8)，顯示亞磁處理并不 會降低細(xì)胞的增殖能力。
[0053] 實(shí)施例4、神經(jīng)球分化與免疫組化染色
[0054] 操作步驟
[0055] 1.玻片預(yù)處理，直徑10mm的玻片用酸液處理后，流水洗凈，滅菌。玻片放 到24孔板中，每孔一個(gè)，添加0. 5mL包埋液（15mL包埋液包含12. 45mL PBS，0. 3mL Laminin (Invitrogen, 23017-015), 2. 25mL Poly-〇rnithine (Sigma，P4957))，在 37°C孵育 至少三個(gè)小時(shí)。包埋結(jié)束后吸去包埋也，用PBS清洗6遍備用。
[0056] 2.神經(jīng)球分化，分別收集在地磁和亞磁中生長7天的神經(jīng)球（如在實(shí)施例2中所 述），在100g離心3分鐘后，除去上清，用NSA-/-重懸細(xì)胞球。
[0057] 3.根據(jù)細(xì)胞球的密度把細(xì)胞球種到玻片上，每孔細(xì)胞球的數(shù)量在50-100之間。
[0058] 4.免疫組化染色，分化的細(xì)胞球用4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS清洗三遍，37°C 封閉液（包含5%山羊血清，5%胎牛血清，0. l%Twen-20)孵育60分鐘。用封閉液稀釋的 一抗抗體 Nestin(l: 100, R&D Systems，MAB2736)或 β 3-Tubulin (1:200, CST，5666)與 GFAP(1:200，CST，3670)在 4°C 孵育過夜，PBST(PBS，添加 0. l%Twen-20)清洗 5 分鐘，共三次。 封閉液稀釋的二抗抗體Alexa Fluor 568抗小鼠抗體（1:1000; Invitrogen, A11061)，Alexa Fluor488 抗兔抗體（1:1000; Invitrogen，A11008)，以及 DAPI (1:2000; Sigma-Aldrich， D9564)在常溫孵育3小時(shí)或在4°C孵育過夜。PBST清洗5分鐘，共三次，用封閉液封閉。封 閉后的片子用熒光顯微鏡觀察并拍照。
[0059] 結(jié)果分析：
[0060] 免疫組織化學(xué)顯示，生長在地磁或亞磁中的細(xì)胞球都顯示Nestin陽性（神經(jīng)干 細(xì)胞特異性標(biāo)記，熒光為紅色）（圖7a，b)，顯示地磁和亞磁中的神經(jīng)球中含有神經(jīng)干細(xì)胞。 神經(jīng)球分化后，分化產(chǎn)物中包含神經(jīng)元（β 3-Tubulin陽性，熒光為紅色）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 (GFAP陽性，熒光為綠色）。DAPI用于染核（熒光顯示藍(lán)色）（圖7c，d)，結(jié)果說明獲得的神 經(jīng)球是有多向分化能力的。這些結(jié)果證明在亞磁中生長的細(xì)胞沒有失去干細(xì)胞的性質(zhì)。
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【權(quán)利要求】
1. 一種提高干細(xì)胞培養(yǎng)效率的方法，所述方法包括在亞磁環(huán)境下培養(yǎng)干細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述亞磁環(huán)境是通過屏蔽環(huán)境磁場產(chǎn)生的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述亞磁環(huán)境的磁場總強(qiáng)度小于500nT。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述干細(xì)胞來自于哺乳動物，所述哺乳動物選自 人、狗、貓、馬、牛、兔、猴、大鼠、小鼠。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述干細(xì)胞來自于人。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述干細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞包括原代培養(yǎng)腦來源神經(jīng)干細(xì) 胞、純化的神經(jīng)干細(xì)胞、大鼠 SVZ來源神經(jīng)干細(xì)胞，人胚胎來源神經(jīng)干細(xì)胞。
8. 利用根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/0797GK104087553SQ201310450694
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】赫榮喬, 劉纓, 付晶鵬, 莫煒川 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所