一種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗jxa1-r株的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXA1-R株的方法及試劑盒。檢測方法是采用RFLP分析法，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段的引物，提取待檢樣品中的RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增JXA1-R株ORF1a3195～3682位核苷酸片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶SacⅡ切割后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)長度487bp的條帶時判斷為該待檢樣品中含有豬藍(lán)耳病活疫苗JXA1-R株。所述試劑盒主要包括上述的引物及限制性核酸內(nèi)切酶SacⅡ。本發(fā)明應(yīng)用普通PCR和一些常規(guī)儀器即可完成檢測，步驟簡單，縮短了檢測時間，也顯著降低了檢測成本。
【專利說明】—種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXA1-R株的方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]高致病性豬藍(lán)耳病是由高致病性的豬藍(lán)耳病毒(又稱豬繁殖與呼吸綜合征病毒，porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的母豬嚴(yán)重繁殖障礙、斷奶豬生長遲緩及死亡的傳染性疾病。該病自06年爆發(fā)以來，給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前絕大多數(shù)豬場使用PRRSV變異株(JXAl-R)弱毒疫苗(即豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株，或簡稱JXAl-R疫苗株)對該病進(jìn)行預(yù)防。高致病性豬藍(lán)耳病和普通豬藍(lán)耳病可用RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行鑒別檢測，但JXAl-R疫苗株與野毒株無法用現(xiàn)有的PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法進(jìn)行鑒別檢測。JXAl-R疫苗株可在豬體內(nèi)繁殖并產(chǎn)生病毒血癥，這給高致病性豬藍(lán)耳病的實(shí)驗(yàn)室診斷造成很大干擾，難以確定檢測到的高致病性豬藍(lán)耳病毒是疫苗毒還是野毒。
[0003]當(dāng)前已有的JXAl-R疫苗株鑒別檢測方法有以下兩種:
方法一是使用北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，以熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)有特定的擴(kuò)增曲線時，則判定為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒(JXAl-R疫苗株)陽性，否則判定為陰性，一般需要3個小時完成實(shí)驗(yàn)。該方法的核心技術(shù)包括反應(yīng)體系和反應(yīng)程序兩部分，反應(yīng)體系的關(guān)鍵是引物和探針的核苷酸序列及其與酶類和鹽類的配制比例， 各種試劑必須按其推薦的比例進(jìn)行配制；反應(yīng)程序的關(guān)鍵是控制好最佳退火和延伸時間。該方法雖然準(zhǔn)確快速，但由于實(shí)驗(yàn)所需的檢測試劑盒及熒光定量PCR儀比較昂貴，導(dǎo)致檢測成本較高。
[0004]方法二是采用測序法，以核苷酸的克隆和序列檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，為常規(guī)序列分析方法。該方法需要的試劑包括特異性擴(kuò)增引物、核酸提取試劑盒、通用的PCR試劑盒、核酸純化試劑盒、PMD-18T載體試劑盒及DH5 α大腸桿菌，需要的儀器包括PCR儀、離心機(jī)、紫外透射儀、恒溫培養(yǎng)箱，具體操作步驟是先用特異性引物擴(kuò)增待檢樣品核酸的特異基因片段，將目的基因片段純化后克隆入PMD-18T載體，再將克隆好的載體送往測序公司進(jìn)行測序，最后將測得序列與高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒(JXAl-R疫苗株)進(jìn)行比對，與疫苗毒核酸同源性較高，且特殊位點(diǎn)未發(fā)生變異的，則判定為JXAl-R株，檢測一次一般需要7~10天時間。同樣存在成本高的問題，另外檢測周期也較長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提供了一種簡單快速的檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法。
