檢測(cè)豬Kobu病毒的RT-PCR引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對(duì)檢測(cè)豬Kobu病毒的RT-PCR引物及試劑盒，所述引物的上游引物核苷酸序列為5′-AACTCCAGCTTTCCCTCCT-3′，下游引物核苷酸序列為5′-TGGCCACCTGCAAAGTCA-3′，所述試劑盒包括所述的引物。采用本發(fā)明引物檢測(cè)豬Kobu病毒，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)豬Kobu病毒的RT-PCR引物及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一對(duì)檢測(cè)豬Kobu病毒的RT-PCR引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]KoBu病毒(KoBuvirus)屬于小核糖核酸病毒科成員，與口蹄疫為同科病毒,為無(wú)囊膜單鏈RNA病毒，基因組大小為8.2kb~8.3kb，包含編碼一個(gè)聚合蛋白的大的開放閱讀框(0RF)。聚合蛋白由3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP0、VP3、VP1)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A~2C、3A~3D)組成。目前已經(jīng)證實(shí)KoBu病毒至少分為3個(gè)種，包括人KoBu病毒(也稱Aichi病毒)、牛KoBu病毒和豬KoBu病毒。人KoBu病毒是在1991年由日本學(xué)者從腹瀉病人的糞便中分離出來(lái)，KoBu這個(gè)詞即來(lái)源于日語(yǔ)，意為“球形”或“突起”，人感染KoBu病毒后與急性胃腸炎具有相關(guān)性。牛KoBu病毒已在牛和羊群中檢測(cè)到，于2003年首次在健康牛群的血清和糞便羊品種被證實(shí)；豬KoBu病毒由匈牙利和中國(guó)學(xué)者率先報(bào)到，分離的病毒株分別被命名為S-1-HUN和swine/2007/CHN,這兩個(gè)毒株也被認(rèn)可為豬KoBu病毒的參考毒株。
[0003]豬KoBu病毒在亞洲國(guó)家已多次被發(fā)現(xiàn)、報(bào)道，如中國(guó)、泰國(guó)、日本、韓國(guó)等。2010年冬季至2011年春季全國(guó)各地豬場(chǎng)的豬群中先后發(fā)生嚴(yán)重的傳染性腹瀉疾病，應(yīng)用各種抗生素防治無(wú)效，其發(fā)病率與死亡率很高，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。由于豬KoBu病毒是新發(fā)現(xiàn)病毒，相關(guān)的研究比較匱乏。2010年10至2011年11月，來(lái)自全國(guó)12個(gè)省(自治區(qū))187份豬腹瀉病資料中，豬KoBu病毒檢出陽(yáng)性率為20.93%。雖然該病毒可能是導(dǎo)致豬腹瀉的致病因子之一，但未在發(fā)生腹瀉的豬糞便或血清中檢測(cè)到豬KoBu病毒的存在，說(shuō)明豬KoBu病毒可能是條件性常在病毒，或者可能參與了豬腹瀉的共同感染、協(xié)調(diào)作用等，因此，必須對(duì)其臨床表現(xiàn)、致病機(jī)理、遺傳演化等方面進(jìn)行深入研究，這將有助于我們對(duì)豬KoBu病毒的認(rèn)識(shí)和對(duì)今后可能出現(xiàn)的大范圍疫情起到防控作用。和所有的傳染性疾病一樣，確診豬Kobu病毒只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷，因此建立一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，并使其成為掌握豬KoBu病毒流行病學(xué)資料的一個(gè)重要 手段顯得尤其必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一對(duì)檢測(cè)豬Kobu病毒的RT-PCR引物及試劑盒，具有較高的靈敏度和特異性，且檢測(cè)成本低，有良好的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0006]一對(duì)檢測(cè)豬Kobu病毒的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列為5' -AACTCCAGCTTTCCCTCCT-3'，下游引物核苷酸序列為 5' -TGGCCACCTGCAAAGTCA-3'。
[0007]—種檢測(cè)豬Kobu病毒的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的引物。
[0008]以上所述檢測(cè)豬Kobu病毒的試劑盒，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、電泳檢測(cè)試劑、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
[0009]所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇；[0010]所述RT反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer緩沖液、dNTPs、HIR和下游引物K2 ；
[0011]所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、10 Xbuffer 緩沖液、dNTPs、MgCl2 和 cDNA ；
[0012]所述陰性對(duì)照包括:DEPC水；
[0013]所述陽(yáng)性對(duì)照包括:豬Kobu病毒。 [0014]所述豬Kobu病毒可為克隆有VPI基因的豬KoBu病毒陽(yáng)性質(zhì)粒，如廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的克隆有VPl基因的豬KoBu病毒陽(yáng)性質(zhì)粒(PMD18-T-K0BU-VP1)。
[0015]本發(fā)明的具體原理是利用豬KoBu病毒基因的同源性，應(yīng)用0LIG6.0軟件，合成一對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增出特異性的目的帶。試驗(yàn)方法及過(guò)程如下:
[0016]1.引物設(shè)計(jì):
[0017]PCR反應(yīng)中有兩條引物，即Y端引物和:V引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)(常以信息鏈為基準(zhǔn))，5'端引物與位于待擴(kuò)增片段5'端上的一小段DNA序列相同；3'端引物與位于待擴(kuò)增片段3'端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物長(zhǎng)度一般為16-25bp左右，引物之間、引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列。通過(guò)對(duì)口蹄疫A型基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的片段，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，通過(guò)匹配、篩選最優(yōu)引物組合如下:
