一種nk細胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種NK細胞的高效制備方法，即通過聯(lián)合細胞因子和飼養(yǎng)細胞的刺激作用，提高NK細胞的增殖速度和純度。本發(fā)明的主要特點是：NCR3LG1和m?IL-15同時轉(zhuǎn)染到K562細胞，m?IL-15可以調(diào)節(jié)NK細胞的活化和增殖，而NCR3LG1作為NK細胞表面主要的活化受體之一NKp30的配體，可以有效的刺激NK細胞活化，且兩者有協(xié)同作用。再加上游離添加的IL-2和IL-21等因子的刺激，可以在21天的培養(yǎng)時間內(nèi)，使PBMC細胞數(shù)量得到超過500倍的增殖，CD3-CD56+NK細胞的比例超過70%。到目前為止，仍未見有將NCR3LG1和m?IL-15同時轉(zhuǎn)染到飼養(yǎng)細胞同時聯(lián)合游離細胞因子共同刺激活化NK細胞的研究報道，本發(fā)明首次提供出一種聯(lián)合飼養(yǎng)細胞和游離因子共同培養(yǎng)制備NK細胞的方法。
【專利說明】—種NK細胞的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領域,具體涉及一種自然殺傷細胞(Natural Killer, NK)的培養(yǎng)，即利用轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)細胞和細胞因子聯(lián)合刺激外周血單核細胞(Peripheral BloodMononuclear Cell, PBMC),獲得大量高純度的NK細胞。
【背景技術(shù)】
[0002]NK細胞是一群較大的顆?；牧馨图毎浼毎砻姹磉_⑶56且缺少⑶3的表達，所以，通常用表面標志⑶3 —⑶56+來界定NK細胞。NK細胞大約可以占到外周血淋巴細胞的5 - 15%，同時分布在人體肝臟、比臟、骨髓和淋巴結(jié)等部位。
[0003]NK細胞是固有免疫系統(tǒng)重要的組成部分，可以通過多種方式對腫瘤細胞或受感染細胞造成殺傷:1、與靶細胞接觸后，釋放穿孔素和顆粒酶；2、通過自身表達的配體，刺激并活化靶細胞表面的死亡受體；3、通過抗體依賴的細胞毒作用對靶細胞造成殺傷。
[0004]由于NK細胞對腫瘤細胞或受感染細胞可以做出快速的免疫反應，所以在機體的免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要的作用。有研究表明，NK細胞不足的患者更容易受到嚴重的系統(tǒng)性病毒感染。外周血中NK細胞活性高的男性患腫瘤的幾率要低10%，而在女性中這一數(shù)值是4%。并且，NK細胞在腫瘤組織中的侵潤提示較好的預后。
[0005]由于NK細胞不需要特異性的抗原刺激，即可對腫瘤細胞造成殺傷的特性，使其在臨床上獲得了廣泛的應用，并取得了一定的療效。但是，無法在體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的高純度NK細胞，成為了進一步提高臨床治療效果的瓶頸。
[0006]最初，NK細胞的活化刺激主要依靠高濃度的IL -2，經(jīng)兩周的培養(yǎng)，僅能獲得10倍左右的增殖。隨后，研究人員嘗試了使用多種因子組合比如IL-12、IL-15、IL-21、⑶2抗體等刺激NK細胞，但是獲得的NK細胞的數(shù)量和純度都有限。飼養(yǎng)細胞的使用，使NK細胞的培養(yǎng)效率獲得很大的提高。比如，用轉(zhuǎn)染⑶137L和mIL -15的K562細胞作為飼養(yǎng)細胞，可以刺激NK細胞獲得超過200倍的增殖。尋找更加理想的刺激NK細胞增殖的方法，已成為科研人員的重要目標。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種NK細胞的高效制備方法，即通過聯(lián)合細胞因子和飼養(yǎng)細胞的刺激作用，提高NK細胞的增殖速度和純度。
[0008] 申請人:在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，將NCR3LG1基因轉(zhuǎn)染到飼養(yǎng)細胞中后，可以刺激活化NK細胞，使其快速增殖，而且它與膜表達的mIL -15對NK細胞的刺激有協(xié)同作用。 申請人:將NCR3LG1和IL - 15同時轉(zhuǎn)染到K562細胞中，作為飼養(yǎng)細胞刺激活化NK細胞，同時添加IL - 2和IL - 21細胞因子，極大的提高了培養(yǎng)NK細胞的效率，從而促成了本發(fā)明。
[0009]上述NK細胞的高效制備方法，包括如下步驟:
[0010]I)使用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將NCR3LG1基因核苷酸片段和包含有mIL -15基因的核苷酸片段同時轉(zhuǎn)染到K562細胞，作為制備NK細胞的飼養(yǎng)細胞；[0011]其中NCR3LG1基因核苷酸片段的序列為:SEQ ID NO: 1，包含有mIL - 15基因的核苷酸片段的序列為SEQ ID NO:2 ；
