檢測(cè)h1n1豬流感病毒的rt-pcr引物及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒。所述引物為兩對(duì)：針對(duì)H1基因的引物和針對(duì)N1基因的引物，所述針對(duì)H1基因引物的上游引物ɑHu核苷酸序列為5’-GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列為5’-ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，針對(duì)N1基因引物的上游引物Nu核苷酸序列為5’-TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’，下游引物Nd核苷酸序列為5’-GACCAAGCGACTGACTCAA-3’，所述試劑盒包括所述的引物。采用本發(fā)明檢測(cè)H1N1豬流感病毒，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及檢測(cè)HlNl豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]HlNl 亞型豬流感病毒(Swine influenza virus, SIV)是豬流感(Swineinfluenza, SI)的重要病原之一，為正粘病毒科、A型流感病毒屬，由8個(gè)分節(jié)段的基因組構(gòu)成，共編碼10-11種蛋白。HINl亞型豬流感1918年美國(guó)最先報(bào)道，Shope于1930年第一次分離鑒定該亞型病毒，這也是首次確診豬流感病毒，此后不斷傳播，現(xiàn)已在五大洲都發(fā)現(xiàn)其蹤跡。該病毒可感染豬，引起豬發(fā)生急性、熱性呼吸器官傳染病，主要以突發(fā)的呼吸系統(tǒng)并轉(zhuǎn)歸迅速的綜合癥狀為特征，是豬呼吸道綜合征癥候群疾病之一。由于豬流感病毒對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞具有親嗜特性，可對(duì)其造成損傷，在臨床上豬群的發(fā)病率可高達(dá)100 %，病死率
如伴隨其他呼吸系統(tǒng)疾病的繼發(fā)、混合感染，會(huì)導(dǎo)致豬群的損傷程度和病死率會(huì)大幅度增高。目前，從豬體中分離到流感病毒有HlNl、H1N2、H3N2、H1N7、H4N6、H3N6、H5N1和H9N2等多個(gè)亞型的病毒，能引起豬流感癥狀并在當(dāng)今豬群中傳播主要有3個(gè)亞型，H1N1、H3N2和H1N2，而HlNl在豬流感病毒中占優(yōu)勢(shì)地位，近些年世界各地分離到的豬流感病毒亞型大部分都是HlNl。Sreta等研究發(fā)現(xiàn)HlNl致病力較其它豬流感病毒更強(qiáng)，感染斷奶乳豬仔豬的肺損傷度比H3N2的嚴(yán)重，極大危害豬群的健康。值得注意的是，已有報(bào)道美國(guó)于2005年12月至2009年2月出現(xiàn)的10例HlNl亞型和I例是H1N2豬流感病毒感染人病例，其中證實(shí)9例與豬有直接接觸史，2009年3月始發(fā)于墨西哥的21世紀(jì)甲型HlNl流感大流行，令此亞型流感病毒愈加受到高度的重視。
[0003]HlNl豬流感根據(jù)·病毒基因片段來(lái)源不同，可分為古典型HlNl豬流感、類(lèi)禽型HlNl豬流感和類(lèi)人型HlNl豬流感。三類(lèi)HlNl豬流感病毒在世界各地處于不同階段的流行情況各不相同。因此建立有效的診斷方法對(duì)防治HlNl亞型豬流感具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)HlNl豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒，具有較高的靈敏度和特異性，且檢測(cè)成本低，有良好的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0006]檢測(cè)HlNl豬流感病毒的RT-PCR引物，所述引物為兩對(duì):針對(duì)Hl基因的引物和針對(duì)NI基因的引物，所述針對(duì)Hl基因引物的上游引物aHu核苷酸序列為5’ -GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列為5’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，針對(duì)NI基因引物的上游引物Nu核苷酸序列為5’ -TCCAAGGGGGATGTGITTG-3’，下游引物 Nd 核苷酸序列為 5’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。
[0007]—種檢測(cè)HlNl豬流感病毒的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的引物。
[0008]以上所述檢測(cè)HlNl豬流感病毒的試劑盒，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
[0009]所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇；
[0010]所述RT 反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer 緩沖液、dNTPs、HIR、Uni 12 ；
[0011]所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、10 Xbuffer 緩沖液、dNTPs、MgCl2 和 cDNA ；
[0012]所述陰性對(duì)照包括:DEPC水；
[0013]所述陽(yáng)性對(duì)照包括:古典型HlNl豬流感病毒、類(lèi)禽型HlNl豬流感病毒和類(lèi)人型HlNl豬流感病毒。
[0014]所述古典型HlNl豬流感病毒可為古典型HlNl豬流感毒株，如:廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離保存的古典型HlNl豬流感毒株；所述類(lèi)禽型HlNl豬流感病毒可為類(lèi)禽型HlNl豬流感毒株，如:廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離保存的類(lèi)禽型HlNl豬流感毒株；所述類(lèi)人型HlNl豬流感病毒可為類(lèi)人型HlNl豬流感毒株，如:廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離保存的類(lèi)人型HlNl豬流感毒株。
[0015]本發(fā)明的具體原理是利用HlNl豬流感病毒的同源性，應(yīng)用0LIG6.0軟件，合成針對(duì)Hl基因和NI基因的兩對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增出特異性的目的帶。試驗(yàn)方法及過(guò)程如下:
[0016]1.引物設(shè)計(jì):
[0017]PCR反應(yīng)中有兩條引物，即Y端引物和:V引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)(常以信息鏈為基準(zhǔn))，5'端引物與位于待擴(kuò)增片段5'端上的一小段DNA序列相同；3'端引物與位于待擴(kuò)增片段3'端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物長(zhǎng)度一般為16-25bp左右，引物之間、引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列。通過(guò)對(duì)古典型HlNl豬流感病毒、類(lèi)禽型HlNl豬流感病毒和類(lèi)人型HlNl豬流感病毒的代表毒株基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的片段，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，通過(guò)匹配、篩選最優(yōu)引物組合如下:
[0018]Hl 基因上游引物 a Hu 序列:5’ -GGAATGGTAGATGGATGGT-3’ ；
[0019]下游引物Hd 序列:5 ’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3 ’。
