檢測(cè)甲型血友病凝血因子Ⅷ基因第一內(nèi)含子倒位的引物、方法和試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一內(nèi)含子倒位的方法、引物和試劑盒，包括：擴(kuò)增凝血因子Ⅷ基因Intlh-1區(qū)域的引物SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3；擴(kuò)增凝血因子Ⅷ基因Intlh-2區(qū)域的引物SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4。利用該方法和試劑盒可以簡(jiǎn)便、高效、特異地檢測(cè)甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一內(nèi)含子倒位。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)甲型血友病凝血因子WI基因第一內(nèi)含子倒位的引物、方法和試劑盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及檢測(cè)甲型血友病凝血因子珊基因的第一內(nèi)含子的引物、方法和試劑盒，利用長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增技術(shù)可以對(duì)甲型血友病凝血因子珊基因的第一內(nèi)含子倒位進(jìn)行檢測(cè)。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]血友病是一組遺傳性凝血因子缺乏引起的出血性疾病，包括血友病A(甲型)、血友病B (乙型)和遺傳性因子X(jué)I缺乏癥(丙型)。前兩者為性連鎖隱性遺傳，后者為常染色體不完全隱性遺傳。
[0005]甲型血友病是一種由于凝血因子VDI (Factor VIII，F(xiàn) VDI)基因缺陷導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴(yán)重凝血障礙的X染色體連鎖隱性遺傳病，男女均可發(fā)病，但絕大部分患者為男性。
[0006]?珊基因位于乂928，長(zhǎng)度約186kb，含有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子。F VDI基因不僅結(jié)構(gòu)龐大，而且導(dǎo)致血友病A的基因突變種類(lèi)繁多，其中最常見(jiàn)的是由FVDI基因第22號(hào)內(nèi)含子倒位突變引起的F VDI嚴(yán)重缺乏，它是45%~50%重型血友病A患者的分子發(fā)病機(jī)制，而F VDI基因第I號(hào)內(nèi)含子 倒位是另一常見(jiàn)突變，約5%的重型血友病A是由該突變所致。
[0007]F VDI基因第I號(hào)內(nèi)含子倒位與F VDI抑制物形成的關(guān)系:自1996年Brinke等首次發(fā)現(xiàn)了 FVDI基因第I號(hào)內(nèi)含子可發(fā)生倒位以來(lái)，近年來(lái)越來(lái)越多的研究報(bào)道，F(xiàn)VDI第I號(hào)內(nèi)含子倒位是僅次于第22號(hào)內(nèi)含子倒位導(dǎo)致重型血友病A的常見(jiàn)原因。目前認(rèn)為，第I號(hào)內(nèi)含子倒位發(fā)生率為1.2^5%之間。最近，Schroder等對(duì)德國(guó)的1127例血友病A患者的研究結(jié)果顯示，有23例患者發(fā)生第I號(hào)內(nèi)含子倒位，占2.04% ( 23/ 1127 )，抑制物陽(yáng)性率為26.09%,明顯高于其他國(guó)家。
[0008]FVDI基因在其第I號(hào)內(nèi)含子倒位產(chǎn)生的分子機(jī)制與第22號(hào)內(nèi)含子倒位的分子機(jī)制非常相似，其本質(zhì)都是由于基因組水平上F VDI基因內(nèi)部和外部靠近遠(yuǎn)端的高度同源序列發(fā)生基因重組，從而影響F VDI基因mRNA的形成，造成正常蛋白嚴(yán)重缺乏而導(dǎo)致重型血友病A的發(fā)生。FVDI基因在其第I號(hào)內(nèi)含子內(nèi)有一段1041bp的序列(丨社111-1)，和與？珊基因相隔約140kb處的另一段序列(intlh-2)的同源性高達(dá)99.9%。Intlh-2區(qū)域位于C6.1A基因和VBPI基因之間，其方向與intlh-Ι完全相反(如圖1所示)。Inilh-1和inilh_2發(fā)生基因重組后形成兩個(gè)嵌合的mRNA:—個(gè)mRNA包含F(xiàn) VDI基因的第I號(hào)外顯子及后續(xù)的VBPI基因第2號(hào)外顯子到第6號(hào)外顯子，受F VDI基因的啟動(dòng)子調(diào)控；另一個(gè)mRNA包含C6.1A基因幾乎所有編碼區(qū)及后續(xù)的F珊基因部分第I號(hào)內(nèi)含子和第2號(hào)外顯子到第26號(hào)外顯子，受C6.1A基因的啟動(dòng)子調(diào)控。由于F VDI基因大部分編碼區(qū)位于C6.1A基因終止密碼子的下游并與F珊基因信號(hào)肽分離，因而即使這種嵌合的mRNA能夠穩(wěn)定存在并在肝臟中足量合成，也不可能有F VDI蛋白分泌至外周血中。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供用一種檢測(cè)甲型血友病凝血因子VDI基因的第一內(nèi)含子倒位的引物序列，利用該引物序列可以簡(jiǎn)便、高效、特異的檢測(cè)甲型血友病凝血因子珊基因的第一內(nèi)含子倒位。
[0011]本發(fā)明提供檢測(cè)甲型血友病凝血因子珊基因的第一內(nèi)含子倒位的引物，其特征在于，包括:
(i )擴(kuò)增 FVDI 基因 Intlh-1 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3，其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ；
(ii )擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-2 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4，其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TG GGTGATATAAGCTGAGCTA。
[0012]進(jìn)一步地，引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 使用濃度分別為 2 μ M、2 μ M 和 2 μ Mo
[0013]進(jìn)一步地，引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 使用濃度分別為 2 μ Μ、2 μ M 和 2 μ Mo
[0014]本發(fā)明還提供檢測(cè)甲型血友病凝血因子VDI基因的第一內(nèi)含子倒位的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:
(i ) PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑；
(?)權(quán)利要求1所述引物序列。
[0015]進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括dNTP、2*PCR緩沖液、Mg2+、Taq酶。
[0016]進(jìn)一步地，Mg2+反應(yīng)終濃度為1.0mM ；dNTP反應(yīng)終濃度為3.0mM。
[0017]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)甲型血友病凝血因子珊基因的第一內(nèi)含子倒位的方法，包括如下步驟:
(i )采集待測(cè)血液樣本，提取DNA ；
