一種單取代烷基化化合物的方法
【專利摘要】一種單取代烷基化化合物的方法，提供使用醛亞胺型希夫堿制造特定式所表示的α-氨基酸的不對稱單取代烷基化化合物的方法。本發(fā)明的方法中，在介質(zhì)中、在光學(xué)活性的季銨鹽類相轉(zhuǎn)移催化劑和無機(jī)堿的存在下，開始將醛亞胺型希夫堿烷基化的步驟，然后在該烷基化反應(yīng)的化學(xué)計量反應(yīng)結(jié)束時間前的時間進(jìn)行猝滅，由此可以得到光學(xué)純度高的單取代烷基化物。
【專利說明】一種單取代烷基化化合物的方法
[0001]發(fā)明技術(shù)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種單取代烷基化化合物的方法。
[0002]發(fā)明背景
單取代烷基化化合物，在生物和非生物樣本的分析檢測已經(jīng)成為常規(guī)的臨床實(shí)踐和分析實(shí)驗(yàn)室。這些檢測技術(shù)可以分為兩大類:(I)根據(jù)配體-受體的相互作用(例如，免疫測定法為基礎(chǔ)的技術(shù))和(2)基于核酸雜交(多核苷酸序列為基礎(chǔ)的技術(shù))。
[0003]免疫測定法為基礎(chǔ)的技術(shù)，其特征在于由一個序列的步驟包括非共價結(jié)合的抗體，該抗體和抗原互補(bǔ)。多核苷酸序列為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，其特征在于，由一個序列的步驟包括非共價結(jié)合的標(biāo)記的多核苷酸序列或探針的被分析物的互補(bǔ)序列，允許雜交的堿的條件下，通過沃森-克里克配對該雜交檢測。
[0004]非共價結(jié)合的標(biāo)記的序列的核酸探針的互補(bǔ)序列的多核苷酸序列為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)是主要的識別事件。這種綁定事件所帶來的精確的分子排列和互動互補(bǔ)的核苷酸探針和目標(biāo)。它是由非共價鍵合的自由能，例如，氫鍵，堆疊自由能和釋放的能量優(yōu)勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了采用用于測定含有靶序列的核酸探針的非共價結(jié)合，它是必要的，以便能夠結(jié)合的探針檢測到目標(biāo)。這種檢測是通過信令步驟或事件的影響。信令步驟或事件使一些定性或定量的方式檢測的主要識別事件的發(fā)生。
[0006]也可以采用各種各樣的信號事件檢測到的主要的識別事件的發(fā)生。信號事件的選擇取決于所采用的報告分子的特征的特定的信號。雖然標(biāo)記試劑本身，無需進(jìn)一步處理，可能會檢測到，更多的時候，無論是報道分子共價連接，或結(jié)合的非共價結(jié)合到標(biāo)記試劑。
[0007]有用的多核苷酸序列作為探針在核酸檢測系統(tǒng)中的標(biāo)記試劑的共價連接，也可以采用各種各樣的報告分子。所有需要的是，報道分子提供可能被檢測到一個信號，即通過適當(dāng)?shù)姆绞剑心芰σ怨矁r鍵連接到標(biāo)記試劑。
[0008]分子可以是放射性或非放射性的。放射性的信令部分，其特征在于由一個或多個放射性同位素的磷，碘，氫，碳，鈷，鎳等。最好的放射性同位素發(fā)出公測。伽瑪輻射，并且具有長的半衰期。放射性的報告分子的檢測通常是通過由結(jié)晶引起的輻射的檢測器，或一個照相乳劑的灰霧的刺激光子發(fā)射。
[0009]非放射性的報告分子具有的優(yōu)點(diǎn)在于，它們的使用不會造成與暴露于輻射的危險，并且不要求使用特殊的處理技術(shù)。此外，它們通常是更穩(wěn)定的，并且作為一個結(jié)果，更便宜地使用。也許是一樣高或更高的比放射性報告分子的非放射性的報告分子的檢測靈敏度。
