毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種毛乳頭(DP)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法能夠長期培養(yǎng)DP細(xì)胞，并成功應(yīng)用于DP細(xì)胞建系。
【專利說明】毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]毛發(fā)在皮膚特定部位具有相應(yīng)的密度及形態(tài)，它對(duì)人體具有防御、保護(hù)功能外，還具有增加信息交流和美觀的作用。毛發(fā)由毛囊生成，毛囊具有周期性再生的特性，即經(jīng)歷生長期、退化期、靜止期的循環(huán)。其中，由靜止期向生長期的轉(zhuǎn)換，即生長期啟動(dòng)為最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。當(dāng)毛囊的周期性再生功能發(fā)生障礙時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)脫發(fā)、斑禿等毛囊相關(guān)疾病。隨著社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)具有保護(hù)與美觀作用的毛發(fā)越來越重視，對(duì)毛囊周期性再生的研究將顯得越來越重要。
[0003]由于毛囊具有周期性生長的特性，為組織再生研究提供了一個(gè)非常好的模型。毛囊的周期性生長由毛囊干細(xì)胞介導(dǎo)發(fā)生，和其他干細(xì)胞一樣，毛囊干細(xì)胞的靜息與活化受到干細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控。毛囊干細(xì)胞位于毛囊隆突區(qū)，人們對(duì)影響毛囊干細(xì)胞自我更新和分化的微環(huán)境因素了解的還不多。
[0004]特別引人注意的是，在毛囊干細(xì)胞的周期性活動(dòng)過程中，毛乳頭(dermalpapilla,DP)居于非常特殊的地位。DP是真皮中的一群特化的間充質(zhì)來源的細(xì)胞。大量研究表明:出生后的每一個(gè)毛囊周期中DP和毛囊干細(xì)胞均會(huì)發(fā)生定期的，規(guī)律性的接觸，而這種接觸在靜止期末或生長期啟動(dòng)時(shí)最為緊密，說明DP細(xì)胞可能為毛囊干細(xì)胞提供微環(huán)境支持，并在毛囊周期性再生的起始階段發(fā)揮作用?；蚯贸芯堪l(fā)現(xiàn)，DP缺失，不能形成完整的毛囊2 ;隨后又發(fā)現(xiàn)，DP是一個(gè)分泌因子的中心，可以生成大量的信號(hào)分子；最近的研究表明，這些信號(hào)分子所激活的信號(hào)通路是毛囊周期性生長的重要調(diào)控因素，它們?cè)诿疑L的不同時(shí)期發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。
[0005]已有報(bào)道，將DP細(xì)胞制成微囊能夠誘導(dǎo)大鼠耳毛囊再生，并有將人DP細(xì)胞條件培養(yǎng)液用于斑禿治療的臨床試驗(yàn)報(bào)道。這些應(yīng)用都需要大量的DP細(xì)胞，因此，DP細(xì)胞的大量培養(yǎng)是毛囊周期相關(guān)疾病治療需要解決的關(guān)鍵技術(shù)之一。不少學(xué)者嘗試進(jìn)行DP細(xì)胞原代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著DP細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)的增加，其生物學(xué)活性快速改變；當(dāng)傳代至第6代時(shí)，細(xì)胞喪失誘導(dǎo)毛囊生長的特性。
[0006]可見，DP細(xì)胞在毛囊周期中具有極其重要的作用。因此，獲取大量的DP細(xì)胞就成為治療毛囊周期障礙相關(guān)疾病的重要條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種毛乳頭(DP)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)體系能夠長期培養(yǎng)DP細(xì)胞，并成功應(yīng)用于DP細(xì)胞建系。
[0008]本發(fā)明一方面涉及一種毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟:
[0009]配制溶液:L 0.25% Dispase(中性蛋白酶,也稱為分散酶)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取0.25g Dispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽濾分裝，4°C或_20°C保存；
[0010]2.2mg / ml 膠原酶的配制:用 TESCA 緩沖液(50mM TES, 0.36mM CaCl2, ρΗ7.4)在37°C配制，配好后-20°C分裝保存；
[0011]3.DP培養(yǎng)基的配制:a-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清，100X丙酮酸鈉，100Χ非必需氨基酸，1000Χ青鏈霉素，IOng / ml bFGF ；
[0012]培養(yǎng)過程:
[0013]1.取新生8~9d健康C57小鼠I只，頸椎脫臼處死，酒精棉球消毒觸須部位；眼科剪垂直皮膚剪下大鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中；用鑷子夾著皮膚清洗，吸去多余D-Hank’s液；
[0014]2.解剖顯微鏡下用27號(hào)針頭將毛囊連同結(jié)締組織鞘一起分出來，并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有D-Hank’s培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；
[0015]3.分離完畢后，在超凈臺(tái)中用吸管將D-Hank’s液吸干，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的Dispase,20min(10_30min)；
[0016]4.消化完成后，將毛囊轉(zhuǎn)移到大的培養(yǎng)皿中，加入D-Hank’s液將Dispase稀釋(少量多次)，手術(shù)顯微鏡下將毛囊從真皮鞘中分離出來
[0017]5.在手術(shù)顯微鏡下分離毛乳頭，收集移入離心管；
[0018]6.向離心管中加入0.2%`膠原酶，37°C消化5-6小時(shí)；
[0019]7.消化5-6小時(shí)后，離心管中加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打，離心lOOOrpm，3min ；
[0020]8.棄上清，細(xì)胞用DP培養(yǎng)基重懸，于6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)4d后觀察，常規(guī)方法傳代；
[0021]9.細(xì)胞傳至第15代及以上時(shí)，收集細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1:免疫熒光鑒定傳代15代的原代培養(yǎng)的DP細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0023]一、DP細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立
