檢測(cè)pgrmc1的試劑在制備腎癌診斷試劑、試劑盒中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種腎癌診斷試劑、試劑盒及防治藥物。本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種腎癌診斷試劑。該診斷試劑含有可檢測(cè)孕酮受體膜組分1蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑。本發(fā)明腎癌診斷試劑可以在早期有效診斷腎癌疾病，大大提高了患者的生存率；本發(fā)明腎癌診斷試劑只需要少量腎癌組織即可進(jìn)行有效診斷，避免了給患者造成的傷害；有利于醫(yī)生選擇適合的藥物及方法對(duì)患者進(jìn)行針對(duì)性治療。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)PGRMC1的試劑在制備腎癌診斷試劑、試劑盒中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種腎癌診斷試劑、試劑盒及防治藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占所有惡性腫瘤的2_3%，約占腎臟腫瘤的90%，其發(fā)病率占泌尿系腫瘤的第二位。腎癌起源于腎小管上皮細(xì)胞，大約75%為腎透明細(xì)胞癌。近幾十年來(lái)腎癌的發(fā)病率和死亡率均有增高的趨勢(shì)，發(fā)病率以每年2%的速度增長(zhǎng)。由于缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，阻礙了對(duì)腎癌的及時(shí)診斷，50%腎癌患者在確診時(shí)已為晚期，約四分之一的腎癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。
[0003]目前腎癌的治療仍以根治性手術(shù)為主，但因腎癌具有放化療抵抗性，術(shù)后約有20-40%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)。因此，腎癌的早期篩查與早期診斷對(duì)于腎癌的防治非常重要，并且發(fā)展有效監(jiān)控腎癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移試劑、試劑盒以及研發(fā)新的腎癌靶向治療藥物是急需解決的重要課題和國(guó)民健康的重大需求。
[0004]PGRMCI,即孕酮受體膜組分I (PGRMCl)是一個(gè)28kD，由195個(gè)氨基酸組成的蛋白(SEQ ID N0.1:MAAEDVVATG ADPSDLESGG LLHEIFTSPL NLLLLGLCIF LLYKIVRGDQ PAASGDSDDDEPPPLPRLKR RDFTPAELRR FDGVQDPRIL MAINGKVFDV TKGRKFYGPE GPYGVFAGRD ASRGLATFCLDKEALKDEYD DLSDLTAAQQ ETLSDffESQF TFKYHHVGKL LKEGEEPTVY SDEEEPKDES ARKND，http://www.uniprot.0rg/uniprot/000264),屬于膜相關(guān)孕酮受體蛋白家族,近來(lái)研究顯示PGRMCl蛋白在癌癥中發(fā)揮重要作用【1，2】。PGRMCl蛋白通常在乳腺，結(jié)腸和甲狀腺腫瘤組織及結(jié)腸，甲狀腺，卵巢，肺和宮頸癌起源的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)【3，4】。微陣列分析已經(jīng)檢測(cè)到PGRMCl蛋白在結(jié)腸、肺、卵巢和乳腺腫瘤中的表達(dá)【5-7】。蛋白質(zhì)組學(xué)的分析表明乳腺癌中PGRMCl蛋白增加，PGRMCl蛋白是雌激素受體的新的分子標(biāo)志物【8，9】。此外，PGRMCl蛋白還調(diào)節(jié)癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性【10】。到目前為止，未見(jiàn)PGRMCl和腎癌關(guān)系的報(bào)道。未見(jiàn)通過(guò)檢測(cè)PGRMCl表達(dá)水平及磷酸化水平來(lái)實(shí)現(xiàn)腎癌的診斷試劑及試劑盒的相關(guān)報(bào)道，也未見(jiàn)通過(guò)降低其表達(dá)水平或抑制其磷酸化水平來(lái)達(dá)到治療腎癌的目的的報(bào)道。