(? )以該DNA為模板，進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，其中所述PCR引物為擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-1 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 ;其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ；
擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-2 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 ;其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA ；
(iii)步驟(ii )中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析檢測(cè)結(jié)果。
[0018]進(jìn)一步地，步驟(ii )的PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:94°C 2min預(yù)變性；94°C30s、64°C 30s,72°C 3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
[0019]進(jìn)一步地，擴(kuò)增分為兩管完成，第一管包含3條引物，分別為SEQ ID N0.USEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3 ;第二管包含3 條引物，分別為 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4。
[0020]進(jìn)一步地，第一管中的引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3使用濃度分別為 2μΜ、2μΜ和 2μΜ;第二管中的引物 SEQ ID N0.USEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4 使用濃度分另lJ為2 μ Μ、2 μ M和2 μ Μ。
[0021]應(yīng)用PCR檢測(cè)F VDI基因第I號(hào)內(nèi)含子倒位的方法包括inilh-Ι和intlh-2兩個(gè)擴(kuò)增體系，每個(gè)擴(kuò)增體系包括三條不同的引物。Intlh-1擴(kuò)增體系包含針對(duì)inilh-Ι區(qū)域的引物9F和9cR，另外加上引物intlh-2F，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后在第I號(hào)內(nèi)含子倒位陰性患者中會(huì)產(chǎn)生一條1908bp的條帶,而在第I號(hào)內(nèi)含子倒位陽(yáng)性患者會(huì)產(chǎn)生一條1323bp的條帶,該倒位的女性攜帶者會(huì)出現(xiàn)1908bp和1323bp的兩條條帶。Intlh-2擴(kuò)增體系包含針對(duì)intlh-2區(qū)域引物intlh-2F和intlh_2R，另外加上引物9F，該反應(yīng)產(chǎn)物在第I號(hào)內(nèi)含子倒位陰性者會(huì)產(chǎn)生一條1191bp的條帶，而在第I號(hào)內(nèi)含子倒位陽(yáng)性患者會(huì)產(chǎn)生一條1776bp的條帶,而該倒位的女性攜帶者可出現(xiàn)1191bp和1776bp兩條條帶。
[0022]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明采用長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增技術(shù)(Long-distance PCR,
0)-?00對(duì)？珊基因Intlh-1以及Intlh-`2區(qū)域進(jìn)行多重LD-PCR，可保障引物與模板雜交發(fā)生在最互補(bǔ)的目的擴(kuò)增片段之間，因此大大提高了特異性目的擴(kuò)增片段的擴(kuò)增效率；由于采用的單管多重LD-PCR技術(shù)，因此可以實(shí)現(xiàn)單管即可檢測(cè)野生型、攜帶型、倒位型，從而節(jié)省了人力、物力以及時(shí)間成本，操作起來(lái)也更簡(jiǎn)潔方便。
[0023]
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是F VDI基因第I號(hào)內(nèi)含子倒位發(fā)生機(jī)制及其引物示意圖。
[0025]圖2是臨床樣本第I管和第II管引物擴(kuò)增樣本的PCR電泳結(jié)果。
[0026]
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:比如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠(chǎng)商所建議的步驟和條件。
[0028]實(shí)施例1
用于體外診斷甲型血友病凝血因子VDI基因的第一內(nèi)含子的試劑盒，包括:dNTP、2*PCR緩沖液、MgCl2、Taq酶；按一定比例混合的多重引物A液和B液；使用說(shuō)明書(shū)。[0029]其中，MgCl2反應(yīng)終濃度為1.0mM, dNTP反應(yīng)終濃度為3.0mM。
[0030]A 液(I 管)包括:擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-1 區(qū)域的引物 9F (SEQ ID N0.l)q9R (SEQID N0.2)、Intlh-2F (SEQ ID N0.3);其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ；
B 液(II管)包括:擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-2 區(qū)域的引物 9F(SEQ ID N0.l)、Intlh_2F(SEQID N0.3)、Intlh-2R (SEQ ID N0.4);其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA。
[0031]I管預(yù)混液中引物的終濃度:9F為2 μ M、9R為2 μ M、Intlh_2F為2 μ Μ。
[0032]II管預(yù)混液中引物的終濃度:9F為2 μ M、Intlh_2R為2 μ M、Intlh_2F為2 μ Μ。
[0033]陰性對(duì)照:正常男性血液樣本DNA抽提產(chǎn)物。
[0034]陽(yáng)性對(duì)照:甲型血友病凝血因子VDI基 因的第一內(nèi)含子倒位患者的血液樣本DNA抽提產(chǎn)物。
[0035]實(shí)施例2:試劑盒的使用方法
I)樣本DNA抽提(根據(jù)天根血液/細(xì)胞/組織基因DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)):抽提人血液標(biāo)本DNA，樣本抽提方法如下。
[0036]1.1抽取300uL血液加入900uL紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。1000Orpm離心I分鐘(若離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速不允許,可3000rpm離心5min),吸去上清，留下白細(xì)胞沉淀，加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。加入20 μ I蛋白酶K溶液，混勻。
[0037]1.2加入200 μ I緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，
簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0038]1.3加人200 μ I無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)
