一種基因芯片的金沉積檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基因芯片的金沉積檢測方法，其特征在于所述方法包括將已知的DNA序列點樣到微陣列上制備基因芯片，在待測核酸的5’端預(yù)先修飾一種生物大分子，以及在納米金上標(biāo)記與待測核酸上修飾分子匹配的另一生物大分子構(gòu)建納米金復(fù)合探針，然后將修飾好的待測核酸和標(biāo)記好的所述納米金復(fù)合探針與所述基因芯片混合，孵育，洗去未反應(yīng)的所述納米金復(fù)合探針，加入雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液觀察。本發(fā)明提供的基因芯片的金沉積檢測方法最大的特點及優(yōu)點為：靈敏度高，檢測方便，操作簡便，耗時短，成本低，目視化檢測，檢測及信號讀取設(shè)備依賴程度低。
【專利說明】一種基因芯片的金沉積檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物芯片檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及一種基因芯片的金沉積檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微陣列是利用微電子芯片技術(shù)的集約化和平行處理原理，將大量具有生物學(xué)意義的生物樣品有序地固化在硅襯底或玻璃上構(gòu)成，利用微陣列可以快速地獲取或處理大量的生命信息?；谖㈥嚵械男盘枠?biāo)記通常采用熒光標(biāo)記檢測法，而熒光試劑價格昂貴、生物分子自身熒光干擾、熒光衰減以及讀取所用儀器價格昂貴等缺點，也大大限制了其在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的應(yīng)用。ZL01113298.1提供了一種簡單快速、低成本的基因芯片檢測技術(shù)，該技術(shù)采用裸眼或者普通的光學(xué)掃描儀分析記錄實驗結(jié)果，擺脫了基因芯片技術(shù)對昂貴的熒光檢測設(shè)備的依賴，為基因芯片的推廣應(yīng)用起到了巨大的推動作用。但是由于膜轉(zhuǎn)印步驟的特殊需要，難以實現(xiàn)芯片上多樣品檢測，因此開發(fā)更為直觀便捷的目視化檢測技術(shù)仍然具有重大意義，仍然是本領(lǐng)域技術(shù)人員所想往的方法。
[0003]隨著納米科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，納米材料和納米結(jié)構(gòu)取得了引人矚目的成就。納米材料具有傳統(tǒng)材料所不具備的特有的三大效應(yīng):表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)。作為標(biāo)記材料而廣泛應(yīng)用于免疫檢測中的納米金顆粒對生物分子有很強(qiáng)的吸附功能，可以與蛋白質(zhì)、核酸等非共價結(jié)合，因而在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。納米金顆粒具有高電子密度的特性，在納米金顆粒結(jié)合處，在顯微鏡下可見褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而廣泛應(yīng)用于定性或半定量的快速檢測方法中，`但是這類檢測技術(shù)的最大缺點是靈敏度低，檢測蛋白的靈敏度為ng/ml，對微量生物分子檢測無能為力(免疫標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)展及納米技術(shù)在其中的應(yīng)用，賈春平等，生命科學(xué)，第20卷，第5期，第749-753頁)。此外，這類檢測方法大部分適用于試紙條或膜為固相載體的檢測體系中，對于以玻璃等為固相載體的微陣列上的微米甚至納米級的檢測點來說，不經(jīng)過進(jìn)一步的信號放大，一般顯微鏡尤其肉眼根本是檢測不到的，通常需要經(jīng)過銀染放大后才肉眼可見(CN02113147 —種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測法)。但是，由于銀染試劑毒性大，且光敏感性強(qiáng)，難以保存，限制了試劑盒開發(fā)及其在廣大基層單位、醫(yī)院等單位的發(fā)展。本發(fā)明就是在基于以上的需求提出的。