[0005]本領(lǐng)域目前需要提供新的腎癌的診斷尤其是早期診斷、藥物療效監(jiān)測(cè)的檢測(cè)產(chǎn)品以及防治藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種腎癌診斷試劑。該診斷試劑含有可檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑。
[0007]其中，上述的檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑包括孕酮受體膜組分I的多克隆抗體或單克隆抗體。
[0008]其中，上述的檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑包括能特異擴(kuò)增孕酮受體膜組分I基因HiRNA的PCR引物。[0009]本發(fā)明解決的第二個(gè)問(wèn)題是提供了 一種腎癌檢測(cè)試劑盒或生物芯片。該腎癌檢測(cè)試劑盒或生物芯片含有上述的腎癌診斷試劑。
[0010]同時(shí)也提供了上述檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑在制備腎癌診斷試劑中的用途。進(jìn)一步也提供了上述檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑在制備腎癌檢測(cè)試劑盒或生物芯片
[0011]本發(fā)明解決的第三個(gè)問(wèn)題是提供了一種治療腎癌的藥物。該治療腎癌的藥物為能減少改變?cè)型荏w膜組分I的蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平或其編碼基因轉(zhuǎn)錄的HiRNA含量的藥物。
[0012]其中，上述的藥物為孕酮受體膜組分I的shRNA分子或能表達(dá)可檢測(cè)孕酮受體膜組分I的shRNA分子的表達(dá)載體。
[0013]其中，上述的藥物為孕酮受體膜組分I的拮抗劑或多克隆抗體或單克隆抗體。
[0014]本發(fā)明還提供了篩選上述的藥物的方法。該方法包括以下步驟:
[0015]a、建立腎癌的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型的模型組，并設(shè)立正常對(duì)照組；
[0016]b、用待篩選藥物按劑量梯度作用于模型組，然后檢測(cè)其中可檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白的蛋白表達(dá)水平或其基因的mRNA含量；
[0017]C、將檢測(cè)結(jié)果與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，能使模型組中可檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白的蛋白表達(dá)水平或其基因的mRNA含量顯著趨近正常對(duì)照組的待篩選藥物即被篩中。
[0018]本發(fā)明創(chuàng)新之處及有益效果在于:本發(fā)明腎癌診斷試劑可以在早期有效診斷腎癌疾病，大大提高了患者的生存率；本發(fā)明腎癌診斷試劑只需要少量腎癌組織即可進(jìn)行有效診斷，避免了給患者造成的傷害；有利于醫(yī)生選擇適合的藥物及方法對(duì)患者進(jìn)行針對(duì)性治療。本發(fā)明防治腎癌疾病的藥物，為臨床腎癌疾病用藥提供了一種新的選擇。本發(fā)明篩選防治腎癌疾病的藥物的方法，為尋找防治腎癌疾病的藥物提供了 一種新的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1、質(zhì)譜鑒定結(jié)果。通過(guò)基于Leu-d3的定量蛋白質(zhì)組鑒定，腎癌組織中PGRMCl的表達(dá)比癌旁正常腎組織上調(diào)3.91倍。其中:圖1A為癌旁正常腎組織和HEK293細(xì)胞混合樣品中PGRMCl的一段肽段指紋圖譜，包括一對(duì)序列為“⑶QPAAS⑶SDDDEPPPLPR，SEQ IDN0.2”的代表性同位素標(biāo)記肽段(m/zl019.99/1018.49，2+)，用其來(lái)定量癌旁正常腎組織和HEK293細(xì)胞中PGRMCl的相對(duì)表達(dá)量。圖1B為腎癌組織和HEK293細(xì)胞混合樣品中PGRMCl的一段肽段指紋圖譜。用一對(duì)序列為“⑶QPAAS⑶SDDDEPPPLPR，”的代表性同位素標(biāo)記肽段(m/zl019.99/1018.49，2+)來(lái)定量癌旁正常腎組織和HEK293細(xì)胞中PGRMCl的相對(duì)表達(dá)量。圖1C為肽段⑶QPAAS⑶SDDDEPPPLPR (m/zl018.49)的串級(jí)質(zhì)譜圖。
[0020]圖2、PGRMC1在腎癌組織與癌旁正常腎組織的表達(dá)。結(jié)果表明腎癌組織中PGRMCl的表達(dá)比癌旁正常腎組織高得多。
