一種源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸及其制備方法
【專利摘要】一種源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸及其制備方法，涉及一種具有高效抑藻活性的脂類化合物。所述高效抑藻活性化合物的菌株為弧菌（Vibrio?sp.）BS02，保藏編號為CCTCCNO：M2010217。所述源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸的分子式為C16H30O2，分子量大小為254。將菌株BS02發(fā)酵培養(yǎng)，得含有強抑藻活性化合物的發(fā)酵液，離心后，收集上清液，再分離純化，即得具有強抑藻活性的化合物源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸。所述源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸能夠高效、專一地殺滅藻細胞，具有開發(fā)成抑藻劑的潛能，在生物降解藻類、治理赤潮方面具有廣泛的應(yīng)用。
【專利說明】一種源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有高效抑藻活性的脂類化合物，尤其是涉及一種源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展，以及逐年增多的填海造地，不規(guī)范的近海海域開發(fā)利用，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)水體生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，水體生態(tài)系統(tǒng)紊亂，氮磷污染消納能力下降，自凈功能逐步喪失，導(dǎo)致我國近海營養(yǎng)鹽負荷較重的海區(qū)富營養(yǎng)化程度居高不下，赤潮時有發(fā)生。素有“水體癌癥”之稱的有害藻華不僅導(dǎo)致沿海地區(qū)出現(xiàn)了嚴重的生態(tài)、資源、環(huán)境問題，同時也使沿海城鎮(zhèn)的經(jīng)濟蒙受巨額損失。僅2012年以來，福建沿海就發(fā)生了八起赤潮，其中5月份平潭流水、蘇澳碼頭附近海域和龍風(fēng)頭海濱浴場海域所引發(fā)的赤潮導(dǎo)致逾5000萬只鮑魚死亡，直接經(jīng)濟損失達2億元人民幣。故此，有害赤潮作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的致命殺手，已經(jīng)引起政府和地區(qū)的密切關(guān)注，如何研制新型、高效的赤潮調(diào)控方法并制定有關(guān)赤潮防治對策已成為各級政府和科研工作者的當(dāng)務(wù)之急！
[0003]塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)是一種能產(chǎn)生麻痹性貝毒素(PSP)的海洋甲藻，是當(dāng)前有害赤潮主要原因藻種之一，其所產(chǎn)生的PSP毒素不僅對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利的影響，同時也對人類的健康及海洋經(jīng)濟的發(fā)展造成了巨大的威脅。鑒于塔瑪亞歷山大藻的各種危害，對其防治顯得越來越重要。當(dāng)前藻類控制技術(shù)可歸結(jié)為:物理方法、化學(xué)方法及生物防治，其中溶藻微生物防治技術(shù)因具有成本低、安全性好的潛能，引起了越來越多研究人員的關(guān)注。溶藻細菌(Algicidal bacteria)是一類以直接或間接方式抑制藻類生長，或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統(tǒng)稱，具有較好的生態(tài)安全性，尤其適合在赤潮發(fā)生初期使用，在短期內(nèi)即可 達到控制藻類生物量，阻止藻類大量增殖的效果，勢必成為赤潮生物防治的一個重要手段。目前，國內(nèi)外已有不少對溶藻細菌的報道。
[0004]至今為止，大多數(shù)篩選到的殺藻細菌是通過分泌特異的具有殺藻活性的物質(zhì)來起殺藻作用的。已經(jīng)報道的殺藻活性物質(zhì)包括:蛋白質(zhì)(含胞外酶)、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的殺藻化合物(Paul C.,Pohnert G.1nteractionsof the Algicidal Bacterium Kordia algicida with Diatoms:Regulated ProteaseExcretion for Specific Algal Lysis[J].PLoS One，2011，6(6):e21032 ;Chen W.M., SheuF.S.，Sheu S.Y.Novel L—amino acid oxidase with algicidal activity against toxiccyanobacterium Microcystis aeruginosa synthesized by a bacterium Aquimarinasp [J].Enzyme Microb Technol，2011，49 (4): 372-379 ;0h J.1.，Kim M.J.，Lee J.Y.，Ko
1.J.，Kim W.，Kim S.W.1solation and characterization of algicidal bacteriafrom Cochlodinium polykrikoides culture[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2011，16 (6): 1124-1133 ；Lee S.0.，Kato J.，Takiguchi N.，Kuroda A.，IkedaT., Mitsutani A., Ohtake H.1nvolvement of an extracellular protease in algicidalactivity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp.strain A28[J].ApplEnviron Microbiol, 2000, 66(10):4334-4339)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一目的是提供一種生產(chǎn)所述高效抑藻活性化合物的菌株及其篩選方法。
[0006]本發(fā)明的第二目的是提供一種源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸及其制備方法。
[0007]本發(fā)明的第三目的是提供一種源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸在制備抑藻劑中的應(yīng)用。