[0006]PRRSV的基因組全長約15kb，含有9個開放閱讀框(ORFs)，順序依次為5’ -0RF1a-0RFlb-0RF2a-0RF2b-0RF-(3-7)3’。每個閱讀框與相鄰的閱讀框均有少量的重疊。通過BLAST軟件將JXAl-R疫苗株與2010年前(2010年開始使用JXAl-R株弱毒疫苗)NCBI上發(fā)表的PRRSV的其他毒株核苷酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)JXAl-R疫苗株在其ORFla 3195~3682位基因序列中特異缺失限制性核酸內(nèi)切酶fee II的酶切位點(diǎn)，本發(fā)明利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)分析技術(shù)原理，通過這一特殊缺失的酶切位點(diǎn)，結(jié)合 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，逆轉(zhuǎn)錄PCR)方法，對高致病性的豬藍(lán)耳病JXAl-R疫苗株進(jìn)行鑒別檢測，即能準(zhǔn)確鑒別JXAl-R疫苗株與其他PRRSV感染樣品。[0007]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
一種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法，是采用RFLP分析法，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段的引物，提取待檢樣品中的RNA，通過RT-PCR，用所述引物擴(kuò)增JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段，擴(kuò)增產(chǎn)物與限制性核酸內(nèi)切酶fee II進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)長度487bp的條帶時判斷為待檢樣品中含有豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株。
[0008]作為一種優(yōu)選方案，上述檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法中，所述RT-PCR為一步法RT-PCR，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~2所示。
[0009]本發(fā)明還提供了一種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的試劑盒，該試劑盒包括SEQID NO: 1~2所示的引物核苷酸序列和限制性核酸內(nèi)切酶5^ II。
[0010]作為一種優(yōu)選方案，上述檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的試劑盒，由一步法RT-PCR反應(yīng)液和酶切反應(yīng)液兩組試劑組成，其中:
一步法RT-PCR反應(yīng)液:10倍稀釋的PCR緩沖液5PL，5U/^L的DNA聚合酶?μ?，200υ/μ?的反轉(zhuǎn)錄酶 lKL，IOmM 的 dNTPslPL，200υ/μ? 的 RNA 酶抑制劑 ?μ?，25mM 的 MgCl2 8μ?, 20μΜ的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示的引物核苷酸序列各?μ?，以及無RNA酶滅菌水28μ? ;
酶切反應(yīng)液:0.l%(w/v)BSA (牛血清白蛋白)2μ?, 10倍稀釋的酶切反應(yīng)緩沖液2μ?，限制性核酸內(nèi)切酶fee II IμL，滅菌雙蒸水5PL;
所述PCR緩沖液由Tris-HCl (三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽)、KCl和MgCl2的混合水溶液組成，pH值為8.5，其中Tris-HCl濃度為IOOmM, KCl濃度為500nM, MgCl2濃度為15nM ；所述酶切反應(yīng)緩沖液由醋酸鎂、二硫蘇糖醇和醋酸鉀的混合水溶液組成，其中醋酸鎂的濃度為IOOmM, 二硫蘇糖醇的濃度為5mM，醋酸鉀的濃度為660mM。
[0011]本發(fā)明還提供用上述檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的試劑盒檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法，是將待檢樣品提取RNA后使用所述一步法RT-PCR反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?50°C 30分鐘；94°C 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，共40個循環(huán)；72°C，延伸8~10分鐘；取部分?jǐn)U增產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中，37°C下反應(yīng)I小時；終止反應(yīng)取酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍照觀察電泳條帶，如果出現(xiàn)487bp長度的片段判斷為待檢樣品中含有豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