[0021]圖3、PGRMCl在腎癌組織(A-E)與癌旁正常腎組織(F-J)中的表達(dá)，腎癌組織中PGRMCl的表達(dá)高于癌旁正常腎組織。(A)-(D)分別代表腎癌組織中PGRMCl陰性表達(dá)、弱陽(yáng)性表達(dá)、中度陽(yáng)性表達(dá)和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的染色程度。(F)-(I)分別代表癌旁正常腎組織中PGRMCl陰性表達(dá)、弱陽(yáng)性表達(dá)、中度陽(yáng)性表達(dá)和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的染色程度。(E)和(J)分別代表了腎癌組織和癌旁腎正常組織中檢測(cè)到的PGRMCl的磷酸化水平。圖中橫線代表IOOym(原始放大400倍)。
[0022]圖4.通過(guò)Western blot在三對(duì)腎癌組織和癌旁正常腎組織中鑒定到PGRMCl蛋白的磷酸化位點(diǎn)Thr74。腎癌組織中PGRMCl的磷酸化水平高于癌旁正常腎組織。
[0023]圖5.不同濃度索拉菲尼處理腎癌0S-RC-2細(xì)胞24h后PGRMCl蛋白的Thr74位磷酸化水平變化。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明的建立是基于對(duì)腎癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白的研究，通過(guò)對(duì)45例病人的研究，分析鑒定出腎癌相關(guān)蛋白孕酮受體膜組分I。
[0025]本發(fā)明還進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究孕酮受體膜組分I蛋白在腎癌組織中的表達(dá)，功能研究提示與腎癌密切相關(guān)的孕酮受體膜組分I蛋白能應(yīng)用于臨床診斷、預(yù)后判斷及藥物開(kāi)發(fā)中。
[0026]在上述大量的開(kāi)創(chuàng)性研究的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員就容易可將上述孕酮受體膜組分I蛋白或其基因的mRNA作為檢測(cè)目標(biāo)的腎癌診斷試劑及試劑盒；同時(shí)可以上述孕酮受體膜組分I蛋白或其基因的mRNA作為靶標(biāo)的篩選治療腎癌藥物的方法；還發(fā)明了能防治腎癌的藥物，比如:能拮抗孕酮受體膜組分I蛋白的分子，比如其單克隆抗體或者多克隆抗體，如PGRMCl多克隆抗體(ab48012);以及得到防治效果好的shRNA分子和能表達(dá)孕酮受體膜組分I的shRNA分子的質(zhì)粒。
[0027]實(shí)施例一、使用本發(fā)明檢測(cè)腎癌
[0028]1.細(xì)胞和組織樣本來(lái)源
[0029]人胚腎細(xì)胞系HEK293(HEK293):源自ATCC，本實(shí)驗(yàn)室保存；人腎癌細(xì)胞株0S-RC-2，源自ATCC，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；
[0030]45例腎癌組織及45例腎癌旁正常腎組織，均由四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科提供，樣本提供者手術(shù)后簽署知情同意書(shū)，每例組織均通過(guò)病理活檢。
[0031]2.試劑來(lái)源
[0032]細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM:購(gòu)自Gibco BRL ;Leu_d3:購(gòu)自英國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；透析血清購(gòu)自Gibco ;含Leu-d3標(biāo)記的DMEM:自配;胎牛血清(FBS)、消化液胰酶(Trypsin)購(gòu)自Gibco BRL0
[0033]質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶Trypsin Gold:購(gòu)自Promega ;乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA):均為色譜純級(jí)，購(gòu)自Fisher Scientific ；NH4HC03:色譜純,購(gòu)自Merck ; α -氰基-4-輕基肉桂酸(CHCA):購(gòu)自Sigma;蛋白酶抑制劑-Cocktail:購(gòu)自Sigma。