[0008]所述高效抑藻活性化合物的菌株 為弧菌(Vibrio sp.)BS02，該菌已于2010年9月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2010217，保藏中心地址為:中國武漢武漢大學(xué)，郵編430072。
[0009]所述弧菌(Vibrio sp.) BS02的篩選方法包括以下步驟:
[0010]I)取福建漳江口紅樹林國家自然保護區(qū)土壤樣品，無菌水經(jīng)過一系列10倍稀釋后，每個稀釋液取0.1mL涂布在高氏一號培養(yǎng)基平板上,在25°C下培養(yǎng)5d ；
[0011]2)挑取不同菌落大小、形態(tài)單菌落劃線于2216E固體平板，置于28~37°C溫度下培養(yǎng)3~5d，驗證是否純培養(yǎng)，重復(fù)該步驟直到得到純培養(yǎng)；
[0012]3)將純化后的菌株接種于4mL海水配制的高氏一號液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床，150rpm震蕩培養(yǎng)3d，取培養(yǎng)液于10，000~12，OOOg的條件下離心lOmin，除去菌體沉
淀，保存上清；
[0013]4 )取ImL上清接種于20mL指數(shù)生長的無菌塔瑪亞歷山大藻培養(yǎng)液中，于20 ± I °C，12h光照，12h黑暗,50 V- mo I photons nT2s4光照強度條件下培養(yǎng)2d,高氏一號培養(yǎng)基為對照加入藻液中，分別設(shè)置3個平行；觀察塔瑪亞歷山大藻細胞是否沉降，沉降代表菌體7d培養(yǎng)物上清中含有抑藻活性物質(zhì)，從而篩選出弧菌(Vibrio sp.)BS02。
[0014]所述源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸的分子式為C16H3tlO2,分子量大小為254，
結(jié)構(gòu)式如下:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.高效抑藻活性化合物的菌株為弧菌(Vibriosp.)BS02，該菌已于2010年9月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2010217，保藏中心地址為:中國武漢武漢大學(xué)，郵編430072。
2.如權(quán)利要求1所述弧菌(Vibriosp.)BS02的篩選方法，其特征在于包括以下步驟: 1)取福建漳江口紅樹林國家自然保護區(qū)土壤樣品，無菌水經(jīng)過一系列10倍稀釋后，每個稀釋液取0.1mL涂布在高氏一號培養(yǎng)基平板上,在25°C下培養(yǎng)5d ； 2)挑取不同菌落大小、形態(tài)單菌落劃線于2216E固體平板，置于28~37°C溫度下培養(yǎng)3~5d，驗證是否純培養(yǎng)，重復(fù)該步驟直到得到純培養(yǎng)； 3)將純化后的菌株接種于4mL海水配制的高氏一號液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床，150rpm震蕩培養(yǎng)3d，取培養(yǎng)液于10，000~12，OOOg的條件下離心lOmin，除去菌體沉淀，保存上清； 4)取ImL上清接種于20mL指數(shù)生長的無菌塔瑪亞歷山大藻培養(yǎng)液中，于20±1°C，12h光照，12h黑暗,50 V- mo I photons nT2s4光照強度條件下培養(yǎng)2d,高氏一號培養(yǎng)基為對照加入藻液中，分別設(shè)置3個平行；觀察塔瑪亞歷山大藻細胞是否沉降，沉降代表菌體7d培養(yǎng)物上清中含有抑藻活性物質(zhì)，從而篩選出弧菌(Vibrio sp.)BS02。
3.源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸，其特征在于其分子式為C16H3tlO2,分子量大小為254，結(jié)構(gòu)式如下:
4.如權(quán)利要求3所述源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將弧菌(Vibriosp.)BS02菌株接種于新鮮海水配制的固體2216E平板上畫線分離，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ;挑取所述平板上的單菌落接種于海水配制的高氏一號液體培養(yǎng)基中，于28~37°C，180~250rpm培養(yǎng)2~3d后即得發(fā)酵液； 2)將步驟I)中的發(fā)酵液于10，000~12，OOOg離心IOmin;采用乙酸乙酯等體積萃取5次，將乙酸乙酯萃取相合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，加甲醇溶解離心，去鹽、去蛋白； 3)乙酸乙酯萃取物溶于ImL乙酸乙酯中，上樣于硅膠柱，所述硅膠柱為170mmX30mm，200~300目，洗脫劑:二氯甲烷和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脫程序:體積比1: 0，30min ；1: I, 30min ；1: 0, 30min ;洗脫流速:lmL/min ;用收集管收集洗脫液2mL/管； 4)每隔10~15min收集樣品，收集管內(nèi)洗脫液利用薄層層析分析，擴增劑為乙酸乙酯，采用紫外顯色，碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，合并相似組分； 5)合并洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀30°C下真空蒸干，溶解于DMSO驗證抑藻活性； 6)活性組分再通過硅膠柱，所述硅膠柱為170mmX30mm，200~300目；層析，洗脫劑:正己燒和乙酸乙酯的不同比例混合，洗脫程序:體積比100: I, 30min ；60: I, 30min ；40: I, 30min ；20: I, 30min ;洗脫流速:lmL/min ;用收集管收集洗脫液2mL/管；重復(fù)步驟4)和5)檢測活性組份； 7)上述所得活性組份利用S^hadexLH - 20葡聚糖凝膠柱進一步分離，洗脫流動相采用99%甲醇，每6min收集一組分；收集管內(nèi)洗脫液利用薄層層析分析，采用紫外顯色，碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，合并相似組分，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀30°C下真空蒸干，溶解于DMSO驗證抑藻活性，得源于海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸。
5.如權(quán)利要求3所述源于`海洋細菌抑藻活性物質(zhì)棕櫚油酸在制備抑藻劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103484409SQ201310451825
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】鄭天凌, 李 東, 安新麗, 張化俊, 李祎, 鄭偉, 陳章然 申請人:廈門大學(xué)