[0020]NI 基因上游引物 Nu 序列:5’ -TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’ ；
[0021 ]下游引物 Nd 序列:5 ’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。
[0022]2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化:
[0023]將滅活的待檢樣品用Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲(chǔ)存于_20°C備用。
[0024]2.1引物用量的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下，將引物對(duì)的用量分別從
0.1yL至1.8μ L加入體系,通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較,確定最優(yōu)引物用量為0.4yL。
[0025]2.2氯化鎂濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較，確定氯化鎂的濃度為25mM最佳。
[0026]2.3反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)的優(yōu)化通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析，選擇200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0027]2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)的優(yōu)化通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析，選擇5U/ μ L酶作為
反應(yīng)體系最佳用量。
[0028]2.5dNTPs濃度的優(yōu)化通過(guò)使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄時(shí)選擇10mM，PCR擴(kuò)增時(shí)選擇2.5mM作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0029]2.6反轉(zhuǎn)錄引物根據(jù)《高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范》規(guī)定，禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)用引物為 Uni 12:5 ^ -AGCAAAAGCAGG-3'，引物濃度為 20pmo I。
[0030]利用上述引物和各成分的最終濃度，最后確定采用的RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，所需各組及相應(yīng)濃度見(jiàn)表1。
[0031 ] 表1檢測(cè)HlNl豬流感病毒反應(yīng)體系
[0032]
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)HlNl豬流感病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物為兩對(duì):針對(duì)Hl基因的引物和針對(duì)NI基因的引物，所述針對(duì)Hl基因引物的上游引物aHu核苷酸序列為5’ -GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列為5’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，針對(duì)NI基因引物的上游引物Nu核苷酸序列為5’ -TCCAAGGGGGATGTGITTG-3’，下游引物 Nd 核苷酸序列為 5’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。
2.一種檢測(cè)HlNl豬流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)HlNl豬流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)HlNl豬流感病毒的試劑盒，其特征在于: (1)所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇； (2)所述RT反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer緩沖液、dNTPs、HIR、Uni12 ； (3)所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、IOXbuffer 緩沖液、dNTPs,MgCl2 和 cDNA ； (4)所述陰性對(duì)照包括:DEPC水； (5)所述陽(yáng)性對(duì)照包括:古典型HlNl豬流感病毒、類(lèi)禽型HlNl豬流感病毒和類(lèi)人型HlNl豬流感病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測(cè)HlNl豬流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述古典型HlNl豬流感病毒為古典型HlNl豬流感毒株，所述類(lèi)禽型HlNl豬流感病毒為類(lèi)禽型HlNl豬流感毒株，所述類(lèi)人型HlNl豬流感病毒為類(lèi)人型HlNl豬流感毒株。
6.一種如權(quán)利要求4或5所述檢測(cè)HlNl豬流感病毒試劑盒的使用方法，包括以下步驟: (1)病毒RNA的提取: 取待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各500 μ L于1.5ml滅菌無(wú)RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液進(jìn)行裂解，充分振蕩，室溫放置10分鐘；加入300 μ L氯仿，搖勻放置10分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；緩慢取出上層液體600 μ L放置于新的EP管；加入等量異丙醇輕輕混勻，_20°C放置30分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，棄去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取Iml于管內(nèi)洗滌沉淀，充分吸棄洗滌；將EP管倒置于吸水紙上，盡量吸干液體，放置于37°C溫箱中15分鐘，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)水珠時(shí)取出；加入25 μ L DEPC水，_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)RT操作程序:
取 5Xbuffer 緩沖液 5 μ L、dNTPs 2 μ L、M_MLV 0.5 μ L,HIR 0.5 μ L,Uni 12 2 μ L, RNA`15 μ L，將上述液體置于同一 EP管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作:42 V 60 min,`95 °C 5 min ； (3)PCR操作程序: 上游引物 aHu、Nu 各 0.4 μ L、下游引物 HcU Nd 各 0.4 μ L，Taq DNA 酶 0.2 μ L、IOXbuffer 緩沖液 2.5 μ L、dNTPs 2 μ L、MgCl22 μ L、DEPC 水 11.7 μ L, cDNA 5 μ L，將上述液體置于同一 EP管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作，擴(kuò)增條件:94 V 30s, 56 V`30 s，72 °C 30 s，35 個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103571971SQ201310462250
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】馮淑萍, 顏健華, 熊毅, 梁丹潔, 李春英, 孫翔翔 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心