[0034]PGRMCl 多克隆抗體(ab48012):購(gòu)自 Abeam ;Phospho-Threonine_Proline 抗體(#9391):購(gòu)自Cell signalingtechnology ;小鼠抗人β-actin抗體:購(gòu)自博士德生物科技公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、兔抗羊IgG、羊抗兔IgG均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。
[0035]即用型免疫組化超敏S-P (鼠/兔)試劑盒(KIT-9710)購(gòu)自北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所。DAB顯色試劑盒(AR1022)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。
[0036]3.方法[0037]3.1細(xì)胞的穩(wěn)定同位素(Leu-d3)標(biāo)記
[0038]HEK293細(xì)胞在含Leu_d3和10%透析胎牛血清(D-FBS)的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每隔3天換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)到90%左右傳代。每代細(xì)胞留1/3繼續(xù)培養(yǎng)，收集其余細(xì)胞并用冰冷的PBS洗3次放_(tái)80°C備用。培養(yǎng)6-8代后，提取各代細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后切取每代細(xì)胞蛋白的β-actin條帶。酶解、提肽后，MALD1-T0FMS檢測(cè)每代同位素整合情況，直至完全標(biāo)記為止。待細(xì)胞完全標(biāo)記后保種。
[0039]3.2蛋白樣品的制備、分離及酶解
[0040]將收集好的細(xì)胞或研成粉末狀的腎組織樣品，一般一瓶(面積80cm培養(yǎng)瓶)細(xì)胞用500 μ L的RIPA裂解液裂解，組織樣品按5mg/mL (即5mg組織用ImL RIPA裂解液裂解)的濃度加入RIPA裂解液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑cocktail (RIPA/cocktai 1=50/1 (V/V)，即按體積比500yL RIPA中加入IOyL cocktail)，吹打混勻。冰上放置30_40min后，利用超聲波裂解:使用探針型超聲冰上進(jìn)行適當(dāng)頻率的短促?zèng)_擊，共5-8次，每次5-lOsec，中間間隔10-20sec。裂解混合物于4°C，15000r/min離心(細(xì)胞裂解混合物離心30min，組織裂解混合物離心60min)。吸取上清于新的Ep管,用Protein Assay Kit測(cè)定蛋白濃度。-80°C保存?zhèn)溆没蛄⒓从糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。
[0041]3.2SDS-PAGE 電泳與染色
[0042]蛋白樣品準(zhǔn)備:根據(jù)測(cè)定濃度(測(cè)定蛋白濃度一般為6_12mg/mL)，將標(biāo)記的細(xì)胞蛋白分別與兩種狀態(tài)的組織蛋白等量混合，
[0043]上樣電泳:在樣品中加入等體積2\505上樣緩沖液，沸水煮5-1011^11，12000g離心5min，保留上清。起始電壓80V，直到溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠，調(diào)整電壓為120V，至指示劑到達(dá)底部邊緣，停止電泳，取出凝膠切角做記號(hào)?？捡R斯亮藍(lán)G-250振搖染色過(guò)夜，脫色液脫色至背景完全去除。對(duì)凝膠掃描成像，儲(chǔ)存。
[0044]3.4酶解，提肽，質(zhì)譜鑒定與分析
[0045]切膠前用Mill1-Q水洗膠2-3次，以除去殘留的乙酸和乙醇。用塑料切膠片將膠切成Imm3大小的膠粒，盛于0.6mL EP管中。加入IOOul (對(duì)于小膠的一條帶)50%乙腈(Acetonitrile, ACN)/50%50mM NH4HCO3溶液，鏇潤(rùn)混合儀上混旋10_30min,去掉上清，重復(fù)1-2次，直到完全脫色。加100 μ L ACN混勻膠粒，室溫下放置5-10min，可見(jiàn)膠粒變白，吸去ACN ;重復(fù)1-2次，在37 °C放置10-20min，讓殘留ACN揮發(fā)盡。每管加12.5ng/μ U夷酶將膠粒沒(méi)過(guò)。37°C，酶解過(guò)夜。將酶解液轉(zhuǎn)移到新的0.6mL EP管中，膠粒中加入50-80 μ L50%ACN/5%TFA,超聲 10-15 分鐘，離心，上清合并；再加入 20-50 μ L50%ACN/5%TFA,重復(fù)1-2次，上清合并。封上parafilm膜，扎孔，-80°C冷凍上清，凍干，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
