一種普通鐮刀菌、制備降粘酶的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種普通鐮刀菌，利用該普通鐮刀菌制備降粘酶的方法及其應(yīng)用。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中降低甘薯發(fā)酵醪液粘度存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種能夠生產(chǎn)降粘酶的菌種。普通鐮刀菌CBS131819采集自隨機(jī)選取的自然狀下腐爛的甘薯塊莖，已保藏于荷蘭皇家藝術(shù)與科學(xué)學(xué)院荷蘭微生物菌種保藏中心，保藏日期2012年1月27日。普通鐮刀菌CBS131819可應(yīng)用于制備降粘酶，所產(chǎn)降粘酶活性高、用量少、作用時(shí)間短、降粘效果好。該菌可應(yīng)用于甘薯塊莖發(fā)酵醪液降粘，并可進(jìn)一步應(yīng)用于甘薯類(lèi)燃料乙醇發(fā)酵工藝的前期降粘預(yù)處理中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種普通鐮刀菌、制備降粘酶的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種普通鐮刀菌、利用該菌種制備降粘酶的方法及其應(yīng)用，特別是涉及一種可應(yīng)用于甘薯塊莖發(fā)酵降粘的普通鐮刀菌及其應(yīng)用，屬于微生物及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]生物質(zhì)燃料乙醇即采用植物等生物質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)無(wú)水乙醇，再加入體積比5%左右的變性劑(一般為無(wú)鉛汽油或無(wú)鉛的烴類(lèi))使之成為含水量小于0.8%且不可食用的變性無(wú)水乙醇。燃料乙醇是一種良好的汽油增氧劑與辛烷值調(diào)和組分，能有效降低汽車(chē)尾氣中的一氧化碳含量，從而真正實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排。生物質(zhì)燃料乙醇作為一種可再生能源，因其能緩解能源危機(jī)，穩(wěn)定糧食生產(chǎn)，增加就業(yè)機(jī)會(huì)和農(nóng)民收入，減少環(huán)境污染而備受關(guān)注并成為各國(guó)競(jìng)相研發(fā)的重要課題之一。2007年，我國(guó)正式宣布停止一切以糧食原料生產(chǎn)燃料乙醇的項(xiàng)目，鼓勵(lì)發(fā)展甘薯、甘蔗、甜高粱等非糧食原料生產(chǎn)燃料乙醇。甘薯燃料乙醇發(fā)酵醪液是一種典型的非牛頓流體(一般的發(fā)酵液粘度小于0.1Pa.S)，具有粘度大的特點(diǎn)
IOOPa.S)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中傳質(zhì)傳熱等產(chǎn)生影響，從而降低發(fā)酵效率、延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間、減少最終乙醇濃度，并且容易堵塞管路、增加能耗。因而醪液粘度高是甘薯高濃度發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的瓶頸之一。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，降低甘薯發(fā)酵醪液粘度基本有兩種方法，一是添加發(fā)酵用水降低粘度，二是添加木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶等商品酶或者其混合物，促進(jìn)α-淀粉酶與淀粉顆粒接觸，提高淀粉顆粒利用效`率。這兩種方法均存在各自的技術(shù)缺陷:前者不僅增加了生產(chǎn)用水量，還降低了酒精成品產(chǎn)量，不能解決實(shí)際問(wèn)題；后者使用商品酶作為一種快速預(yù)處理方法，增加了生產(chǎn)成本，不利于燃料乙醇規(guī)?；a(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠生產(chǎn)降粘酶的菌種，及其制備降粘酶以及在甘薯發(fā)酵降粘中的應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種普通鐮刀菌:
[0006]普通鐮刀菌XYL-1，保藏于CBS-KNAW，保藏號(hào)為CBS131819，保藏日期為2012年I月27日。
[0007]普通鐮刀菌CBS131819屬普通鐮刀菌(Fusarium commune),已保藏于荷蘭皇家藝術(shù)與科學(xué)學(xué)院荷蘭微生物菌種保藏中心(Royal Netherlands Academy of Arts andSciences, The Centraalbureau voor Schimmelcultures, CBS-KNAW),保藏日期 2012 年 I月27日，保藏編號(hào)CBS131819。CBS-KNAW機(jī)構(gòu)地址:8Uppsalalaan，3584CT，荷蘭烏得勒支(Uppsalalaan8, 3584CT Utrecht the Netherlands)。
[0008]普通鐮刀菌CBS131819采集自隨機(jī)選取的自然狀下腐爛的甘薯塊莖。篩選過(guò)程為:腐爛的甘薯塊莖制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后接種至篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3d，PDA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)7d，剛果紅染液染色，挑選出黃色透明圈大且明顯的菌株。篩選培養(yǎng)基的組成為:木聚糖(Xylan) 10g/L,酵母膏 4.5g/L，(NH4)2S044.5g/L，NaC15.0g/L,K2HP042.0g/L,MgSO4 *7H200.4g/L，瓊脂15g/L，pH6.0。剛果紅染液染色步驟為:菌落挑取后，利用1%剛果紅染液染色lOmin，倒掉染色液然后用lmol/L NaCl溶液潤(rùn)洗3次，每次lOmin。