[0004]本申請的發(fā)明人多年來從事生物芯片技術(shù)的研究，并開發(fā)了一系列基于納米金生物探針的生物芯片檢測技術(shù)(201010156014.4，納米復(fù)合探針及其用于基因芯片膜轉(zhuǎn)印的檢測方法；201110211260.X，一種基于納米金增強(qiáng)的多種肺癌標(biāo)志物的高靈敏檢測方法)。本發(fā)明是在原有技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)，發(fā)明了一種新型的基于金沉積技術(shù)的基因芯片檢測方法。
[0005]本發(fā)明是在原有技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)沉積檢測系統(tǒng)，開發(fā)了一種新型的基于金沉積技術(shù)的基因芯片檢測方法，該方法利用雙氧水的氧化還原作用，將系統(tǒng)中的金離子還原成金原子，并以納米金為核，在納米金表面沉積，使特異性結(jié)合在芯片表面的納米金信號得到級聯(lián)放大。該方法與原有方法比，試劑穩(wěn)定性更高，檢測速度更快，檢測背景更低，檢測靈敏度及特異性更高，檢測成本更低，具有明顯的先進(jìn)性及創(chuàng)新性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種基因芯片的金沉積檢測方法，無需特殊儀器設(shè)備即可完成可目視化生物芯片檢測，該方法基于納米金生物復(fù)合探針、微陣列及納米金增強(qiáng)原理，可對蛋白，核酸(DNA、RNA、miRNA等)等生物大分子進(jìn)行快速檢測。
[0007]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]提供一種基因芯片的金沉積檢測方法，所述方法包括:將已知的DNA序列點樣到微陣列上制備基因芯片，在待測核酸的5’端預(yù)先修飾一種生物大分子，以及在納米金上標(biāo)記與待測核酸上修飾分子匹配的另一生物大分子構(gòu)建納米金復(fù)合探針，然后將修飾好的待測核酸和標(biāo)記好的所述納米金復(fù)合探針與所述基因芯片混合，孵育，洗去未反應(yīng)的所述納米金復(fù)合探針，加入雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液觀察。
[0009]所述雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液的組成為:次氯金酸HAuCl.3H201-lOOmM、雙氧水
0.5-4M，明膠I-10% (質(zhì)量)。
[0010]優(yōu)選為:次氯金酸HAuCl.3H2010mM、雙氧水1.5M，明膠4% (質(zhì)量)。
[0011]在待測核酸的5’端上預(yù)先修飾的生物大分子包括:核酸序列、生物素、地高辛或熒光素中的一種。
[0012]在納米金上標(biāo)記的與待 測核酸上修飾分子匹配的另一生物大分子包括:核酸序列、鏈親合素、抗地高辛抗體或抗熒光素抗體中的一種。
[0013]納米金上標(biāo)記核酸序列時，所述核酸序列為兩種長度的DNA探針GPl和GP2，且GPl的堿基長度比GP2長10個堿基以上。
[0014]當(dāng)納米金的尺寸為5-40nm時，GPl與GP2的比例在1: 4-1: 30之間。
[0015]優(yōu)選地，具體的檢測步驟為:1)采用芯片點樣儀將5’端氨基修飾的DNA探針點陣于醛基化修飾芯片表面制備基因芯片，置于密閉空間固定，所述DNA探針序列為:分枝桿菌通用探針:5’ -NH2-ggactgagatacggcc_3’ ；結(jié)核分枝桿菌探針:5’ -NH2-cacgggatgcatgtct_3’ ；龜分枝桿菌探針:5’ -NH2-ccacacacttcatggtga_3’ ；胞內(nèi)分枝桿菌探針:5’ -NH2-gaCCtttaggCgCatg-3’ ；2) PCR擴(kuò)增獲得標(biāo)記有生物素的DNA分子，其中，引物的序列為:16sl:5’ -Biotin-gataagc (c/t) tgggaaactg-3’； 16s2:5’ -Biotin-tgcctcccgtaggagtctgg-3’ ;3)通過1(20)3將納米金溶液調(diào)pH值至pH6,加入鏈親和素溶液,混勻，再加入聚乙二醇溶液，離心，洗去未標(biāo)記上的鏈親和素，制得標(biāo)記有鏈親合素的納米金復(fù)合探針；4)取所述步驟2)中制備的經(jīng)過標(biāo)記的DNA分子，滴于所述步驟I)中制備的基因芯片的點樣區(qū)，雜交，洗去未雜交的DNA分子，然后將所述步驟3)中制備的標(biāo)記好的納米金復(fù)合探針滴于芯片點樣區(qū)，反應(yīng)30-60min,洗液清洗去除未反應(yīng)的納米金復(fù)合探針；5)將雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液滴在點陣區(qū)，室溫靜置，肉眼或顯微鏡下觀察。
[0016]所述步驟2)中還包括采用納米金重懸液重懸標(biāo)記好的核酸納米金生物復(fù)合探針，所述納米金重懸液的組成為:牛血清白蛋白0.25-10% (質(zhì)量)、聚乙烯吡咯酮0.1-1%(質(zhì)量)、蔗糖1.5-10% (質(zhì)量)、聚乙二醇0.01-1% (質(zhì)量)、吐溫0.2-1% (質(zhì)量)。
[0017]本發(fā)明的基因芯片的金沉積檢測法是基于固相分子雜交的反應(yīng)原理，即將已知DNA序列固定在玻璃基片上，相繼加入待測核酸或待測核酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(待測核酸的5’端事先修飾特定核酸序列或生物素、地高辛、熒光素等分子)和經(jīng)過納米金標(biāo)記的與待測核酸上修飾分子匹配的另一生物大分子(核酸、鏈親和素、抗地高辛抗體、抗熒光素抗體等)，從而形成最后的雜交復(fù)合物，形成的結(jié)構(gòu)可以表示為(以生物素修飾為例):基片-DNA-待測序列-生物素-鏈親和素-納米金，如圖1和圖2所示。
[0018]納米金金沉積作用是利用了金離子可以在還原劑作用下還原成金原子，并以納米金為核，在納米金表面沉積的原理，使特異性結(jié)合在芯片表面的納米金信號得到放大的過程。
[0019]金離子可以在還原劑作用下還原成金原子，基于這個原理的應(yīng)用，多數(shù)是用于納米金的制作、在一些納米粒子表面形成金殼結(jié)構(gòu)或在一些器件表面形成金金屬層從而進(jìn)行表面改性、SERS (表面增強(qiáng)拉曼光譜Surface enhanced raman spectroscopy)等技術(shù)基片的基底層制作等等，而作為一種信號檢測方法，尤其是用于基因和蛋白芯片的目視化檢測方面的報道未見，以前都是用銀染的方法(原理是在納米金表面沉積金屬銀)，然而銀染的方法弊端很多，相比較來說，信號弱，背景大，試劑穩(wěn)定性差，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，因此結(jié)果重復(fù)性差等。
[0020]金離子的還原劑有很多，強(qiáng)還原劑一般包括硼氫化物、水合肼、氫氣、四丁基硼氫化物等，這類還原劑具有很強(qiáng)的還原能力，反應(yīng)速率很快；弱還原劑包括檸檬酸鈉、酒石酸鉀、胺類化合物、葡萄糖、抗壞血酸、次亞磷酸鈉和亞磷酸鈉、醇類化合物、醛類化合物、雙氧水、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。強(qiáng)還原劑反應(yīng)速度快，到達(dá)反應(yīng)終點速度快，信號放大能力反而不強(qiáng)，而且背景大，條件控制比較難；弱還原劑反應(yīng)速度慢，條件可控，但是太慢信號相應(yīng)也太弱，反應(yīng)時間長也容易產(chǎn)生非特異性的信號。 申請人:對多種還原劑進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)雙氧水、羥胺、檸檬酸鈉的效果都比較好。其中效果最好的是雙氧水。
[0021]本發(fā)明提供的基因芯片的金沉積檢測方法最大的特點及優(yōu)點為:靈敏度高，檢測方便，操作簡便，耗時短，成本低，目視化檢測，檢測及信號讀取設(shè)備依賴程度低。
`[0022](I)背景信號低，檢測靈敏度高