短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0039]1.4將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000 rpm (13，400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0040]1.5向吸附柱CB3中加入500 μ I緩沖液⑶(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12，000 rpm (13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0041]1.6向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW (使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12，000 rpm (13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0042]1.7 向吸附柱 CB3 中加入 500 μ I 漂洗液 PW，12，000 rpm (13, 400 Xg)離心 30秒，倒掉廢液。
[0043]1.8將吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm(13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0044]1.9將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μ I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，000 rpm (13，400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0045]2)實(shí)驗(yàn)過(guò)程
2.1引物混合液配制
I管預(yù)混液中引物的終濃度:9F為2 μ M、9R為2 μ M、Intlh_2F為2 μ Μ。
[0046]II管預(yù)混液中引物的終濃度:9F為2 μ M、Intlh_2R為2 μ M、Intlh_2F為2 μ Μ。
[0047]配置好的引物混合液放置4°C待用，若長(zhǎng)期不使用請(qǐng)置于_20°C，如有可能分裝成小包裝。
[0048]2.2按樣品數(shù)η =待測(cè)樣本數(shù)+陰性對(duì)照I個(gè)+空白對(duì)照I個(gè)；取預(yù)混PCR反應(yīng)液，每管23 μ I分裝于反應(yīng)管中。
[0049]2.3將上述處理好的待測(cè)樣本和陰性、陽(yáng)性對(duì)照各取2μ I分別加入反應(yīng)管中，混勻，低速離心數(shù)秒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如表1和表2所示。
[0050]表1.1管預(yù)混液配置表
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)甲型血友病凝血因子VDI基因的第一內(nèi)含子倒位的引物，其特征在于，包括: (i )擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-1 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3，其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ； (ii )擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-2 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4，其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA。
2.如權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于，引物SEQID N0.K SEQ ID N0.2、SEQ IDN0.3使用濃度分別為2 μ Μ、2 μ M和2 μ M。
3.如權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于，引物SEQID N0.K SEQ ID N0.3、SEQ IDN0.4使用濃度分別為2 μ Μ、2 μ M和2 μ Μ。
4.檢測(cè)甲型血友病凝血因子珊基因的第一內(nèi)含子倒位的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (i ) PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑； (? )權(quán)利要求1所述引物序列。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括dNTPs、2*PCR緩沖液、Mg2+、Taq酶。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，Mg2+反應(yīng)終濃度為1.0mM ；dNTP反應(yīng)終濃度為3.0mM。
7.檢測(cè)甲型血友病凝血因子珊基因的第一內(nèi)含子倒位的方法，包括如下步驟: (i )采集待測(cè)血液樣本，提取DNA ； (? )以該DNA為模板，進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，其中所述PCR引物為擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-1 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 ;其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.2:GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA ； 擴(kuò)增 F VDI基因 Intlh-2 區(qū)域的引物 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 ;其堿基序列為:
SEQ ID N0.1:AGACTTTGGGGTTGTTGGGA
SEQ ID N0.3:GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
SEQ ID N0.4:TGGGTGATATAAGCTGAGCTA ； (iii)步驟(ii )中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析檢測(cè)結(jié)果。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(ii)的PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:94°C 2min 預(yù)變性；94°C 30s、64°C 30s,72°C 3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增分為兩管完成，第一管包含3條引物，分別為 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3 ;第二管包含 3 條引物，分別為 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，第一管中的引物SEQID N0.K SEQ IDN0.2,SEQ ID N0.3使用濃度分別為2μΜ、2μΜ和2μΜ;第二管中的引物SEQ ID N0.USEQID N0.3、SEQ ID N0.4 使用濃度分別`為 2 μ Μ、2 μ M 和 2 μ Μ。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103820539SQ201310455416
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】宋坤, 周曉犢, 王淑一, 孫翠蓮 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司