[0010]簡單且可靠地與非放射性的檢測標(biāo)記物標(biāo)記的DNA的能力使得它非常適合于使用在各種各樣的分子和細(xì)胞生物學(xué)的應(yīng)用。非放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針可用于某些特定的應(yīng)用，包括雜交反應(yīng)程序(南，北，槽，或斑點(diǎn)印跡，原位雜交)，核酸定位研究，DNA或RNA的定量和DNA酶或RNA酶定量。
[0011]已經(jīng)開發(fā)了兩種酶介導(dǎo)的直接標(biāo)記協(xié)議附加的非放射性檢測標(biāo)記，如熒光化合物的熒光素和若丹明(和其他)的DNA。雖然這些標(biāo)記方法允許非放射性檢測系統(tǒng)的方法或超過放射性測量方法在靈敏度方面仍然存在顯著的缺點(diǎn)，迄今已開發(fā)的每一個的非放射性標(biāo)記系統(tǒng)。I)酶促DNA標(biāo)記系統(tǒng)需要的試劑，包括一些未標(biāo)記和標(biāo)記的核苷酸前體，引物，和/或促進(jìn)DNA合成的酶。標(biāo)記效率不容易控制和最常見的兩種標(biāo)記反應(yīng)(切口平移，隨機(jī)引物)是不可能創(chuàng)建的標(biāo)記探針作為起始DNA是相同的大小。2)直接標(biāo)記方法也有明顯的局限性，其中包括一個標(biāo)簽導(dǎo)致的敏感性降低，費(fèi)力多步的標(biāo)簽協(xié)議，反應(yīng)條件苛刻，變異從反應(yīng),和不穩(wěn)定的反應(yīng)效率較低。
[0012]通常情況下，根據(jù)分析的多核苷酸(RNA，DNA)必須首先是按大小分級分離，轉(zhuǎn)移到固體支持物上，然后通過一系列的步驟處理，以確保只有特異性結(jié)合的探針。檢測雜交產(chǎn)品通常取決于単，重金屬的衍生或抗體絡(luò)合。雜交的方法一直是主食的基礎(chǔ)研究，現(xiàn)在還擔(dān)任商業(yè)試劑盒，用于診斷遺傳，惡性傳染病的數(shù)量不斷增加。
[0013]理想的標(biāo)記方法將結(jié)合一個步驟的簡單性與高效率標(biāo)識，在保持完整的，穩(wěn)定的和相同尺寸的起始的DNA的標(biāo)記產(chǎn)物的結(jié)果。為了開發(fā)與這些特征，我們用氮芥具有的能力，以在一個步驟中的反應(yīng)得到的含有共價鍵連接的加合物的DNA烷基化DNA標(biāo)記試劑。
[0014]間化學(xué)鍵形成的化合物與多聚核酸和/或蛋白質(zhì)中的標(biāo)記結(jié)果的步驟。標(biāo)記過程包括孵化與所述化合物在水性或非水性溶液，其次是與未反應(yīng)的標(biāo)記試劑的標(biāo)記的多聚核酸的分離的多核酸。標(biāo)簽上的程度可以通過調(diào)節(jié)標(biāo)記試劑和多聚核酸的相對量來控制，通過調(diào)整培養(yǎng)的長度，通過溫育的溫度控制，通過控制多聚核酸和標(biāo)記試劑的絕對濃度，并通過控制的解決方案，使用水或有機(jī)溶劑，pH值，離子強(qiáng)度和緩沖液組合物。
[0015]具體實(shí)施方法:
標(biāo)記的多聚核酸可用于多種用途:
I)技術(shù)來檢測特定序列的多聚核酸，依賴目標(biāo)的核酸或蛋白，包括斑點(diǎn)印跡，槽印跡，Southern印跡,Northern印跡雜交,西南部,FISH (突光原位雜交或標(biāo)記的多聚核酸的結(jié)合親和力，雜交)，原位雜交的RNA和DNA序列，新發(fā)展上的“芯片”或多孔或多時隙的移動設(shè)備在其中的是多聚核酸的組合技術(shù)。
[0016]2)標(biāo)記，以確定它們的亞細(xì)胞和組織的位置傳遞到細(xì)胞在體外或體內(nèi)的多聚核酸。
[0017]3)標(biāo)記的寡核苷酸被用作引物如PCR擴(kuò)增技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。
[0018]4)聚核酸定量。
[0019]5)定量核酸(核糖核酸酶和DNA酶)，熒光偏振或熒光去猝滅。
[0020]6)聚核酸測序。
[0021]7)直接突變檢測。
[0022]8)反應(yīng)性基團(tuán)的共價連接，使用反義的應(yīng)用程序。