[0024](一)1型膠原的包被
[0025]1.配制0.01mol / L的HCl, PBS,高壓滅菌后備用；
[0026]2.稀釋膠原:用0.01mol / L的HCl將I型膠原稀釋成50 μ g / ml
[0027]3.包被:六孔板每孔加入2ml (終濃度10 μ g / cm2)；
[0028]4.室溫放置Ih
[0029]5.吸掉上清
[0030]6.PBS清洗包被板3次
[0031]7.包被板置于4°C備用(可保存I周)
[0032](二)常用試劑的配制
[0033]1.0.25% Dispase(中性蛋白酶，也稱為分散酶)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取0.25gDispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽濾分裝，4°C或_20°C保存。[0034]2.2mg / ml 膠原酶的配制:用 TESCA 緩沖液(50mM TES，0.36mM CaCl2, ρΗ7.4)在37°C配制，配好后-20°C分裝保存
[0035]3.DP培養(yǎng)基的配制:a-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清，100Χ丙酮酸鈉，100Χ非必需氨基酸，1000Χ青鏈霉素，IOng / ml bFGF。
[0036](三)實(shí)驗(yàn)步驟
[0037]1.取新生8~9d健康C57小鼠I只，頸椎脫臼處死，酒精棉球消毒觸須部位。眼科剪垂直皮膚剪下大鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中。用鑷子夾著皮膚稍做清洗，吸去多余D-Hank’s液；
[0038]2.解剖顯微鏡下(X3.2)用27號(hào)針頭將毛囊連同結(jié)締組織鞘一起分出來，并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有D-Hank’s培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；
[0039]3.分離完畢后，在超凈臺(tái)中用吸管將D-Hank’s液吸干，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的Dispase,20min(10_30min)；
[0040]4.消化完成后，將毛囊轉(zhuǎn)移到大的培養(yǎng)皿中，加入D-Hank’s液將Dispase稀釋(少量多次)，手術(shù)顯微鏡下將毛囊從真皮鞘中分離出來
[0041]5.在手術(shù)顯微鏡下分離毛乳頭，收集移入離心管；
[0042]6.向離心管中加入0.2%膠原酶，37°C消化5-6小時(shí)；
[0043]7.消化5-6小時(shí)后，離心管中加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打，離心lOOOrpm，3min ；
`[0044]8.棄上清，細(xì)胞用DP培養(yǎng)基重懸，于6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)4d后觀察，常規(guī)方法傳代；
[0045]9.細(xì)胞傳至第15代及以上時(shí)，收集細(xì)胞。
[0046]10.傳代至第15代時(shí)，用建立的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的DP細(xì)胞仍表達(dá)DP細(xì)胞特異性標(biāo)記物FGF7和a-SMA進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果顯示(如圖1所示)所建立的DP細(xì)胞培養(yǎng)體系，培養(yǎng)DP細(xì)胞15代后，細(xì)胞仍保持原代細(xì)胞特性，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其仍具有誘導(dǎo)毛囊生長的特性。因此，利用該方法可以獲取足量的DP細(xì)胞，用于科學(xué)研究和臨床治療。所建立的DP細(xì)胞株，具有與原代DP細(xì)胞相同的基因表達(dá)模式。因此，除用于科學(xué)研究和臨床治療外，還可用于大規(guī)模的中試研究。
[0047]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: 配制溶液: 0.25% Dispase (中性蛋白酶,也稱為分散酶)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取0.25g Dispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽濾分裝，4°C或_20°C保存； 2mg / ml 膠原酶的配制:用 TESCA 緩沖液(50mM TES, 0.36mM CaCl2, pH7.4)在 37。。配制，配好后_20°C分裝保存； DP培養(yǎng)基的配制:a-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清，100Χ丙酮酸鈉，100Χ非必需氨基酸，1000Χ青鏈霉素，IOng / ml bFGF ； 培養(yǎng)過程: 1)取新生8~9d健康C57小鼠I只，頸椎脫臼處死，酒精棉球消毒觸須部位；眼科剪垂直皮膚剪下大鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank’ s液的培養(yǎng)皿中；用鑷子夾著皮膚清洗，吸去多余D-Hank’s液； 2)解剖顯微鏡下(X3.2)用27號(hào)針頭將毛囊連同結(jié)締組織鞘一起分出來，并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有D-Hank’s培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中； 3)分離完畢后，在超凈臺(tái)中用吸管將D-Hank’s液吸干，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25 %的Dispase,室溫消化 10_30min,優(yōu)選 20min ； 4)消化完成后，將毛囊轉(zhuǎn)移到大的培養(yǎng)皿中，加入D-Hank’s液將Dispase稀釋，手術(shù)顯微鏡下將毛囊從真皮鞘中分離出來； 5)在手術(shù)顯微鏡下分離毛乳頭，收集移入離心管； 6)向離心管中加入0.2%膠原酶，37°C消化5-6小時(shí)； 7)消化5-6小時(shí)后，離心管中加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打，離心lOOOrpm，3min； 8)棄上清，細(xì)胞用DP培養(yǎng)基重懸，于6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)4d后觀察，常規(guī)方法傳代； 9)細(xì)胞傳至第15代及以上時(shí)，收集細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法所構(gòu)建的毛乳頭細(xì)胞系。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103497930SQ201310451331
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】李玉紅 申請(qǐng)人:李玉紅