[0012]2)將從外周血分離得到的PBMC用培養(yǎng)液重懸后，接種培養(yǎng)瓶中，同時接種滅活的K562飼養(yǎng)細胞和IL - 2和IL - 21因子進行培養(yǎng)；
[0013]3)培養(yǎng)4天后，將細胞轉(zhuǎn)移到透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)擴大培養(yǎng)；
[0014]4)持續(xù)擴大培養(yǎng)至第7天，再次添加滅活的K562細胞進行二次刺激；
[0015]5)持續(xù)擴大培養(yǎng)至第21天，收獲細胞，完成NK細胞的制備。
[0016]本發(fā)明步驟2)所述的培養(yǎng)液，其配方組成如下:氯化鈣40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫|丐1200mg/ml、氨基酸 1365mg/ml、維生素 21.4mg/ml、微量元素 0.93126mg/ml、白蛋白 450mg/ml、胰島素 8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧唳0.12mg/ml。
[0017]其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
[0018]維生素的配比如下:2份D -生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素B1、20份D -泛酸酯。
[0019]微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
[0020]為了獲得更好的培養(yǎng)效果，在培養(yǎng)液中還添加有25mg/L的小球藻生長因子(Chlorella Growth Factor, CGF)。
[0021]本發(fā)明所制備出的NK細胞具有增殖速度快、細胞數(shù)量大、純度高等特點。本發(fā)明的主要特點是:NCR3LG1和m IL - 15同時轉(zhuǎn)染到K562細胞，m IL - 15可以調(diào)節(jié)NK細胞的活化和增殖，而NCR3LG1作為NK細胞表面主要的活化受體之一 NKp30的配體，可以有效的刺激NK細胞活化，且兩者有協(xié)同作用。再加上游離添加的IL - 2和IL -21等因子的刺激，可以在21天的培養(yǎng)時間內(nèi)，使PBMC細胞數(shù)量得到超過500倍的增殖，CD3 — CD56+NK細胞的比例超過70%。到目前為止，仍未見有將NCR3LG1和m IL - 15同時轉(zhuǎn)染到飼養(yǎng)細胞同時聯(lián)合游離細胞因子共同刺激活化NK細胞的研究報道，本發(fā)明首次提供出一種聯(lián)合飼養(yǎng)細胞和游離因子共同培養(yǎng)制備NK細胞的方法。
【具體實施方式】
[0022]首先對于本發(fā)明方法所使用的材料進行描述，其中慢病毒載體pEFlalpha -1RESVector,購自CL0NTECH公司；K562細胞:人慢性髓細胞性白血病細胞系，購于中科院細胞庫。
[0023]本發(fā)明NK細胞的高效制備方法，包括如下的步驟:
[0024]I)飼養(yǎng)細胞的構(gòu)建:選取狀態(tài)良好的K562細胞，將NCR3LG1和m IL-15基因核苷酸片段分別插入到慢病毒載體pEFlalpha -1RES Vector的兩個多克隆位點，構(gòu)建目的基因載體；提前24小時將5 X IO6個Lent1-X293T包裝細胞接種到10厘米的培養(yǎng)皿中；將目的基因載體與 36 微升 Lent1-X HTXPackaging Mix, 7.5 微升 Xfect Polymer, 1150 微升 XfectReaction Buffer混合后，室溫靜置10分鐘，然后加入到培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿至于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜；更換新的培養(yǎng)基；48小時后，收集上清液，過0.45微米的無菌濾膜，過濾液即為含有目的基因的病毒懸液；檢測病毒滴度為5.2 X IO7單位/毫升。病毒懸液加入到含K562細胞的24孔培養(yǎng)板中，500微升/孔。經(jīng)傳代和抗性篩選后，作為飼養(yǎng)細胞，持續(xù)培養(yǎng)，待用；
[0025]2)細胞接種:采集50毫升的靜脈外周血，使用淋巴細胞分離液離心分離得到PBMC,生理鹽水洗滌2次，用60毫升的培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)后，接種到細胞培養(yǎng)瓶中，加入同樣數(shù)量的滅活的步驟I)制備的飼養(yǎng)細胞，同時添加360000單位的IL -2，600ng的IL -21因子。