[0046]3.5免疫組化檢測(cè)PGRMCl蛋白的表達(dá)及磷酸化水平
[0047]3.5.1組織處理及切片
[0048](I)取人腎癌和癌旁組織，切成小塊，厚度不超過(guò)5mm，做好標(biāo)記，用10%中性福爾馬林固定24h以上，自來(lái)水沖洗過(guò)夜；
[0049](2)過(guò)梯度酒精:75%酒精，I次，Ih — 85%酒精，I次，Ih — 95%酒精，I次，Ih — 100% 酒精，2 次，每次 30min ；
[0050](3) 二甲苯，2 次，每次 30min ;
[0051](4)石蠟浸泡， 3次，每次30min ；[0052](5)用石蠟包埋組織；
[0053](6)切片:厚度為3~5 μ m。
[0054]3.5.2免疫組化染色[0055](I)石蠟切片脫蠟至水:將石蠟切片置于60°C中加熱2h，迅速置于二甲苯I脫蠟lOmin，再置于二甲苯II脫蠟lOmin，分別用100%、95%、80%、70%酒精處理各2min，蒸餾水洗漆2次(置于搖床)，每次5min。
[0056](2)過(guò)氧化氫(Maixin-Bio，KIT_9710a)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:3%H202，室溫避光處理IOmin,再用蒸懼水洗2次,每次5min。
[0057](3)抗原修復(fù):將切片置于抗原修復(fù)液(IOmM檸檬酸鈉緩沖液，pH6.0)中，煮沸后高壓加熱5min，自然冷卻至室溫，PBS洗片2次，每次5min。
[0058](4)正常血清封閉:取出切片，用濾紙吸去切片背面水分及切片正面組織周圍水分(保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài))，滴加正常血清(與第二抗體同源動(dòng)物血清)(Maixin-Bio, KIT_9710b)，37°C孵育 15min, PBS 洗 2 次，每次 5min。
[0059](5) 一抗孵育:用濾紙吸多余血清，直接滴加羊抗人PGRMCl多克隆抗體或Phospho-Threonine-Proline 抗體(1: 200), 4°C過(guò)夜孵育，PBS 洗 2 次，每次 5min。
[0060](6) 二抗孵育:滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(Maixin-Bio，KIT-9710C)，37°C孵育40min, PBS 洗 2 次，每次 5min。
[0061](7)三抗孵育:滴加酶標(biāo)鏈親和素復(fù)合物(Maixin-Bio，KIT-97IOd) 37 °C孵育40min, PBS 洗 2 次，每次 5min。
[0062]⑶DAB顯色:濾紙吸去切片周圍液體，滴加新鮮配制DAB工作液(顯色劑A:顯色劑B:顯色劑Cl:1:1混合后稀釋20倍)顯色，鏡下觀察，適時(shí)用自來(lái)水終止顯色。
[0063](9)蘇木素復(fù)染:室溫30sec,自來(lái)水沖洗返藍(lán)15min。
[0064](10)梯度酒精脫水:80%酒精，2min — 95%酒精，2min — 100%酒精，2次，每次5min。
[0065](11)用中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察
[0066]4.結(jié)果及分析
[0067]質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖1。通過(guò)基于Leu-d3的定量蛋白質(zhì)組鑒定，腎癌組織中PGRMCl的表達(dá)比癌旁正常腎組織上調(diào)3.91倍。
[0068]為進(jìn)一步驗(yàn)證以Leu-Cl3為內(nèi)標(biāo)定量組織蛋白組學(xué)方法適用于新鑒定差異蛋白的定量比較，我們對(duì)PGRMCl做了 Western Blot和免疫組化分析。Western Blot (圖2)和免疫組化(圖3)結(jié)果顯示，以保守蛋白β-actin為對(duì)照，與癌旁正常腎組織相比，PGRMCl在腎癌組織中表達(dá)高得多。