[0023]本發(fā)明提供的測試方法主要是基于納米金生物復(fù)合探針及納米金增強(qiáng)技術(shù)的信號檢測技術(shù)，只有當(dāng)待測分子存在時，納米金探針才會結(jié)合在芯片上，納米金與芯片的非特異性結(jié)合明顯低于化學(xué)分子(熒光信號分子、蛋白及其他生物分子)；金沉積作用是以納米金為核進(jìn)行的，因此只有納米金存在的地方，才會發(fā)生進(jìn)一步的信號級聯(lián)放大作用，沒有納米金的地方則不會有信號，背景信號很低，提高了信噪比，從而提高了檢測靈敏度。
[0024]( 2 )試劑穩(wěn)定,成本低
[0025]本發(fā)明利用納米金沉積作用進(jìn)行顯色檢測，可以用價格相對低廉的化學(xué)試劑替換掉常規(guī)顯色方法中的酶聯(lián)免疫試劑，包括酶和響應(yīng)的底物，而且這些試劑的儲存條件與酶相比要求較低，試劑的穩(wěn)定性更強(qiáng)，提高了試劑盒的穩(wěn)定性及使用時效。
[0026](3)操作簡便，耗時短
[0027]本發(fā)明提供的測定方法從檢測標(biāo)本開始，只需要1-1.5h的時間，就可以得到檢測結(jié)果；另外，本技術(shù)操作步驟少，操作方便、簡單，適于臨床大批量標(biāo)本的快速檢測。
[0028](4)目視化的檢測，信號讀取對大型儀器設(shè)備的依賴程度低
[0029]本發(fā)明提供的檢測方法，信號強(qiáng)，背景低，信號肉眼可見，因此可肉眼分析結(jié)果進(jìn)行定性檢測，也可采用普通光學(xué)掃描儀、普通光學(xué)顯微鏡接普通CXD (電荷耦合元件，harge-coupled Device)圖像傳感器、電腦讀取、儲存并通過軟件分析試驗結(jié)果的灰度值，進(jìn)行半定量的檢測，使檢測方法易于推廣。
[0030]本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)的創(chuàng)造性主要在于:通過金沉積技術(shù)實現(xiàn)了對基因芯片進(jìn)行可目視化檢測，克服了現(xiàn)有的熒光標(biāo)記檢測法，銀染檢測法以及膜轉(zhuǎn)印技術(shù)的各種缺陷，提供了一種靈敏度高，操作簡便，耗時短，成本低的基因芯片的金沉積檢測方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是基于核酸互補(bǔ)配對反應(yīng)的納米金增強(qiáng)基因芯片檢測法的流程示意圖，A為納米復(fù)合探針構(gòu)建，B為芯片檢測流程；
[0032]圖2是基于蛋白免疫反應(yīng)的納米金增強(qiáng)基因芯片檢測法的流程示意圖，A為納米復(fù)合探針構(gòu)建，B為基于地高辛-抗地高辛抗體檢測系統(tǒng)的芯片檢測流程，C為基于生物素-鏈親和素檢測系統(tǒng)的芯片檢測流程；
[0033]圖3是基于雙氧水還原的金沉積基因芯片檢測法檢測結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果，A為雙氧水法納米金沉積染色6min, B為輕胺法納米金沉積染色I(xiàn)Omin, C為銀染lOmin。
【具體實施方式】
[0034]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0035]實施例1:基于雙氧水還原與基于羥胺還原以及銀染法的基因芯片的金沉積檢測法檢測結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果比較
[0036]1.芯片制備`
[0037]采用芯片點樣儀將氨基修飾探針(探針序列見表I)點陣于醛基化修飾芯片表面，點陣好的芯片置于相對濕度為75%、溫度為30°C的密閉空間固定24-48小時。
[0038]表I核酸探針序列表
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種基因芯片的金沉積檢測方法，其特征在于所述方法包括將已知的DNA序列點樣到微陣列上制備基因芯片，在待測核酸的5’端預(yù)先修飾一種生物大分子，以及在納米金上標(biāo)記與待測核酸上修飾分子匹配的另一生物大分子構(gòu)建納米金復(fù)合探針，然后將修飾好的待測核酸和標(biāo)記好的所述納米金復(fù)合探針與所述基因芯片混合，孵育，洗去未反應(yīng)的所述納米金復(fù)合探針，加入雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金沉積檢測方法，其特征在于，所述雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