[0009]本發(fā)明菌落在PDA培養(yǎng)基上菌絲白色，菌絲發(fā)達(dá)，疏松，四周擴(kuò)展。顯微鏡下觀察，菌株小型分生孢子卵形或微彎曲成腎型，大型分生孢子鐮刀型，兩端稍尖，3~5個(gè)分隔。
[0010]普通鐮刀菌CBS131819可應(yīng)用于降粘酶制備。
[0011]本發(fā)明還提供一種降粘酶制備方法，其技術(shù)方案如下:
[0012]一種降粘酶制備方法，其特征在于:將普通鐮刀菌CBS131819接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、130rpm下培養(yǎng)4d~5d，制得降粘酶粗酶液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基是(g/L):風(fēng)干玉米芯 20、蛋白胨 3.0、酵母膏 0.5、ΚΗ2Ρ042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005,ZnSO4.7Η200.0014,MnSO4.Η200.0016,COCl2.6Η200.0016,Tween-803.3、ρΗ5.00
[0013]在優(yōu)選條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基是(g/L):風(fēng)干玉米芯20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ6.5。
[0014]以上述方法制得的降粘酶粗酶液，是多種酶的混合液，Pedersen et al.(2009)經(jīng)報(bào)道的AZCL分析方法分析 顯示，降粘酶粗酶液組成為:內(nèi)切-l，4-13-D-木聚糖酶32 (藍(lán)色水解環(huán)直徑/_，下同)，內(nèi)切-纖維素酶19.5,內(nèi)切-1，4-β -D-半乳聚糖酶15.6,內(nèi)切-1，4- β -D-甘露聚糖酶15，內(nèi)切-1，5- a -L-阿拉伯聚糖酶14，α -淀粉酶14，β -葡聚糖酶13，內(nèi)切-1，3- β -D-葡聚糖酶7，鼠李糖半乳聚糖醛酸裂解酶10?；诖?，本發(fā)明提供一種降粘酶組合物，具體技術(shù)方案是:
[0015]一種降粘酶組合物，其特征在于:依照如下方法制得:將普通鐮刀菌CBS131819接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、130rpm下培養(yǎng)4d~5d，制得降粘酶組合物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基是如下二種之一:
[0016]發(fā)酵培養(yǎng)基一(g/L):風(fēng)干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016, Tween-803.3、ρΗ5.0 ；
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基二(g/L):風(fēng)干玉米芯20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ6.5。
[0018]上述降粘酶組合物可以經(jīng)離心，取上清液0.22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾提純。
[0019]利用上述方法制得的降粘酶組合物，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種甘薯塊莖發(fā)酵降粘的方法，其技術(shù)方案如下:
[0020]一種利用上述降粘酶組合物實(shí)施的甘薯塊莖發(fā)酵降粘的方法，其特征在于:向甘薯塊莖漿中添加反應(yīng)酶液，50°C、ISOrpm條件下滅菌2h ;所述反應(yīng)酶液是降粘酶粗酶液。
[0021]在優(yōu)選條件下，上述方法的甘薯塊莖漿制備方法是:步驟S1、甘薯塊莖原料洗凈、打漿制得甘薯塊莖原漿；步驟S2、按照90~150KNU/kg淀粉在甘薯塊莖原漿中添加α -淀粉酶，80°C~90°C反應(yīng)至碘反應(yīng)為紅棕色，冷卻至室溫后按甘薯塊莖原漿料水重量比3:1加水；115°C條件下滅菌20min，制得甘薯塊莖漿。
[0022]上述甘薯塊莖發(fā)酵降粘的方法可以應(yīng)用于甘薯燃料乙醇發(fā)酵工藝中。具體是應(yīng)用于鮮甘薯類(lèi)燃料乙醇發(fā)酵工藝的前期降粘預(yù)處理中。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:(1)提供了新的普通鐮刀菌CBS131819(普通鐮刀菌XYL-1) ;(2)普通鐮刀菌CBS131819可應(yīng)用于制備降粘酶，普通鐮刀菌CBS131819所產(chǎn)降粘酶活性高、用量少、作用時(shí)間短、降粘效果好；(3)普通鐮刀菌CBS131819可應(yīng)用于甘薯塊莖發(fā)酵醪液降粘；(4)利用普通鐮刀菌CBS131819實(shí)施的甘薯塊莖發(fā)酵降粘方法可應(yīng)用于甘薯燃料乙醇發(fā)酵工藝中。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例、對(duì)照例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述。