[0023]還描述了一種方法官能化的地高辛。地高辛官能團(tuán)首先在終端上的糖殘基形成地高辛二醛氧化二醇的功能，隨后的還原性烷基化反應(yīng)用氰基硼氫化鈉和聯(lián)化合物。鏈接器包括與伯胺的有機(jī)分子和受保護(hù)的伯胺，后將地高辛的衍生物與具有伯氨基的保護(hù)基團(tuán)的去除。伯胺可以轉(zhuǎn)化為醛或酮的反應(yīng)性基團(tuán)如氨基硫脲或酰肼基的硫醇反應(yīng)性基團(tuán)，如鹵代乙酰胺，馬來酰亞胺，二硫醚，或吡啶基二硫；；胺的反應(yīng)性基團(tuán)(如琥珀酰亞胺酯)，異硫氰酸酯，或磺酰氯，或如重氮甲烷或鹵代乙?；姆磻?yīng)性基團(tuán)的羧酸。此方法的結(jié)果，可用于標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，肽，多糖，脂質(zhì)，和其它感興趣的分子中地高辛分子。從廉價的前驅(qū)物也適合直線前進(jìn)的合成實(shí)用程序，以這種獨(dú)特的方法，提供高辛標(biāo)簽。
[0024]提供了一個單步標(biāo)簽共價連接的核酸的方法，包括，用于烷基化的核酸形成共價鍵有可拆卸的標(biāo)記試劑。然后，結(jié)合的共價鍵有可拆卸的標(biāo)記試劑的混合物，其中包含的核酸，其特征在于，所述標(biāo)記試劑的條件下，從而與核酸形成共價鍵的反應(yīng)性。
[0025]提供的化合物是標(biāo)記分子，其含有一個共價鍵有可拆卸的用于烷基化，化學(xué)品在一個單步反應(yīng)的標(biāo)記試劑，從而提供了用可檢測的報道分子的化學(xué)。
[0026]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供的化合物具有以下結(jié)構(gòu)，包括:
式中，D是選自熒光發(fā)光化合物，放射性化合物，半抗原，免疫原性分子，化學(xué)發(fā)光的發(fā)光化合物，和蛋白質(zhì)組成的組中，B被選中的組中的分子具有親和性的核酸組成的靜電相互作用，小溝結(jié)合，大溝結(jié)合，夾層；選擇A的從烷化劑芥末和3元環(huán)衍生物組成的組。
[0027]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有通式結(jié)構(gòu)的化合物，其特征在于，一個含有共價鍵有可拆卸的標(biāo)記試劑的容器，用于在一個單步反應(yīng)中烷基化。也隨試劑盒提供的使用說明。所用的術(shù)語的使用說明，是指切合的試劑中的至少一個的濃度測定方法的具體表現(xiàn)，混合的參數(shù)，如試劑和樣品的相對量，試劑/樣品外加劑的維護(hù)時間周期，溫度，緩沖液條件等。
[0028]人能夠確定是否一個特定的化合物是適合用于本發(fā)明的通過比較候選化合物與成功的實(shí)施例中所示的化合物。一個合適的烷基化化合物烷基化的目標(biāo)分子，在一個單步反應(yīng)。該例子演示的化合物為成功的目標(biāo)分子的烷基化反應(yīng)的合適的方法及其制備的。如果一個候選化合物進(jìn)行至少80 %的效率，在實(shí)施例中所述的化合物，該化合物是一個合適的步驟的烷基化化合物。
[0029]根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施例的本發(fā)明的核酸分子的核苷酸序列，這可能是互補(bǔ)的靶序列的，被轉(zhuǎn)換成通過共價連接報告分子標(biāo)記化合物。幾種化合物描述是有用的報告分子，用于將核酸和蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，適合用于本發(fā)明的化合物包括以下三個部分中的一個或多個:
A-烷基化組——電的化學(xué)功能，讓他們成為軸承親核基團(tuán)的化合物共價連接。烷基化試劑包括芥子氣(氮芥和硫芥子氣)，三元環(huán)(氮丙啶，環(huán)氧乙烷，cyclopranes,激活的環(huán)丙烷，環(huán)硫化物)。