[0069]已有文獻(xiàn)報(bào)道PGRMCl蛋白的磷酸化位點(diǎn)有Ser-57，Ser-181，Tyr-139，Tyr-180，Thr-74【11，12】。我們應(yīng)用LC-ES1-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)，首次在腎癌中鑒定到了 PGRMCl蛋白的磷酸化位點(diǎn)Thr-74 (圖4)。通過(guò)Western blot在三對(duì)腎癌組織和癌旁正常腎組織中鑒定到PGRMCl蛋白的磷酸化位點(diǎn)Thr-74。腎癌組織中PGRMCl的磷酸化水平高于癌旁正常腎組織。
[0070]在上述定量蛋白組學(xué)分析鑒定腎癌組織中PGRMCl蛋白的基礎(chǔ)上，首次系統(tǒng)分析了腎癌中PGRMCl蛋白的相對(duì)表達(dá)水平與腎癌臨床分級(jí)的關(guān)系，PGRMCl蛋白磷酸化參與的信號(hào)通路及生物學(xué)功能，這些研究結(jié)果至今未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)PGRMCl蛋白的表達(dá)水平與腎癌發(fā)展具有臨床相關(guān)性(見(jiàn)表1)，PGRMCl蛋白在大部分腎癌中明顯上調(diào)(p〈0.01)。在45例腎細(xì)胞癌中，I例(2.2%)樣本中PGRMCl陰性表達(dá)，44例(97.8%)陽(yáng)性表達(dá)，其中20例(44.4%)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；而在癌旁腎組織中，3例(6.7%)為陰性表達(dá)，42例(93.3%)為陽(yáng)性表達(dá)，其中7例(15.6%)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
[0071]表1.腎癌和癌旁組織中PGRMCl表達(dá)
【權(quán)利要求】
1.一種腎癌診斷試劑，含有可檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的診斷試劑，其特征在于:所述的檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑包括孕酮受體膜組分I的多克隆抗體或單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的診斷試劑，其特征在于:所述的檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑包括能特異擴(kuò)增孕酮受體膜組分I基因HiRNA的PCR引物。
4.一種腎癌檢測(cè)試劑盒或生物芯片，含有權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的診斷試劑。
5.一種治療腎癌的藥物，其特征在于:所述的藥物能減少改變?cè)型荏w膜組分I的蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平或其編碼基因轉(zhuǎn)錄的mRNA含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于:所述的藥物為所述的孕酮受體膜組分I的shRNA分子或能表達(dá)可檢測(cè)孕酮受體膜組分I的shRNA分子的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于:所述的藥物為孕酮受體膜組分I的拮抗劑或多克隆抗體或單克隆抗體。
8.檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白表達(dá)水平和/或磷酸化水平的試劑在制備腎癌診斷試劑中的用途。
9.一種篩選權(quán)利要求6?9任一項(xiàng)所述的藥物的方法，其特征在于包括以下步驟: a、建立腎癌的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型的模型組，并設(shè)立正常對(duì)照組； b、用待篩選藥物按劑量梯度作用于模型組，然后檢測(cè)其中可檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白的蛋白表達(dá)水平或其基因的mRNA含量； C、將檢測(cè)結(jié)果與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，能使模型組中可檢測(cè)孕酮受體膜組分I蛋白的蛋白表達(dá)水平或其基因的mRNA含量顯著趨近正常對(duì)照組的待篩選藥物即被篩中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103543266SQ201310460771
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】梁淑芳, 陳冰, 楊寒朔 申請(qǐng)人:四川大學(xué)