一種豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測方法，包括以下步驟：1）首先設(shè)計(jì)并合成特異性引物；2）從細(xì)胞提取病毒DNA模板；3）目的片段的獲得：分別配制LAMP和PCR反應(yīng)體系，按照LAMP和PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)得到目的片段；4）定性LAMP和PCR檢測。本發(fā)明的檢測方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，并且檢測的檢測極限極低，靈敏度高，可準(zhǔn)確定性檢測出豬圓環(huán)病毒2型，達(dá)到預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒2型流行的作用。
【專利說明】—種豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。
【背景技術(shù)】 [0002]目前，常用于病毒檢測的方法有酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)、定性PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。ELISA靈敏度較高，但檢測結(jié)果可能包括假陽性。定性PCR技術(shù)成本低、易于操作，但靈敏度比較低，且由于其擴(kuò)增產(chǎn)物需通過凝膠電泳分析一次，極易產(chǎn)生污染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)雖有高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)，但該實(shí)驗(yàn)對檢測人員要求較高且需要昂貴的Real-time PCR系統(tǒng)設(shè)備。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡單、快速、靈敏度高、特性性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(65°C左右)保溫約60min,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶。還可通過設(shè)計(jì)兩條環(huán)引物可使反應(yīng)速度提升 1/2-1/3。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有如下幾種檢測方法:
[0005]I)擴(kuò)增得出的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來檢驗(yàn)分析，擴(kuò)增出的LAMP特征性條帶，分析是否含有所需的片段。
[0006]2)擴(kuò)增結(jié)果可直接對擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀透過肉眼進(jìn)行判斷或者對其濁度進(jìn)行檢測。
[0007]3)擴(kuò)增結(jié)果可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR Green I染色。在紫外燈或日光下通過肉限進(jìn)行判定，如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之，則保持SYBR GreenI的橙色不變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法，通過Primer Explorer V3設(shè)計(jì)的三對特異性引物可以對特定片段在等溫條件下進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的擴(kuò)增，同時(shí)又保證了實(shí)驗(yàn)的特異性。
[0009]本發(fā)明首先通過DNAstar分析，在豬圓環(huán)病毒2型基因組內(nèi)尋找保守序列，在獲得的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，然后通過擴(kuò)增獲得大量的目的片段。對目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。擴(kuò)增結(jié)果也可直接對擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀透過肉眼進(jìn)行判斷或者對其濁度進(jìn)行檢測。
[0010]本發(fā)明所述豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法，包括如下步驟:
[0011]I)特異性引物的設(shè)計(jì)和合成
[0012]本發(fā)明首先設(shè)計(jì)并合成了六個(gè)特異性引物:正向內(nèi)部引物(FIP)、反向內(nèi)部引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向環(huán)形引物(LF)和反向環(huán)形引物(LB)，并由上海生物工程有限公司合成。
[0013]所述六個(gè)特異性引物的序列分別如SEQ ID NoUSEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ IDNo4、SEQ ID No5、SEQ ID No6 所示，具體如下:
[0014]FIP:5/ -CAGGAATACAATATCCGTGTAACCATTTTGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3'
[0015]BIP:5/ -GAGGCCTACGTGGTCTACATTTTTCAAACAACAAAAGAAATCAGCTATG-3'
[0016]F3:5/ -CACTTCGTAATGGTTTTTATTATTTA-3'
[0017]B3:5/ -TCCACTATTGATTACTTCCAAC-3'
[0018]LF: 5' -AACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATC-3'
[0019]LB: 5' -TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCAGC-3'
[0020]2)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取病毒DNA模板
[0021]按照Blood Viral DNA/RNA kit(B10MIGA Inc, San Diego, CA)的說明書來提取培養(yǎng)的細(xì)胞中的病毒DNA或RNA，分別提取豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒I型(PCV1)、豬細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)的DNA，再提取豬流行性腹瀉病毒(PED)、豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬輪狀病毒(RV)、豬藍(lán)耳病毒(PRRS)的RNA，提取的RNA經(jīng)ReverseTranscriptase M-MLV(RNase H-) (Takara Corp.，Japan)逆轉(zhuǎn)錄作用分別得到各自病毒的cDNA，將得到的DNA和cDNA保存在_70°C冰箱。
[0022] 3)目的片段獲得
[0023]配制LAMP 反應(yīng)體系:在 0.25ml eppendorf 管中加入 IOXThermopolReaction Buffer3.5 μ L,甜菜堿 1.5 μ L，六個(gè)特異性引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)各I μ L,基因組DNA5 μ L,去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ L ；LAMP反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min, 59°C 40min, 80°C IOmin0