液的組成為:次氯金酸HAuCl.3Η201~lOOmM、雙氧水0.5~4M，明膠的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為I~10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金沉積檢測方法，其特征在于，所述雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液的組成為:次氯金酸HAuCl.3H2010mM、雙氧水1.5M，明膠的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金沉積檢測方法，其特征在于，在待測核酸的5’端上預(yù)先修飾的生物大分子包括:核酸序列、生物素、地高辛或熒光素中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金沉積檢測方法，其特征在于，在納米金上標(biāo)記的與待測核酸上修飾分子匹配的另一生物大分子包括:核酸序列、鏈親合素、抗地高辛抗體或抗熒光素抗體中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的金沉積檢測方法，其特征在于，納米金上標(biāo)記核酸序列時，所述核酸序列為兩種長度的DNA探針GPl和GP2，且GPl的堿基長度比GP2長10個堿基以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的金沉積檢測方法，其特征在于，當(dāng)納米金的尺寸為5~40nm時，GPl與GP2的比例在1: 4~1: 30之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金沉積檢測方法，其特征在于，具體的檢測步驟為: I)采用芯片點樣儀將5’端氨基修飾的DNA探針點陣于醛基化修飾芯片表面制備基因芯片，置于密閉空間固定，所述DNA探針序列為: 分枝桿菌通用探針:5’ -NH2-ggactgagatacggcc_3’ ； 結(jié)核分枝桿菌探針:5’ -NH2-cacgggatgcatgtct_3’ ； 龜分枝桿菌探針:5’ -NH2_ccacacacttcatggtga_3’ ； 胞內(nèi)分枝桿菌探針:5’ -NH2-gacctttaggcgcatg_3’ ； 2 ) PCR擴(kuò)增獲得標(biāo)記有生物素的DNA分子，其中，引物的序列為:
16sl:5’ -Biotin-gataagc (c/t)tgggaaactg-3’ ；
16s2:5’ -Biotin-tgcctcccgtaggagtctgg-3> ； 3)通過K2CO3將納米金溶液調(diào)pH值至6，加入鏈親和素溶液，混勻，再加入聚乙二醇溶液，離心，洗去未標(biāo)記上的鏈親和素，制得標(biāo)記有鏈親合素的納米金復(fù)合探針； 4)取所述步驟2)中制備的經(jīng)過標(biāo)記的DNA分子，滴于所述步驟I)中制備的基因芯片的點樣區(qū)，雜交，洗去未雜交的DNA分子，然后將所述步驟3)中制備的標(biāo)記好的納米金復(fù)合探針滴于芯片點樣區(qū)，反應(yīng)30~60min,洗液清洗去除未反應(yīng)的納米金復(fù)合探針； 5)將雙氧水金增強(qiáng)反應(yīng)液滴在點陣區(qū)，室溫靜置，肉眼或顯微鏡下觀察。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的金沉積檢測方法，其特征在于，所述步驟2)中還包括采用納米金重懸液重懸標(biāo)記好的核酸納米金生物復(fù)合探針，所述納米金重懸液的組成為:牛血清白蛋白0.25~10%、聚乙烯吡咯酮0.1~1%、蔗糖1.5~10%、聚乙二醇0.01~1%、吐溫.0.2~1%，以上組成均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451313SQ201310451535
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】景奉香, 賈春平, 張冀申, 王文濤, 金慶輝, 趙建龍 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所