[0026]其中培養(yǎng)液的配方組成如下:氯化鈣40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫|丐1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、維生素21.4mg/ml、微量兀素0.93126mg/ml、白蛋白 450mg/ml、胰島素8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧唳0.12mg/ml。另外，為了獲得更好的培養(yǎng)效果，在培養(yǎng)液中還添加有25mg/L的小球藻生長因子(Chlorella Growth Factor, CGF)。
[0027]上述的培養(yǎng)基是經(jīng)過長期優(yōu)化獲得的，在同樣的培養(yǎng)時間內(nèi)，本發(fā)明的培養(yǎng)液對細胞的增殖效果要明顯好于現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)液，細胞增殖速度可以提高約12%，伽馬干擾素的分泌量提高7.8%。
[0028]3)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細胞在培養(yǎng)4天后，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加培養(yǎng)基至300毫升，添加15000單位的IL - 2，3000ng的IL - 21。
[0029]4)二次刺激:擴大培養(yǎng)至第7天時，取樣計數(shù)，添加相同數(shù)量的滅活的飼養(yǎng)細胞進行二次刺激，并按500單 位/毫升的濃度添加IL - 2，按IOng/毫升的濃度添加IL - 21。
[0030]5)擴大培養(yǎng):每隔2天，根據(jù)細胞濃度補充無血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL - 2，按10納克/毫升的濃度添加IL - 21，在培養(yǎng)到第21天時，取樣進行細胞計數(shù)和流式細胞儀分析。收獲細胞。
[0031]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的描述。
[0032]實驗例I
[0033]I)細胞接種:采集50毫升的靜脈外周血，使用淋巴細胞分離液離心分離得到PBMC,生理鹽水洗滌2次，用60毫升的無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)，細胞數(shù)為4.6 X IO70將細胞接種到培養(yǎng)瓶中，加入同樣數(shù)量的滅活的飼養(yǎng)細胞，添加360000單位的IL - 2,600納克的IL — 21。
[0034]2)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細胞在培養(yǎng)4天后，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無血清培養(yǎng)基至300毫升，添加15000單位的IL - 2，3000納克的IL - 21。
[0035]3)二次刺激:擴大培養(yǎng)至第7天時，取樣計數(shù)，添加相同數(shù)量的滅活的飼養(yǎng)細胞進行二次刺激，并按500單位/毫升的濃度添加IL - 2，按10納克/毫升的濃度添加IL - 21。
[0036]4)擴大培養(yǎng):每隔2天，根據(jù)細胞濃度補充無血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL - 2，按10納克/毫升的濃度添加IL - 21。
[0037]5)收獲細胞:在培養(yǎng)到第21天時，取樣進行細胞計數(shù)和流式細胞儀分析。計算細胞數(shù)為2.47X 101。，增殖537倍；CD3'CD56+NK細胞的比例78.2%。[0038]按照上述步驟，重復試驗7次，高效NK細胞培養(yǎng)方法所得細胞的增殖倍數(shù)平均值為525倍，CD3 - CD56+NK細胞的比例73.6%.[0039]實驗例2
[0040]I)細胞接種:采集50毫升的靜脈外周血，使用淋巴細胞分離液離心分離得到PBMC,生理鹽水洗滌2次，用70毫升的無血清培養(yǎng)基重懸。取樣計數(shù)，細胞數(shù)為5.1 X IO70將細胞接種到培養(yǎng)瓶中，加入同樣數(shù)量的滅活的飼養(yǎng)細胞，添加420000單位的IL - 2,700納克的IL - 21。
[0041]2)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種后的細胞在培養(yǎng)4天后，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無血清培養(yǎng)基至400毫升，添加20000單位的IL - 2，4000納克的IL - 21。
[0042]3)二次刺激:擴大培養(yǎng)至第7天時，取樣計數(shù)，添加相同數(shù)量的滅活的飼養(yǎng)細胞進行二次刺激，并按500單位/毫升的濃度添加IL - 2，按10納克/毫升的濃度添加IL - 21。
[0043]4)擴大培養(yǎng):每隔2天，根據(jù)細胞濃度補充無血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL - 2，按10納克/毫升的濃度添加IL - 21。