[0018]上游引物Kl 序列:5' -AACTCCAGCTTTCCCTCCT-3'；
[0019]下游引物K2 序列:5' -TGGCCACCTGCAAAGTCA-3'。
[0020]2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化:
[0021]將滅活的待檢樣品用Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲(chǔ)存于_20°C備用。
[0022]2.1引物用量的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下，將引物對(duì)的用量分別從0.1 μ L至1.8μ L加入體系,通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較,確定最優(yōu)引物用量為0.5μ L。
[0023]2.2氯化鎂濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較，確定氯化鎂的濃度為25mM最佳。
[0024]2.3反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)的優(yōu)化通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析，選擇200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0025]2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)的優(yōu)化通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析，選擇5U/ μ L酶作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0026]2.5dNTPs濃度的優(yōu)化通過(guò)使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄時(shí)選擇IOmM, PCR擴(kuò)增時(shí)選擇2.5mM作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0027]利用上述引物和各成分的最終濃度，最后確定采用的RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，所需各組及相應(yīng)濃度見(jiàn)表1。
[0028]表1檢測(cè)豬KoBu病毒RT-PCR反應(yīng)體系
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)檢測(cè)豬Kobu病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列為V -AACTCCAGCTTTCCCTCCT-3 '，下游引物核苷酸序列為V -TGGCCACCTGCAAAGTCA-3'。
2.一種檢測(cè)豬Kobu病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)豬Kobu病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)豬Kobu病毒的試劑盒，其特征在于: (1)所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇； (2)所述RT反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer緩沖液、(1見(jiàn)？8、!111?和下游引物1(2； (3)所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、IOXbuffer 緩沖液、dNTPs,MgCl2 和 cDNA ； (4)所述陰性對(duì)照包括:DEPC水； (5)所述陽(yáng)性對(duì)照包括:豬Kobu病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測(cè)豬Kobu病毒的試劑盒，其特征在于，所述豬Kobu病毒為:克隆有VPl基因的豬KoBu病毒陽(yáng)性質(zhì)粒。
6.一種如權(quán)利要求4或5所述檢測(cè)豬Kobu病毒試劑盒的使用方法，包括以下步驟: (1)病毒RNA的提取: 取待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各500μ L于1.5ml滅菌無(wú)RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液進(jìn)行裂解，充分振蕩，室溫放置10分鐘；加入300 μ L氯仿，搖勻放置.10分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；緩慢取出上層液體600 μ L放置于新的EP管；加入等量異丙醇輕輕混勻，_20°C放置30分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，棄去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取Iml于管內(nèi)洗滌沉淀，充分吸棄洗滌；將EP管倒置于吸水紙上，盡量吸干液體，放置于37°C溫箱中15分鐘，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)水珠時(shí)取出；加入25 μ L DEPC水，_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)RT操作程序: 取 5Xbuffer 緩沖液 5μ L、dNTPs 2 μ L, M-MLV 0.5 μ L、HIR 0.5 μ L、下游引物 K2.2μ L,RNA 15 μ L,將上述液體置于同一EP管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作:42 V.60 min,95 V 5 min ； (3)PCR操作程序: 上游引物Kl 0.5yL、下游引物K2 0.5μ L, Taq DNA酶0.2 μ LUOXbuffer緩沖液.2.5 μ L、dNTPs 2 μ L、MgCl22 μ L、DEPC 水 12.3 μ L, cDNA 5 μ L，將上述液體置于同一 EP 管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作，擴(kuò)增條件:94 V 30s, 57 V 30 s，72 V 30 s，35個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103571973SQ201310462276
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】熊毅, 伍和明, 韋達(dá)有, 梁丹潔, 馮淑萍, 顏健華 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 桂林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心