[0025]實(shí)施例一
[0026]本實(shí)施例記載普通鐮刀菌CBS131819的篩選方法。
[0027]腐爛甘薯塊莖:自然狀態(tài)下腐爛甘薯塊莖。
[0028]篩選過(guò)程為:隨機(jī)取自然狀態(tài)下腐爛甘薯塊莖5g于IOOmL三角瓶，加入20mL無(wú)菌水，室溫180rpm，30min,得到菌懸液；按照經(jīng)典的涂布稀釋平板法，經(jīng)10' 10_2、10' 10_4、ιο'ιο'ιο—7梯度稀釋后，分別取ιοομυοΛιοΛιο—7濃度的菌懸液涂布于篩選培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3d，挑取平板上生長(zhǎng)較大的單菌落到PDA斜面培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)7d，然后用剛果紅染液染色， 挑選出黃色透明圈大且明顯的菌株。
[0029]篩選培養(yǎng)基的組成為:木聚糖(Xylan) 10g/L,酵母膏4.5g/L，(NH4)2S044.5g/L，NaC15.0g/L, K2HP042.0g/L, MgSO4.7H200.4g/L,瓊脂 15g/L, pH6.0。
[0030]剛果紅染液染色步驟為:菌落挑取后，利用1%剛果紅染液染色lOmin，倒掉染色液然后用lmol/L NaCl溶液潤(rùn)洗3次，每次lOmin。
[0031]本實(shí)施例篩選得到的菌落在PDA培養(yǎng)基上菌絲白色，菌絲發(fā)達(dá)，疏松，四周擴(kuò)展。顯微鏡下觀察，菌株小型分生孢子卵形或微彎曲成腎型，大型分生孢子鐮刀型，兩端稍尖，3~5個(gè)分隔。經(jīng)鑒定屬普通鐮刀菌(Fusarium commune),命名為普通鐮刀菌XYL-1。
[0032]實(shí)施例二
[0033]本實(shí)施例記載普通鐮刀菌CBS131819制備降粘酶的方法。
[0034]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):風(fēng)干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016, Tween-803.3、ρΗ5.0。
[0035]制備操作:將普通鐮刀菌CBS131819接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、130rpm下培養(yǎng)4d，制得降粘酶粗酶液。
[0036]實(shí)施例三
[0037]本實(shí)施例記載普通鐮刀菌CBS131819制備降粘酶的方法，其與實(shí)施例二相同之處不再重復(fù)，其不同之處在于，將普通鐮刀菌CBS131819接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，300C、130rpm下培養(yǎng)5d，制得降粘酶粗酶液。
[0038]實(shí)施例四
[0039]本實(shí)施例記載普通鐮刀菌CBS131819制備降粘酶的方法。[0040]優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):風(fēng)干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016, Tween-803.3、ρΗ5.0。
[0041]制備操作同實(shí)施例二。
[0042]實(shí)施例五
[0043]本實(shí)施例記載普通鐮刀菌CBS131819制備降粘酶的方法，其與實(shí)施例四相同之處不再重復(fù)，其不同之處在于:將普通鐮刀菌CBS131819接種于優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、130rpm下培養(yǎng)5d，制得降粘酶粗酶液。
[0044]實(shí)施例六
[0045]本實(shí)施例記載普通鐮刀菌CBS131819制備降粘酶的方法，其與實(shí)施例五相同之處不再重復(fù)，其不同之處在于:將普通鐮刀菌CBS131819接種于200ml發(fā)酵培養(yǎng)基(其中普通鐮刀菌CBS131819接種量與發(fā)酵培養(yǎng)基用量放大相同倍數(shù))，30°C、130rpm下培養(yǎng)5d，制得降粘酶粗酶液。
[0046]實(shí)施例七
[0047]本實(shí)施例記載甘薯塊莖發(fā)酵降粘的方法。
[0048]粘度測(cè)定儀器:上海尼潤(rùn)智能科技有限公司生產(chǎn)的RDV-2+PR0型數(shù)字式旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)。
[0049]α -淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)酶活力為90KNU/g，酶活定義為在37°C，pH5.6時(shí)，每小時(shí)水解5.26克淀粉的酶量為I個(gè)KNU。
[0050]步驟S1、甘薯塊莖原料洗凈、打漿制得甘薯塊莖原漿。
[0051]步驟S2、按照90~150KNU/kg淀粉在甘薯塊莖原漿中添加α -淀粉酶，80°C~90°C反應(yīng)至碘反應(yīng)為紅棕色，冷卻至室溫后按甘薯塊莖原漿料水重量比3:1加水；115°C條件下滅菌20min，制得甘薯塊莖漿。
[0052]步驟S3、降粘酶粗酶液經(jīng)離心，取上清液經(jīng)0.22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾制得反應(yīng)酶液。
[0053]步驟S4、向步驟S2所得甘薯塊莖漿中添加反應(yīng)酶液，50 0C、180rpm條件下反應(yīng)2h，測(cè)量粘度值；降粘酶粗酶液來(lái)源、加入量及降粘效果如下表1所示。