[0044]5)收獲細胞:在培養(yǎng)到第21天時，取樣進行細胞計數(shù)和流式細胞儀分析。計算細胞數(shù)為2.82 X 101°,增殖552倍;CD3 _ CD56+NK細胞的比例84.9%。
[0045]實驗例3
[0046]I)細胞接種:采集50毫升的靜脈外周血，使用淋巴細胞分離液離心分離得到PBMC,生理鹽水洗滌2次，用50毫升的無血清培養(yǎng)基重懸，取樣計數(shù)，細胞數(shù)為3.9 X IO70將細胞接種到培養(yǎng)瓶中，加入同樣數(shù)量的滅活的飼養(yǎng)細胞，添加300000單位的IL - 2,500納克的IL — 21。
[0047]2)轉(zhuǎn)移培養(yǎng):接種 后的細胞在培養(yǎng)4天后，轉(zhuǎn)入透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，添加無血清培養(yǎng)基至300毫升，添加15000單位的IL - 2，3000納克的IL - 21。
[0048]3)二次刺激:擴大培養(yǎng)至第7天時，取樣計數(shù)，添加相同數(shù)量的滅活的飼養(yǎng)細胞進行二次刺激，并按500單位/毫升的濃度添加IL - 2，按10納克/毫升的濃度添加IL - 21。
[0049]4)擴大培養(yǎng):每隔2天，根據(jù)細胞濃度補充無血清培養(yǎng)基，并按500單位/毫升的濃度添加IL - 2，按10納克/毫升的濃度添加IL - 21。
[0050]5)收獲細胞:在培養(yǎng)到第21天時，取樣進行細胞計數(shù)和流式細胞儀分析，結(jié)果表明細胞數(shù)為2.1XlOici,增殖539倍;CD3-CD56+NK細胞的比例71.4%，表明本發(fā)明的方法制備NK細胞非常有效率。
【權(quán)利要求】
1.一種NK細胞的高效制備方法，包括如下步驟: 1)使用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將NCR3LG1基因和mIL-15基因同時轉(zhuǎn)染到K562細胞，作為制備NK細胞的飼養(yǎng)細胞； 2)將從外周血分離得到的PBMC，用培養(yǎng)液重懸后，接種培養(yǎng)瓶中，同時接種滅活的K562飼養(yǎng)細胞和IL-2和IL-21因子進行培養(yǎng)； 3)培養(yǎng)4天后，將細胞轉(zhuǎn)移到透氣的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)擴大培養(yǎng)； 4)持續(xù)擴大培養(yǎng)至第7天，再次添加滅活的K562細胞進行二次刺激； 5)持續(xù)擴大培養(yǎng)至第21天，收獲細胞，完成NK細胞的制備。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中NCR3LG1基因的核苷酸序列為:SEQ ID N0:l，mIL-15基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2)中的培養(yǎng)液，其配方組成如下:氯化韓40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫|丐1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、維生素21.4mg/ml、微量兀素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰島素8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.lmg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺喃P定 0.12mg/ml。
4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴氨酸、20份蛋氨酸`、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。
5.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的維生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化膽堿、10份葉酸、35份硫胺素、2份維生素B2、25份維生素Bl、20份D-泛酸酯。
6.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的微量元素的配比如下:85000份硫酸鐵、120份硫酸銅、1500份亞硒酸鈉、6份偏釩酸銨、5000份硫酸鋅。
7.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟2)中的培養(yǎng)液添加有25mg/L的小球藻生長因子。
【文檔編號】C12N5/0783GK103484429SQ201310452975
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】徐矯健, 孫威 申請人:青島麥迪賽斯生物科技有限公司