一種發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法
【專利摘要】一種發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，包括以下步驟：（1）糙米渾濁液制備；（2）中性蛋白酶水解；（3）滅酶；（4）離心分離；（5）真空濃縮；（6）冷凍干燥。本發(fā)明之發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，產率高，成本低，產品性能穩(wěn)定，且在生產規(guī)模從實驗室擴大至中試和工業(yè)化的過程中，其相關技術參數不需再次優(yōu)化，為大規(guī)模工業(yè)生產提供了有利條件。
【專利說明】一種發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，尤其涉及一種采用高速剪切和酶輔助偶聯技術提取發(fā)芽糙米抗氧化肽的方法。
【背景技術】
[0002]隨著近年來生物活性肽研究的進展，人們發(fā)現，從天然動植物蛋白質提取分離的多肽，具有抗氧化特性強、活性穩(wěn)定、無毒副作用及來源方便等優(yōu)點，被廣泛應用于醫(yī)藥和食品領域。
[0003]稻米作為我國的主食，其含有的營養(yǎng)成分和生物活性物質種類和數量直接影響全民的身體素質。大米蛋白質具有高生物效價、低過敏性等重要特點，而大米蛋白經酶作用制備的多肽已經被證明具有較強的抗氧化活性(張君慧.大米蛋白抗氧化肽的制備、分離純化和結構鑒定[D].無錫:江南大學，2009)。
[0004]發(fā)芽糙米是將糙米經發(fā)芽至一定的芽長，所得到的一種由幼芽和帶糠層的胚乳組成的糙米制品，與普通大米相比，其營養(yǎng)素更豐富，所含大米蛋白抗氧化肽也更豐富(何新益等.糙米發(fā)芽前后抗氧化活性比較研究[J].中國糧油學報，2009，24 (11):6-8.)。
[0005]目前，大米抗氧化肽的制備方法，主要有酶法制備(張君慧等.大米蛋白酶解制備抗氧化肽的研究[J]，食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34 (5):71-75)與超聲波預處理結合酶法制備(賈俊強等.超聲預處理大米蛋白制備抗氧化肽[J]，農業(yè)工程學報，2008，24(8):288-293)兩種。這些方法，制備時間長，效率低，DPPH清除能力損失率高。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是，提供一種制備效率高，產品純度高及抗氧化活性高，制造成本低，適于工業(yè)化生產的從發(fā)芽糙米提取抗氧化肽的方法。
[0007]本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案是，一種發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，包括以下步驟:
(1)糙米渾濁液制備:取新制備的發(fā)芽糙米，在常溫下，加入PH值8.(TpHll (優(yōu)選PH9.5)的堿液，發(fā)芽糙米的質量與浸泡堿液體積之比為Ig: 4~7 mL (優(yōu)選Ig: 5 mL),浸泡2~5h (優(yōu)選4 h)，然后采用高速組織搗碎機在剪切速度500(Tl0000rpm (優(yōu)選8000r/min)條件下剪切5~15 min (優(yōu)選8min),獲得糙米渾池液；
(2)中性蛋白酶水解:采用0.8~1.2mol/L (優(yōu)選1.0moI/L)的酸液將步驟(I)所得糙米渾濁液的pH調至7.0，添加糙米渾濁液質量的4.5^10 %(優(yōu)選5.0%)的中性蛋白酶，攪拌，在溫度30~40 V (優(yōu)選35°C)的條件下酶解反應80~120 min (優(yōu)選lOOmin)，每隔4~8min (優(yōu)選5min)采用0.05-0.15 mol/L (優(yōu)選0.lmol/L)的NaOH溶液將酶解液的pH控制在6.5~7.5 (優(yōu)選7.0)之間;所述中性蛋白酶的酶活優(yōu)選IX 106U/g ；
(3)滅酶:步驟(2)所述酶解反應結束后，將酶解液溫度升至7(T98°C，高溫滅酶5~20min,然后冷卻至常溫，采用0.05-0.15 mol/L NaOH溶液將酶解液pH值調至8.(Tl0.0 ；(4)離心分離:將步驟(3)獲得的酶解液在200(T4000rpm離心1(T20 min，獲上清液；
(5)真空濃縮:將步驟(4)獲得的上清液經半透膜脫鹽，在0.01-0.06MPa，40-60°C進行真空濃縮，濃縮至原液體積的5~15% ；
(6)冷凍干燥:將步驟(5)所得的濃縮液冷凍干燥至粉末狀，預凍速率為f5°C/min，干燥室真空度為50~500 Pa，在-30~-10°C時預凍10~30 min干燥至水分含量為5~10%，即為發(fā)芽糙米多肽產品成品。