[0054]對(duì)照處理:取50g或100g步驟S2所得甘薯塊莖漿加入2mL或4mL無(wú)菌水，50°C、180rpm條件下作用2h后，測(cè)定粘度值為19686mPa.s~23042.5mPa.S。
[0055]表1反應(yīng)酶液及粘度測(cè)定結(jié)果
[0056]
【權(quán)利要求】
1.普通鐮刀菌CBS131819，保藏于CBS-KNAW，保藏號(hào)為CBS131819，保藏日期為2012年I月27日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的普通鐮刀菌CBS131819在制備降粘酶中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的普通鐮刀菌CBS131819的篩選方法，其特征在于:腐爛的甘薯塊莖制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后接種至篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3d，PDA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)7d，剛果紅染液染色，挑選出黃色透明圈大且明顯的菌株；所述篩選培養(yǎng)基為(g/L):木聚糖 10，酵母膏 4.5，(NH4) 2S044.5，NaC15.0, Κ2ΗΡ042.0, MgSO4.7Η200.4，瓊脂 15，ρΗ6.00
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述菌懸液制備是將甘薯塊莖5g于IOOmL三角瓶,加入20mL無(wú)菌水，室溫180rpm, 30min,得到菌懸液；所述梯度稀釋是按照經(jīng)典的涂布稀釋平板法，經(jīng)梯度稀釋后，分別取100 μ L10_5，10_6，10_7濃度的菌懸液涂布于篩選培養(yǎng)基上。
5.—種降粘酶制備方法，其特征在于:將普通鐮刀菌CBS131819接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、130rpm下培養(yǎng)4d~5d，制得降粘酶粗酶液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基是如下二種之一: 發(fā)酵培養(yǎng)基一(g/L):風(fēng)干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl 20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ5.0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基二(g/L):風(fēng)干玉米芯 20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgS04.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005,ZnSO4.7Η200.0014,MnSO4.Η200.0016,COCl2.6Η200.0016,Tween-803.3、ρΗ6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)天數(shù)為5d。
7.—種降粘酶組合物，其特征在于:依照如下方法制得:將普通鐮刀菌CBS131819接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C、130rpm下培養(yǎng)4d~5d，制得降粘酶組合物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基是如下二種之一: 發(fā)酵培養(yǎng)基一(g/L):風(fēng)干玉米芯20、蛋白胨3.0、酵母膏0.5、KH2P042.0、(NH4)2SO4L 5、MgSO4.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005、ZnSO4.7Η200.0014、MnSO4.H2O0.0016、COCl2.6Η200.0016、Tween-803.3、ρΗ5.0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基二(g/L):風(fēng)干玉米芯 20、ΚΗ2Ρ042.0、ΝΗ4Ν034.5、MgS04.7Η200.15、CaCl20.3、FeSO4.7Η200.0005,ZnSO4.7Η200.0014,MnSO4.Η200.0016,COCl2.6Η200.0016,Tween-803.3、ρΗ6.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的降粘酶組合物，其特征在于:經(jīng)離心，取上清液經(jīng)0.22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾提純。
9.利用權(quán)利要求7或8所述的降粘酶組合物實(shí)施的甘薯塊莖發(fā)酵降粘的方法，其特征在于:向甘薯塊莖漿中添加反應(yīng)酶液，50°C、ISOrpm條件下反應(yīng)2h ;所述反應(yīng)酶液是降粘酶組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的甘薯塊莖發(fā)酵降粘的方法在甘薯燃料乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/00GK103525709SQ201310451257
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】趙海, 靳艷玲, 方揚(yáng), 黃玉紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所