[0024]配制PCR 反應(yīng)體系:在 0.25ml eppendorf 管中加入 10Xbuffer2.5 μ Μ,dNTPs0.75 μ Μ,正向外引物、反向外引物(F3、B3)各0.5 μ M，2.5U DNA聚合酶，模版DNAlyL，去離子水補(bǔ)加至總體積25yL;PCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min，95°C 30S，55°C 30S,72°C 30S, 72°C 5min, 35 個(gè)循環(huán)。
[0025]待LAMP和PCR反應(yīng)結(jié)束，0.25ml eppendorf管中就含有大量目的片段。
[0026]4 )定性LAMP和PCR檢測
[0027]分別進(jìn)行PCR和LAMP定性檢測，并對每組設(shè)置陽性對照和空白對照。
[0028]將上述LAMP和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出與PCV2相應(yīng)的約200bp大小的特異片段即為陽性，沒有擴(kuò)增出該特異性片段即為陰性。
[0029]本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。另外，本發(fā)明設(shè)計(jì)了不同的特異性引物，使實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測的定量極限和檢測極限極低，大大提高了 LAMP檢測方法的靈敏度。
[0030]本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法可以制備成試劑盒。使用該試劑盒，就能簡單地進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型的快速檢測和定量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明LAMP法檢測PCV2溫度條件優(yōu)化結(jié)果，M:DL2000 ;1_4泳道:反應(yīng)溫度55，57，59和61°C，所有產(chǎn)物都通過有Goldview染色的2%的瓊脂糖凝膠電泳分析；[0032]圖2為本發(fā)明PCV2的LAMP檢測的特異性，M，DL2000 ;泳道I，PCVl ;泳道2，PCVl ；泳道3，PPV ;泳道4，PRV ;泳道5，PEDV ;泳道6，TEGV ;泳道7，RV ;泳道8，PRRSV ;泳道9，PCV2 ；N,陰性對照，所有產(chǎn)物經(jīng)由Goldbiew染色的2%的瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0033]圖3為本發(fā)明PCV2的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物Hae III酶切特異性鑒定結(jié)果，M，DL500 ;泳道1，PCV2LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2，PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物Hae III酶切鑒定，所有產(chǎn)物經(jīng)由Goldbiew染色的2%的瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0034]圖4為本發(fā)明PCV2常規(guī)定性PCR檢測法靈敏度檢測結(jié)果，M，DL2000 ;N。陰性對照;泳道1-8，分別為梯度稀釋的PCV2DNA進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3,100，和10拷貝，所有產(chǎn)物經(jīng)由Goldbiew染色的2%的瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0035]圖5為本發(fā)明PCV2LAMP定性檢測法靈敏度檢測結(jié)果，M，DL2000 ；N,陰性對照；泳道1-8，分別為梯度稀釋的PCV2DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3,100，和10拷貝，所有產(chǎn)物經(jīng)由Goldbiew染色的2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0037]實(shí)驗(yàn)試劑和材料
[0038]豬圓環(huán)病毒2型PCV2、豬流行性腹瀉PED、豬細(xì)小病毒PPV、偽狂犬病毒PRV、豬傳染性胃腸炎TGE、豬輪狀病毒RV、豬藍(lán)耳病PRRS和豬圓環(huán)病毒I型PCVl均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供，Bst DNA聚合酶,大片段(New England Biolabs, Beverly, US),其余試劑均購于 TaKaRa Biotechnology C0., Ltd.。
[0039]Blood Viral DNA/RNA kit(B10MIGA Inc, San Diego, CA)，ABI PRISM3730GeneticAnalyzer 型測序儀(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp.), AppliedBioystem2720thermal cycler(Applied Biosystem.，US)。
[0040]實(shí)施例1
[0041]I)設(shè)計(jì)并合成特異性引物
[0042]用網(wǎng)上在線的LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Exploer V3設(shè)計(jì)PCV2的三對引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)，按照Primer Exploer V3Manual上面的步驟來對PCV2的全序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，首先上載PCV2全序列、引物設(shè)計(jì)、展示引物設(shè)計(jì)結(jié)果、選擇合適的引物，保存最適的引物信息，將保存的引物信息上載到Primer Exploer V3軟件中進(jìn)行設(shè)計(jì)環(huán)形引物(LF、LB)。在設(shè)計(jì)引物過程中要注意Tm值的設(shè)置、引物端頭的穩(wěn)定性、GC含量、二級結(jié)構(gòu)以及引物的長度。設(shè)計(jì)好的引物由上海生物工程有限公司合成。
[0043]2)目的片段的獲得
[0044]在豬圓環(huán)病毒2型檢測研究中，以基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增。LAMP反應(yīng)體系為 25 μ L: 10 X Thermopol Reaction Buffer3.5 μ L，甜菜堿 1.5 μ L，三對引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)各I μ L，基因組DNA5 μ L，去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ L ;所述LAMP反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min, 59°C 40min, 80°C IOmin0
[0045]PCR反應(yīng)體系為25yL:2XPCR Mixl2.5 μ L，正向外引物、反向外引物(F3、B3)各I μ L,基因組DNA2y L,去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min,94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin,72°C 10min，35 循環(huán)。[0046]擴(kuò)增出的LAMP特征性條帶，分析是否含有所需的片段。