[0008]進一步，所述步驟(I)中的堿液為碳酸鹽緩沖溶液。
[0009]進一步，所述碳酸鹽為碳酸鈉或者碳酸氫鈉。
[0010]進一步，步驟(2)中，所述酸液為檸檬酸溶液或者鹽酸溶液。
[0011]以上所述步驟(3)滅酶、(4)離心分離、(5)真空濃縮、(6)冷凍干燥均有現有技術可資借鑒，本說明書所述工藝條件只是優(yōu)選條件。
[0012]發(fā)芽糙米多肽抗氧化活性評價方法:
①總還原能力的測定:發(fā)芽糙米多肽總還原能力參考MerZametov和GadzhieVa的方法(Merzametov MM, Gadzhieva L1.Certain amino acids as antioxidants in butterfat.1zv, Ucheb.zavcd pischew.Technol, 1976，115:21-27),即取一定濃度發(fā)芽糖米多肽溶液lmL，加入0.2 M的磷酸鹽緩沖液(pH6.6) 2.5mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL,充分混合后，在50 1:下，保溫20 min后加入10%的三氯乙酸，經充分混合，3000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.1% FeC13 0.5mL，然后在700 nm處測定吸光值。
[0013]②輕自由基的清除能力測定:通過Fenton反應測發(fā)芽糙米肽清除.0H的能力。取ImL 5mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液于試管中依次加入2mL pH7.40的0.2mol/L磷酸緩沖溶液和ImL樣品溶劑充分混勻后，加入ImL 5mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻后加入ImL雙氧水，于37°C水浴60min后，在波長536nm處測其吸光度得到A.未損傷管以ImL蒸餾水代替損傷管中ImL 0.1%的雙氧水，樣品管以ImL樣品溶液代替損傷管中的I mL樣品溶劑，其他同損傷管，測得未損傷管的吸光度及樣品管的吸光度(A #)，按以下公式計算.0 H清除率。
[0014].0 H 清除率(％)=100X 樣損)/ 未損)
③總抗氧化能力檢測:發(fā)芽糙米多肽總抗氧化能力檢測采用總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)，即取一定濃度發(fā)芽糙米多肽溶液40 μ L，添加4ml的ABTS測定液，充分震蕩30s，然后在用30攝氏度水浴60min，最后在734nm波長處測定其吸光度值。ABTS清除率的計算公式:清除率=(l-Aff/0.700) X 100。
[0015]本發(fā)明采用高速剪切和酶輔助偶聯相結合的技術提取發(fā)芽糙米抗氧化肽，與現有技術中的酶處理方法相比，具有以下優(yōu)勢:第一，發(fā)芽糙米經高速剪切作用細胞破壁，使得更多的大米蛋白進入到溶液中，提高了蛋白酶與底物(蛋白質)的接觸機會；第二，發(fā)芽糙米的蛋白質在高速剪切作用下，會部分變性，能夠被蛋白酶酶解的酰胺鍵曝露，促進了多肽的生成。
[0016]本方法采用高速剪切和酶輔助偶聯技術從發(fā)芽糙米中提取抗氧化肽，與從普通的精米和糙米中提取抗氧化肽，不僅抗氧化肽得率高(高達10%以上)，所得抗氧化肽的抗氧化活性也更高。[0017]本發(fā)明之發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，產率高，成本低，產品性能穩(wěn)定，且支持工業(yè)化應用，在生產規(guī)模從實驗室擴大至中試和工業(yè)化的過程中，其相關技術參數不需再次優(yōu)化。為大規(guī)模工業(yè)生產提供了有利條件。
【具體實施方式】
[0018]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0019]實施例:
(1)取新制備的發(fā)芽糙米100g，于室溫下，在500mL 0.5 mol/L碳酸鈉緩沖溶液(pH9.5)中，浸泡4 h，然后采用DS-高速組織搗碎機在剪切速度8000 r/min條件下剪切8min,獲發(fā)芽糙米渾池液；
(2)采用1.0 mol/L鹽酸溶液將糙米渾濁液的pH值調至7.0，添加糙米渾濁液質量的5.0 %的中性蛋白酶(酶活lX106U/g)，磁力攪拌，在溫度35°C的條件下酶解反應lOOmin，每隔5min采用0.lmol/L的NaOH標準溶液將酶解液的pH控制在6.9~7.1之間；
(3)待酶解反應結束后，將酶解液溫度升至85°C，高溫滅酶10min，冷卻至常溫，用0.1mol/L的NaOH標準溶液將酶解液pH調至9.5 ；