[0030]B-墊片——烷基化基團(tuán)之間的連接和報道分子-間隔基團(tuán)，包括烷烴，烯烴，酯，醚，丙三醇，酰胺，糖，多糖，雜原子如氧，硫或氮，和/或分子裂解的生理?xiàng)l件下，如一個二硫橋或酶敏感組。間隔件可以帶有凈正電荷，或者是以下任何一種:小溝結(jié)合劑，大溝結(jié)合齊?，嵌入基團(tuán)，或其它DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽，如轉(zhuǎn)錄因子，從而提供的化合物具有增加親和力的多聚核酸。間隔件設(shè)置，以減輕可能的分子分離的烷基化化合物以及烷基化反應(yīng)后的核酸的報道分子的干擾。
[0031]C-記者分子——附加的檢測為目的的化合物的化學(xué)部分。記者分子可以是熒光的，如一個若丹明或flourescein的衍生物。記者分子可以是半抗原，如地高辛，或結(jié)合到其它分子如生物素，抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈霉抗生物素蛋白或結(jié)合的外源凝集素的寡糖結(jié)合的分子，該分子。記者分子可以是蛋白質(zhì)或酶如堿性磷酸酶。記者分子還可能包含放射性原子如 H.sup.3,C.sup.14,P.sup.32,P.sup.33 S.sup.35 1.sup.125 1.sup。131Tc.sup.99，以及其他放射性元素。
[0032]在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中的一些化合物是有用的交聯(lián)聚核酸和蛋白質(zhì)的其它化合物，包括報告分子，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，多核酸。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，適合用于本發(fā)明的化合物包括以下三個部分中的一個或多個:
A-烷基化組——電的化學(xué)功能，讓他們成為軸承親核基團(tuán)的化合物共價連接。烷基化試劑包括芥子氣(氮芥和硫芥子氣)，三元環(huán)(氮丙啶，環(huán)氧乙烷，cyclopranes,激活的環(huán)丙烷，環(huán)硫化物)。
[0033]B-墊片——烷基化基團(tuán)之間的連接和報道分子-間隔基團(tuán)，包括烷烴，烯烴，酯，醚，丙三醇，酰胺，糖，多糖，雜原子如氧，硫或氮，和/或分子裂解的生理?xiàng)l件下，如一個二硫橋或酶敏感組。間隔件可以帶有凈正電荷，或者是以下任何一種:小溝結(jié)合劑，大溝結(jié)合齊?，嵌入基團(tuán)，或其它DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽，如轉(zhuǎn)錄因子，從而提供的化合物具有增加親和力的多聚核酸。
[0034]C-反應(yīng)組——能夠進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)反應(yīng)的一種化學(xué)物質(zhì)的功能。反應(yīng)性基團(tuán)包括，但不限于烷基化基團(tuán)，胺，醇，巰基，異硫氰酸酯，異氰酸酯，酰基疊氮化物，N-hydroxysuccinimides, sufonyl氯，醒，環(huán)氧化物，碳酸酯，亞氨酸酯，羧酸鹽，alkylposphates arylhalides (如二氟二硝基苯)，1doacetamides,馬來酰亞胺，氮丙唳的丙烯?；然飂lourobenzes, 二硫化物,琥拍酰胺,羧酸,活化的羧酸基團(tuán)。
[0035]在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中，用于標(biāo)識使用適合使用本發(fā)明包括以下三個部分中的一個或多個化合物的多聚核酸的方法:
A-烷基化組——電的化學(xué)功能，讓他們成為軸承親核基團(tuán)的化合物共價連接。烷基化試劑包括芥子氣(氮芥和硫芥子氣)，三元環(huán)(氮丙啶，也被稱為環(huán)氧化物，cyclopranes,激活環(huán)丙烷，環(huán)氧乙烷和環(huán)硫化物)。