[0047]3 )定性LAMP和PCR檢測
[0048]將上述LAMP和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，分析表明:擴(kuò)增出了與PCV2相應(yīng)的約200bp大小的特異片段即為陽性，沒有擴(kuò)增出該特異性片段即為陰性。
[0049]4) LAMP溫度優(yōu)化
[0050]為了使LAMP反應(yīng)達(dá)到最佳水平，對LAMP反應(yīng)進(jìn)行溫度優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)溫度，設(shè)置溫度梯度從55°C到60°C，59°C時(shí)條帶最亮、最清晰。最終確定最佳溫度為59°C (參見圖1)。
[0051]5)特異性檢測
[0052]以 IO5 拷貝 / 微升的 PCV2DNA，PED，TGE，RV, PRRS 的 cDNA 和 PCV2，PCVl, PPV，PRV的DNA為模板做特異性檢測，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)過程中非豬圓環(huán)病毒2型DNA模板的反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，沒有相應(yīng)條帶出現(xiàn)(參見圖2)，之后擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過HaeIII酶切鑒定(參見圖3)并由上海生物工程有限公司進(jìn)行測序鑒定，本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物具有很好的特異性。
[0053]6) LAMP 檢測限
[0054]以101。，IO9, IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1 拷貝 /微升的PCV2DNA 為模板做LAMP反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序同上。結(jié)果表明，建立的LAMP方法的定量極限為IO2拷貝/微升(參見圖4)，檢測極限為10拷貝/微升(參見圖5)。
[0055]7)臨床樣品檢測
[0056]從采集的血清樣品中隨機(jī)`抽取110個(gè)血清樣品作為臨床樣品，這些血清樣品直接用作為DNA模板來進(jìn)行LAMP反應(yīng)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，LAMP反應(yīng)耐受性很強(qiáng)，可以省掉提取DNA等繁瑣步驟，直接對病毒進(jìn)行檢測。經(jīng)LAMP反應(yīng)檢測，110個(gè)血清樣品中的95個(gè)血清樣品呈現(xiàn)PCV2陽性。
[0057]以建立的LAMP體系作臨床樣品檢測，結(jié)果顯示，86.3%的樣品為豬圓環(huán)病毒2型陽性，定性PCR檢測PCV2陽性檢出率微64%。因此LAMP體系PCV2陽性檢出率比定性PCR檢測的檢出率提高了 22%。
[0058]以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法簡單、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，并且檢測的定量極限和檢測極限極低，可準(zhǔn)確定量檢測出豬圓環(huán)病毒2型，起到預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒2型的流行。
[0059]最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
【權(quán)利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，包括如下步驟: 1)首先設(shè)計(jì)與合成六個(gè)特異性引物:正向內(nèi)部引物FIP、反向內(nèi)部引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)形引物L(fēng)F和反向環(huán)形引物和LB，其核苷酸序列分別如SEQ IDNol-SEQ ID No6所示，具體如下:
FIP:5/ -CAGGAATACAATATCCGTGTAACCATTTTGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3'
BIP:5/ -GAGGCCTACGTGGTCTACATTTTTCAAACAACAAAAGAAATCAGCTATG-3'
F3:5/ -CACTTCGTAATGGTTTTTATTATTTA-3'
B3:5/ -TCCACTATTGATTACTTCCAAC-3'
LF:5/ -AACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATC-3'
LB:5/ -TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCAGC-3' 2)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取病毒DNA模板； 3)目的片段的獲得:配制LAMP和PCR反應(yīng)體系，按照LAMP和PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)得到目的片段； 4)定性LAMP檢測和定性PCR檢測:將上述LAMP和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出與PCV2相應(yīng)的約200bp大小的特異片段即為陽性，沒有擴(kuò)增出該特異性片段即為陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，其特征在于，步驟3)中所述LAMP反應(yīng)體系為:所述LAMP反應(yīng)體系為:10XThermopol ReactionBuffer3.5μ L，六個(gè)特異性引物(FIP、BIP、F3、B3、LF、LB)各 I μ L，基因組 DNA5 μ L，去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ L ;所述LAMP反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min,59°C 40min,80°C IOmin0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，其特征在于，步驟3)中所述PCR反應(yīng)體系為:10Xbuffer2.5μΜ, dNTPs0.75 μ M，正向外引物F3、反向外引物B3各0.5 μ M，2.5U DNA聚合酶，模版DNAl μ L，去離子水補(bǔ)加至總體積25 μ L ;所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min,95°C 30S，55°C 30S，72°C 30S，72°C 5min，35 個(gè)循環(huán)。
4.權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法在制備環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法在快速、靈敏和定性檢測豬圓環(huán)病毒2型中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725795SQ201310461343
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】趙凱, 倪建平, 李春華, 施偉, 趙本進(jìn), 趙笑, 何錫忠, 任方方, 張春玲, 吳洋洋, 蔣鳳英, 胡瑞麗, 張俊平 申請人:上海佳牧生物制品有限公司, 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院