(4)將獲得的酶解液在4500r/min離心15 min，獲上清液；
(5)經半透膜脫鹽，真空濃縮將獲得的上清液經半透膜脫鹽，真空度為0.03 MPa，溫度45°C條件下進行真空濃縮，濃縮至原液體積的10% ；
(6)將步驟(5)所得的濃縮液冷凍干燥至粉末狀，預凍速率為2°C/min，干燥室真空度為100 Pa，在-25°C時預凍20 min干燥至水分含量為8 %，得發(fā)芽糙米多肽2.371g。
[0020]發(fā)芽糙米多肽抗氧化活性評價
1、發(fā)芽糙米中不同濃度多肽的總還原力
發(fā)芽糙米多肽總還原能力參考MerZametov和GadzhieVa的方法,不同濃度的發(fā)芽糙米多肽具有不同的總還原力，700 nm處測定吸光值測定，結果如下下表1所示:
表1 700 mn處測定吸光値涵定數裾
【權利要求】
1.一種發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)糙米渾濁液制備:取新制備的發(fā)芽糙米，在常溫下，加入PH值為8.(TpHll的堿液，所述發(fā)芽糙米的質量與堿液體積之比為Ig: 4~7mL，浸泡2~4h，然后采用高速組織搗碎機在剪切速度500(Tl0000 rpm條件下剪切5~15 min，獲得糙米渾濁液； (2)中性蛋白酶水解:采用0.8~1.2mol/L的酸液將步驟(I)所得糙米渾濁液的pH值調至7.0，添加相當于糙米渾濁液質量4.5^10 %的中性蛋白酶，攪拌，在溫度3(T40°C的條件下酶解反應80~120 min,每隔4~8min采用0.05-0.15 mo I/L的NaOH溶液將酶解液的pH控制在6.5~7.5之間；所述中性蛋白酶的酶活為lX106U/g; (3 )滅酶:步驟(2 )所述酶解反應結束后，將所得酶解液的溫度升至70-98 V，滅酶5~20min，然后冷卻至常溫，采用0.05-0.15 mo I/L NaOH溶液將酶解液pH值調至8.(Tl0.0 ； (4)離心分離:將步驟(3)獲得的酶解液在200(T4000rpm離心1(T20 min，獲上清液； (5)真空濃縮:將步驟(4)獲得的上清液經半透膜脫鹽，在0.01-0.06MPa，40-60°C進行真空濃縮，濃縮至原液體積的5~15% ； (6)冷凍干燥:將步驟(5)所得的濃縮液冷凍干燥至粉末狀，預凍速率為f5°C/min，干燥室真空度為50~500 Pa，在-3(T-10°C時預凍10~30 min，干燥至水分含量為5~10%，即成。
2.根據權利要求1所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟(I)中，所述堿液為碳酸鹽緩沖溶液。
3.根據權利要求2所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，所述碳酸鹽緩沖溶液為碳酸鈉緩沖溶液或者碳酸氫鈉緩沖液。
4. 根據權利要求1~3之一所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟(2)中，所述酸液為檸檬酸溶液或者鹽酸溶液。
5.根據權利要求1~3之一所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟Cl)中，所述pH值為9.5。
6.根據權利要求1~3之一所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟(1)中，所述發(fā)芽糙米的質量與浸泡堿液體積之比為Ig: 5mL。
7.根據權利要求1~3之一所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟Cl)中，所述浸泡的時間為4h，剪切速度為8000r/min，剪切的時間為8min。
8.根據權利要求1~3之一所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟(2)中，所述酸液的濃度為l.0mol/L。
9.根據權利要求1~3之一所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟(2)中，所述中性蛋白酶的加入量相當于糙米渾濁液質量的5.0%。
10.根據權利要求9所述的發(fā)芽糙米抗氧化肽的提取方法，其特征在于，步驟(2)中，酶解反應溫度為35°C，酶解反應時間為100 min，每隔5min采用0.lmol/L的NaOH溶液，將酶解液的pH控制在7.0。
【文檔編號】C12P21/06GK103468777SQ201310451624
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權日:2013年9月29日
【發(fā)明者】楊濤, 孫術國, 林親錄, 汪龍, 李艷, 梁安怡 申請人:中南林業(yè)科技大學