與熒光定量PCR方法相比，本發(fā)明主要采用了普通PCR方法，最終通過特殊位點(diǎn)的酶切反應(yīng)鑒別檢測野毒和疫苗度，所用試劑耗材相對價格便宜，檢測成本較低。
[0013]與測序方法相比較，本發(fā)明在PCR反應(yīng)后不需要再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，只需要應(yīng)用酶切方法即可得到結(jié)果，操作簡便高效，成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為不同病毒株的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶fee II的酶切電泳圖，其中“陰”為陰性對照，I為高致病性藍(lán)耳病JXAl野毒株，2為勃林格豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(VR-2332株)，3為豬繁殖與呼吸綜合征毒株SB株，4為豬瘟疫苗(豬瘟威)，5為豬傳染性胃腸炎病毒KY毒株，6為JXAl-R疫苗株，M為TAKARA寶生物公司生產(chǎn)的DL2000的標(biāo)準(zhǔn)核酸標(biāo)記，從下至上分別是100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp核酸條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但實(shí)施例并不作為對本發(fā)明的限定。除特殊說明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段。
[0016]實(shí)施例中所述的“NX ”表示稀釋N倍，其中N為自然數(shù)。
[0017]實(shí)驗(yàn)材料及試劑來源:JXAl-R疫苗株、豬瘟疫苗(豬瘟威)購自廣東大華農(nóng)動物保健品股份公司；勃林格豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(VR-2332株)購自廣州市柏林農(nóng)產(chǎn)品有限公司；高致病性藍(lán)耳病JXAl野毒株核酸由廣東大華農(nóng)動物保健品股份公司饋贈；豬傳染性胃腸炎病毒KY株由本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)。限制性核酸內(nèi)切酶fee II購自TAKARA寶生物公司。
[0018]實(shí)施例1
完成JXAl-R疫苗株鑒別檢測`主要分為兩個步驟實(shí)現(xiàn)。
[0019]第一步:疫苗和病毒液RT-PCR (O疫苗和病毒液的處理及核酸提取:
疫苗用5mL滅菌雙蒸水稀釋后備用；病毒液用滅菌雙蒸水5倍稀釋后備用。
[0020]處理好的疫苗和病毒液用體液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提試劑盒(購自TAKARA寶生物公司，也可用其他核酸提取方法)提取核酸，保存?zhèn)溆谩?br> [0021](2)核酸 RT-PCR:
RT-PCR的擴(kuò)增引物如下:
上游引物 S66:5’ -TCTCCCAAAGATGATTCTCGAG-3’ (SEQ ID NO:1)；
下游引物 S88:5’ -AATCACCCGGAGAATAACCAC-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0022]一步法RT-PCR反`應(yīng)液:10倍稀釋的PCR緩沖液5PL，5U/^L的DNA聚合酶?μ?，200υ/μ? 的反轉(zhuǎn)錄酶 lPL，IOmM 的 dNTPslPL，200U/^L 的 RNA 酶抑制劑 lPL，25mM 的 MgCl28μ?, 20μΜ的引物S66和S88各?μ?，抽提的RNA 3μ?,以及無RNA酶滅菌水28μ?。其中PCR緩沖液由Tris-HCl、KCl和MgCl2的混合水溶液組成，pH值為8.5，其中Tris-HCl濃度為IOOmM, KCl 濃度為 500nM，MgCl2 濃度為 15nM。
[0023]或者按TAKARA寶生物公司生產(chǎn)的一步法RT-PCR試劑盒(PrimeScriptwOneStep RT-PCR Kit Ver.2，目錄號為DRR055A)使用說明進(jìn)行配制，反應(yīng)體系25μ?，具體為:PrimeScript I Step Enzyme Mix IM-L, 2X1 Step Buffer 12.5KL,濃度為 ΙΟμΜ 的上游引物 S66 lPL，濃度為 ΙΟμΜ 的下游引物 S88 ?μ?，抽提的 RNA 3μ?，RNase Free dH20 6.5μ?。[0024]以上反應(yīng)體系配制好后置于PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?50°C 30min反轉(zhuǎn)錄；94°C 2min反轉(zhuǎn)錄酶滅活；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 60s，共40個循環(huán)；72°C延伸8^10min ;最后8°C降溫，反應(yīng)結(jié)束。
[0025]第二步:PCR產(chǎn)物的酶切鑒定
酶切反應(yīng)體系的配制:第一步獲得的PCR產(chǎn)物10μ?，0.l%(w/v)BSA 2μ?,10Χ緩沖液(由醋酸鎂、二硫蘇糖醇和醋酸鉀的混合水溶液組成，其中醋酸鎂的濃度為IOOmM, 二硫蘇糖醇的濃度為5mM，醋酸鉀的濃度為660mM) 2μ?,限制性核酸內(nèi)切酶fee II ?μ?,滅菌雙蒸水5μL。