[0036]B-墊片——烷基化基團(tuán)之間的連接和報道分子-間隔基團(tuán)，包括烷烴，烯烴，酯，醚，丙三醇，酰胺，糖，多糖，雜原子如氧，硫或氮，和/或分子裂解的生理?xiàng)l件下，如一個二硫橋或酶敏感組。間隔件可以帶有凈正電荷，或者是以下任何一種:小溝結(jié)合劑，大溝結(jié)合齊?，嵌入基團(tuán)，或其它DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽，如轉(zhuǎn)錄因子，從而提供的化合物具有增加親和力的多聚核酸。
[0037]C-記者分子-報告分子一附加的檢測為目的的化合物的化學(xué)部分。記者分子可以是突光的，如一個若丹明或flourescein的衍生物。記者分子可以是半抗原，如地高辛，或結(jié)合到其它分子如生物素，抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈霉抗生物素蛋白或結(jié)合的外源凝集素的寡糖結(jié)合的分子，該分子。記者分子可以是蛋白質(zhì)或酶如堿性磷酸酶。記者分子還可能包含放射性原子如 H.sup.3, C.sup.14,P.sup.32,P.sup.33 S.sup.35 1.sup.1251.sup。113 Tc.sup.99，以及其他放射性元素。
[0038]大量的核酸序列中的任何一個，也可以采用按照本發(fā)明用于檢測目標(biāo)分子作為探針。包括，例如，在RNA和DNA的靶序列，以及各種病毒，類病毒，真菌，寄生蟲或細(xì)菌感染，遺傳性疾病或其他可取的檢測目標(biāo)分子的序列的多核苷酸序列的特征。探針可以是合成的，半合成的或天然來源的。探針分子，包括多核糖核苷酸和脫氧。
[0039]雖然本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中使用的核酸的約30個堿基或更長的時間，也可以使用較短的核酸，只要是能夠具體地，穩(wěn)定地雜交的靶序列。可以被設(shè)計的核酸雜交，無論正義或反義鏈的DNA雙鏈。然而，當(dāng)目標(biāo)是信使RNA，探針的序列應(yīng)該是它的補(bǔ)充。
【權(quán)利要求】
1.一種單取代烷基化化合物的方法，包括:a)形成一個共價鍵有可拆卸的標(biāo)記試劑，選自選自芥末，和氮丙啶，用于烷基化的核酸； b)將共價鍵有可拆卸的標(biāo)記試劑的混合物，其中包含的核酸，其特征在于，所述標(biāo)記試劑的條件下，具有非特異性的序列與核酸在一段時間內(nèi)的時間最多一小時，從而形成共價鍵的反應(yīng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的共價鍵有可拆卸的標(biāo)記試劑包括具有報道分子的烷基化化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述烷基化劑是選自芥末和氮丙啶組成的組中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，芥末選自選自氮芥和硫芥子氣。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述報道分子包括從熒光發(fā)光分子，含半抗原分子，蛋白質(zhì)，放射性化學(xué)物質(zhì)組成的組中選擇的分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述報道分子是可連接到烷基化的化合物與間隔臂。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，連接臂是陽離子。
【文檔編號】C12Q1/68GK104513817SQ201310453942
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】王阿慧 申請人:上海滿益科技有限公司