[0026]酶切反應(yīng)體系配制好后輕輕混勻，置于37°C水浴鍋(或恒溫培養(yǎng)箱)中作用Ih (I小時)。
[0027]酶切反應(yīng)結(jié)束后，加入2PL IOXloading buffer，混勻以終止反應(yīng)，取5μ?酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。結(jié)果出現(xiàn)487bp目的條帶，判定為JXAl-R疫苗株陽性；出現(xiàn)244bp條帶，判定為非JXAl-R疫苗株(其他毒株在ORFla 3195~3682位核苷酸片段有fee II酶切位點(diǎn))，如圖1。由于其他毒株ORFla相應(yīng)擴(kuò)增片段經(jīng)過fee II酶切后的片段長度為244bp，遠(yuǎn)小于487bp，在電泳條帶上很容易區(qū)分開來，且電泳DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的梯度差值通常在IOObp以上，因此可粗略判斷為分子量在460bp飛IObp左右的即為含JXAl-R疫苗株的樣品。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法，其特征在于，采用RFLP分析法，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段的引物，提取待檢樣品中的RNA，通過RT-PCR，用所述引物擴(kuò)增JXAl-R株ORFla 3195~3682位核苷酸片段，擴(kuò)增產(chǎn)物與限制性核酸內(nèi)切酶fee II進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)長度487bp的條帶時判斷為待檢樣品中含有豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法，其特征在于，所述RT-PCR為一步法RT-PCR，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
3.—種檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括SEQ IDNO: 1-2所示的引物核苷酸序列和限制性核酸內(nèi)切酶II。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的試劑盒，其特征在于，該試劑盒由一步法RT-PCR反應(yīng)液和酶切反應(yīng)液兩組試劑組成，其中: 一步法RT-PCR反應(yīng)液:10倍稀釋的PCR緩沖液5PL，5U/^L的DNA聚合酶?μ?，200υ/μ?的反轉(zhuǎn)錄酶 lKL，IOmM 的 dNTPslPL，200υ/μ? 的 RNA 酶抑制劑 ?μ?，25mM 的 MgCl2 8μ?, 20μΜ的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示的引物核苷酸序列各?μ?，以及無RNA酶滅菌水28μ? ; 酶切反應(yīng)液:0.l%(w/v)BSA 2μ?, 10倍稀釋的酶切反應(yīng)緩沖液2μ?，限制性核酸內(nèi)切酶Sac II 1ML,滅菌雙蒸水5PL ; 所述PCR緩沖液由Tri s-HCl、KCl和MgCl2的混合水溶液組成，pH值為8.5，其中Tris-HCl 濃度為 lOOmM，KCl 濃度為 500nM，MgCl2 濃度為 15nM ； 所述酶切反應(yīng)緩沖液由醋酸鎂、二硫蘇糖醇和醋酸鉀的混合水溶液組成，其中醋酸鎂的濃度為IOOmM, 二硫蘇糖醇的濃度為5mM，醋酸鉀的濃度為660mM。
5.用權(quán)利要求4所述的檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的試劑盒檢測豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株的方法，其特征在于，待檢樣品提取RNA后使用所述一步法RT-PCR反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?50°C 30分鐘；94°C 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，共40個循環(huán)；72°C，延伸8~10分鐘；取部分?jǐn)U增產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中，37°C下反應(yīng)I小時；終止反應(yīng)取酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍照觀察電泳條帶，如果出現(xiàn)487bp長度的片段判斷為待檢樣品中含有豬藍(lán)耳病活疫苗JXAl-R株。
【文檔編號】C12Q1/68GK103498008SQ201310455113
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】宋志軍, 祝衛(wèi)國, 王東東, 羅小飛, 宋延華 申請人:廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司